脑干损伤后神经轴突的病理学改变
脑干损伤后神经轴突的病理学改变
邓平 徐小虎 祝家镇 宋一璇 姚青松
摘 要 目的 探讨脑干损伤后神经轴突的病理学改变。 方法 11例尸检案例脑干标本，其中颅脑损伤组6例，非颅脑损伤组5例。常规脱水、石蜡包埋、切片，应用荧光免疫组织化学显示神经丝蛋白，荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察神经轴突在脑干损伤后的改变。 结果 正常脑干中的神经轴突粗细较均匀，内部结构连续性好，立体结构完整。而脑干损伤后，神经轴突出现不规则肿胀和断裂，起始段神经轴突有扭曲变细、横断及纵裂等改变。 结论 起始段神经轴突在脑干损伤后易发生病理改变。
关键词：创伤和损伤，脑干；轴突；显微镜检查，共焦
神经丝蛋白(neurofilament, NF)是神经元的结构蛋白之一，根据分子量可分为NF68、NF150和NF200。NF68组成神经丝的核心，NF150和NF200为“交联”蛋白，组成神经丝的侧臂[1]。神经轴突中有大量磷酸化和非磷酸化NF，在脑损伤后将发生改变[2]。激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)，已广泛应用于神经病理学的研究[3]。在形态学上，LSCM能对组织细胞进行分层扫描，得出一系列显示组织细胞内部结构的光学切片，并能对这些光学切片进行三维重建而显示组织细胞的立体结构。笔者采用荧光免疫组织化学显示人体脑干组织中的NF，应用荧光显微镜和LSCM观察神经轴突在脑干损伤后的改变。
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材料与方法
1. 材料：(1)主要仪器：荧光显微镜(Olympus BH-2型)；LSCM(Ultima-312型，ACAS系统)。(2)实验试剂：鼠抗人NF(Pan)(Max，1∶50)；FITC标记的绵羊抗鼠IgG(H+L)(北京华美，1∶40)；其他免疫组织化学常规试剂。(3)人体检材：11例脑干标本取自广州市公安局近年部分尸检案例。颅脑损伤组6例，均有明确头面部外伤史，排除疾病、中毒及颅脑以外脏器损伤致死等死因，常规检查无颅骨骨折，颅内无明显占位性病变，脑干有轻微水肿或点状出血，其他部位的脑组织损伤极轻微；非颅脑损伤组5例，无头面部外伤史，有明确的其他死因，常规检查脑组织无病理改变。
2. 方法：(1)标本处理：死亡后48 h内取出脑干，冠状切取中脑下丘平面、桥脑听结节平面及延髓橄榄中部平面等组织块，常规制成蜡块，连续切片(10 μm)。(2)荧光免疫组织化学染色：常规脱水、石蜡包埋、切片；微波抗原修复(在0.01 mol/L，pH为6.0的枸橼酸缓冲液中，用微波炉加热至95℃ 左右维持8～10 min)；PBS洗后正常绵羊血清孵育(室温，30 min)；抗NF抗体孵育(4℃过夜)；PBS洗后FITC标记的绵羊抗鼠血清孵育(37℃，30 min)；PBS洗后甘油缓冲液封片。阴性对照片用正常绵羊血清或PBS代替抗NF抗体或FITC标记的绵羊抗鼠血清。 (3)荧光显微镜及LSCM观察：染色后即在荧光显微镜下观察、拍照。LSCM观察步骤如下：①选择观察目标；②分层扫描：调节Z轴，选择激光全部波长，扫描厚度为0.5 μm，图像资料自动存入系统内；③三维立体重建：选择全部或部分分层扫描获得的图像进行三维重建，并旋转立体图像从不同角度观察；④图像资料的输出：使用照相机系统，对分层扫描及三维重建所获得的图像进行拍摄，并选择不同颜色给图像加上“伪彩”。
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结 果
1. 非颅脑损伤组：荧光显微镜下可见神经轴突粗细较均匀，除少数有弯曲现象外，未见不规则肿胀及断裂等改变(图1)。LSCM分层扫描见神经轴突内部结构连续性好；三维重建后可见起始段轴突立体结构完整，通过旋转从不同角度观察均未见明显病变(图2)。
图1 非颅脑损伤组：荧光显微镜下见神经轴突粗细较
均匀 免疫荧光染色 ×400
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图2 非颅脑损伤组：LSCM三维重建后可见起始段轴突立体结构完整
2. 颅脑损伤组：荧光显微镜下可见神经轴突有不规则肿胀及断裂等病理改变，起始段轴突扭曲、变细(图3)。LSCM分层扫描和三维重建后可见神经轴突除有不规则肿胀外，还有横断及纵裂等改变。不规则肿胀在轴突中线最为明显，且在不同光学切片上，肿胀的程度不同(图4)；而横断和纵裂主要位于起始段轴突，多为不完全性横断，达轴突横径的1/2左右(图5)，纵裂表现为轴突在其纵轴中线附近纵行裂开(图6)。通过旋转从不同角度观察，发现上述改变在某些角度最为明显，而在另一些角度不明显。
图3 颅脑损伤组：荧光显微镜下可见起始段轴突
扭曲、变细 免疫荧光染色 ×400
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图4 颅脑损伤组：LSCM分层扫描可见神经轴突有不规则肿胀
图5 颅脑损伤组：LSCM三维重建后可见起始段轴突不完全断裂
图6 颅脑损伤组：LSCM三维重建后可见起始段轴突有纵裂改变
讨 论
1. 脑干损伤后神经轴突的改变及其机制：目前，已有许多学者研究了脑损伤后神经轴突的改变。用免疫组织化学显示NF68，发现脑损伤后1～2 h神经轴突有局部肿胀及局灶性NF聚积，伤后6 h排列紊乱，72 h出现颗粒状聚积，肿胀明显，其后崩解[4]。NF150和NF200的免疫组织化学染色则显示，受损轴突中有大量磷酸化NF聚积，NF200在伤后3 h有大量脱失，且比NF68更为明显[2]。本研究中采用荧光免疫组织化学显示人体脑干中的NF，通过LSCM分层扫描和三维重建，从不同的光学切片和立体结构的不同角度观察神经轴突在脑干损伤后的改变，亦发现神经轴突有不规则肿胀及断裂。一般认为，外力作用可直接或间接引起神经轴突断裂或NF排列紊乱，使轴浆流动中断，导致NF在局部聚积[5]。此外，伤后NF的改变还可能与兴奋性毒作用[6]、Ca2+平衡失调以及Ca2+依赖性蛋白酶(calpains，CPS)的激活[2]等有关。其中，CPS的激活可能起重要作用。在正常情况下，轴突中有2种类型的CPS (μM型和mM型)[7]，NF之间的距离是由其侧臂的磷酸化状态决定的[1]。神经轴突受损后，轴膜的通透性增高，引起Ca2+内流，导致轴浆内的Ca2+浓度升高并激活μM型CPS，由于后者的底物为NF侧臂，结果NF侧臂降解，NF之间的距离缩短，表现为NF聚积[8，9]。mM型CPS也可能被激活，分解微管等结构蛋白[10]。两者均可引起轴浆流动的改变，导致轴突局部肿胀，轴浆中的细胞器聚积，最后致轴突断裂[9]。笔者还发现，脑干损伤后起始段神经轴突的改变尤为明显，表现为扭曲、变细、横断和纵裂等。笔者推测，这种改变可能是由外力直接作用使神经轴突受到牵拉、扭曲等所致，并且与起始段轴突本身的结构特点有关。正常情况下，起始段轴突较细，表面无髓鞘包裹，轴膜下有电子致密层，轴浆中无尼氏体，并且微管在此段聚集成小束，说明起始段神经轴突的组成成分和结构与轴丘和其他段轴突不同。这些特征有可能使其在外力作用下更容易受到损伤。
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2. 脑干损伤后神经轴突改变的病理学意义：NF作为神经轴突的结构蛋白，对神经元的正常功能具有重要作用：(1)起细胞骨架作用，维持细胞的正常形态；(2)参与细胞的物质转运和细胞运动；(3)参与神经元信息的传递；(4)与DNA的复制和转录等有关[1]。因此，当神经轴突发生病理改变时，神经元的功能将受到不同程度的影响。笔者发现，脑干损伤后神经轴突有不规则肿胀及断裂等病理改变。由于脑干中有生命中枢等重要结构，而且神经轴突的损伤可引起神经元胞体发生变性、坏死。因此，当脑干中的神经轴突出现上述病变时，可导致机体生命中枢功能障碍。值得指出的是，脑干损伤后起始段神经轴突的病理改变尤为明显。明确这种改变与其神经元功能障碍的关系将对阐明脑干损伤导致机体死亡的机制具有重要意义。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470766)
邓平(510182 广州医学院神经科学研究所)
, http://www.100md.com 徐小虎(汕头大学医学院法医研究所)
祝家镇(中山医科大学法医学系)
宋一璇(中山医科大学法医学系)
姚青松(广州市公安局刑事科学技术研究所)
参考文献
1，Lee MK, Cleveland DW. Neuronal intermediate filaments. Ann Rev Neurosci, 1996， 19: 187-217.
2，Posmantur RM, Kampfl A, Liu SJ, et al. Cytoskeletal derangements of cortical neuronal processes three hours after traumatic brain injury in rats: an immunofluorescence study. J Neuropathol Exp Neurol, 1996, 55: 68-80.
, http://www.100md.com
3，Murray JM. Neuropathology in depth: the role of confocal microscopy. J Neuropathol Exp Neurol, 1992, 51: 475-487.
4，Yaghmai A, Povlishock JT. Traumatically induced reactive change as visualized through the use of monoclonal antibodies targeted to neurofilament subunits. J Neuropathol Exp Neurol, 1992, 51: 158-176.
5，Povlishock JT. Traumatically induced axonal injury: pathogenesis and pathobiological implications. Brain Pathol, 1992, 2: 1-12.
, 百拇医药
6，Katayama Y, Becker DP, Tamura T, et al. Massive increases in extracellular potassium and indiscriminate release of glutamate following concussive brain injury. J Neurosurg, 1990, 73: 889-900.
7，Cottin P, Ponssard S, Georgescauld D, et al. Free calcium and calpain I activity. Biochem Biophys Acta, 1991, 1079: 139-145.
8，Ishizaki Y, Tashiro T, Kurokawa M. A calcium-activated protease which preferentially degrades the 16000 component of the neurofilament triplet. J Neurosci, 1994, 14: 3934-3938.
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9，Pettus EH, Povlishock JT. Characterization of a distinct set of intra-axonal ultrastructural changes associated with traumatically induced alteration in axolemmal permeability. Brain Res, 1996, 722: 1-11.
10，Maxwell WL, Wyatt C, Graham DI, et al. Ultrastructural evidence of axonal shearing as a result of lateral acceleration of the head in non-human primates. Acta Neuropathol, 1993, 85: 1-9., http://www.100md.com
邓平 徐小虎 祝家镇 宋一璇 姚青松
摘 要 目的 探讨脑干损伤后神经轴突的病理学改变。 方法 11例尸检案例脑干标本，其中颅脑损伤组6例，非颅脑损伤组5例。常规脱水、石蜡包埋、切片，应用荧光免疫组织化学显示神经丝蛋白，荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察神经轴突在脑干损伤后的改变。 结果 正常脑干中的神经轴突粗细较均匀，内部结构连续性好，立体结构完整。而脑干损伤后，神经轴突出现不规则肿胀和断裂，起始段神经轴突有扭曲变细、横断及纵裂等改变。 结论 起始段神经轴突在脑干损伤后易发生病理改变。
关键词：创伤和损伤，脑干；轴突；显微镜检查，共焦
神经丝蛋白(neurofilament, NF)是神经元的结构蛋白之一，根据分子量可分为NF68、NF150和NF200。NF68组成神经丝的核心，NF150和NF200为“交联”蛋白，组成神经丝的侧臂[1]。神经轴突中有大量磷酸化和非磷酸化NF，在脑损伤后将发生改变[2]。激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)，已广泛应用于神经病理学的研究[3]。在形态学上，LSCM能对组织细胞进行分层扫描，得出一系列显示组织细胞内部结构的光学切片，并能对这些光学切片进行三维重建而显示组织细胞的立体结构。笔者采用荧光免疫组织化学显示人体脑干组织中的NF，应用荧光显微镜和LSCM观察神经轴突在脑干损伤后的改变。
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材料与方法
1. 材料：(1)主要仪器：荧光显微镜(Olympus BH-2型)；LSCM(Ultima-312型，ACAS系统)。(2)实验试剂：鼠抗人NF(Pan)(Max，1∶50)；FITC标记的绵羊抗鼠IgG(H+L)(北京华美，1∶40)；其他免疫组织化学常规试剂。(3)人体检材：11例脑干标本取自广州市公安局近年部分尸检案例。颅脑损伤组6例，均有明确头面部外伤史，排除疾病、中毒及颅脑以外脏器损伤致死等死因，常规检查无颅骨骨折，颅内无明显占位性病变，脑干有轻微水肿或点状出血，其他部位的脑组织损伤极轻微；非颅脑损伤组5例，无头面部外伤史，有明确的其他死因，常规检查脑组织无病理改变。
2. 方法：(1)标本处理：死亡后48 h内取出脑干，冠状切取中脑下丘平面、桥脑听结节平面及延髓橄榄中部平面等组织块，常规制成蜡块，连续切片(10 μm)。(2)荧光免疫组织化学染色：常规脱水、石蜡包埋、切片；微波抗原修复(在0.01 mol/L，pH为6.0的枸橼酸缓冲液中，用微波炉加热至95℃ 左右维持8～10 min)；PBS洗后正常绵羊血清孵育(室温，30 min)；抗NF抗体孵育(4℃过夜)；PBS洗后FITC标记的绵羊抗鼠血清孵育(37℃，30 min)；PBS洗后甘油缓冲液封片。阴性对照片用正常绵羊血清或PBS代替抗NF抗体或FITC标记的绵羊抗鼠血清。 (3)荧光显微镜及LSCM观察：染色后即在荧光显微镜下观察、拍照。LSCM观察步骤如下：①选择观察目标；②分层扫描：调节Z轴，选择激光全部波长，扫描厚度为0.5 μm，图像资料自动存入系统内；③三维立体重建：选择全部或部分分层扫描获得的图像进行三维重建，并旋转立体图像从不同角度观察；④图像资料的输出：使用照相机系统，对分层扫描及三维重建所获得的图像进行拍摄，并选择不同颜色给图像加上“伪彩”。
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结 果
1. 非颅脑损伤组：荧光显微镜下可见神经轴突粗细较均匀，除少数有弯曲现象外，未见不规则肿胀及断裂等改变(图1)。LSCM分层扫描见神经轴突内部结构连续性好；三维重建后可见起始段轴突立体结构完整，通过旋转从不同角度观察均未见明显病变(图2)。
图1 非颅脑损伤组：荧光显微镜下见神经轴突粗细较
均匀 免疫荧光染色 ×400
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图2 非颅脑损伤组：LSCM三维重建后可见起始段轴突立体结构完整
2. 颅脑损伤组：荧光显微镜下可见神经轴突有不规则肿胀及断裂等病理改变，起始段轴突扭曲、变细(图3)。LSCM分层扫描和三维重建后可见神经轴突除有不规则肿胀外，还有横断及纵裂等改变。不规则肿胀在轴突中线最为明显，且在不同光学切片上，肿胀的程度不同(图4)；而横断和纵裂主要位于起始段轴突，多为不完全性横断，达轴突横径的1/2左右(图5)，纵裂表现为轴突在其纵轴中线附近纵行裂开(图6)。通过旋转从不同角度观察，发现上述改变在某些角度最为明显，而在另一些角度不明显。
图3 颅脑损伤组：荧光显微镜下可见起始段轴突
扭曲、变细 免疫荧光染色 ×400
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图4 颅脑损伤组：LSCM分层扫描可见神经轴突有不规则肿胀
图5 颅脑损伤组：LSCM三维重建后可见起始段轴突不完全断裂
图6 颅脑损伤组：LSCM三维重建后可见起始段轴突有纵裂改变
讨 论
1. 脑干损伤后神经轴突的改变及其机制：目前，已有许多学者研究了脑损伤后神经轴突的改变。用免疫组织化学显示NF68，发现脑损伤后1～2 h神经轴突有局部肿胀及局灶性NF聚积，伤后6 h排列紊乱，72 h出现颗粒状聚积，肿胀明显，其后崩解[4]。NF150和NF200的免疫组织化学染色则显示，受损轴突中有大量磷酸化NF聚积，NF200在伤后3 h有大量脱失，且比NF68更为明显[2]。本研究中采用荧光免疫组织化学显示人体脑干中的NF，通过LSCM分层扫描和三维重建，从不同的光学切片和立体结构的不同角度观察神经轴突在脑干损伤后的改变，亦发现神经轴突有不规则肿胀及断裂。一般认为，外力作用可直接或间接引起神经轴突断裂或NF排列紊乱，使轴浆流动中断，导致NF在局部聚积[5]。此外，伤后NF的改变还可能与兴奋性毒作用[6]、Ca2+平衡失调以及Ca2+依赖性蛋白酶(calpains，CPS)的激活[2]等有关。其中，CPS的激活可能起重要作用。在正常情况下，轴突中有2种类型的CPS (μM型和mM型)[7]，NF之间的距离是由其侧臂的磷酸化状态决定的[1]。神经轴突受损后，轴膜的通透性增高，引起Ca2+内流，导致轴浆内的Ca2+浓度升高并激活μM型CPS，由于后者的底物为NF侧臂，结果NF侧臂降解，NF之间的距离缩短，表现为NF聚积[8，9]。mM型CPS也可能被激活，分解微管等结构蛋白[10]。两者均可引起轴浆流动的改变，导致轴突局部肿胀，轴浆中的细胞器聚积，最后致轴突断裂[9]。笔者还发现，脑干损伤后起始段神经轴突的改变尤为明显，表现为扭曲、变细、横断和纵裂等。笔者推测，这种改变可能是由外力直接作用使神经轴突受到牵拉、扭曲等所致，并且与起始段轴突本身的结构特点有关。正常情况下，起始段轴突较细，表面无髓鞘包裹，轴膜下有电子致密层，轴浆中无尼氏体，并且微管在此段聚集成小束，说明起始段神经轴突的组成成分和结构与轴丘和其他段轴突不同。这些特征有可能使其在外力作用下更容易受到损伤。
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2. 脑干损伤后神经轴突改变的病理学意义：NF作为神经轴突的结构蛋白，对神经元的正常功能具有重要作用：(1)起细胞骨架作用，维持细胞的正常形态；(2)参与细胞的物质转运和细胞运动；(3)参与神经元信息的传递；(4)与DNA的复制和转录等有关[1]。因此，当神经轴突发生病理改变时，神经元的功能将受到不同程度的影响。笔者发现，脑干损伤后神经轴突有不规则肿胀及断裂等病理改变。由于脑干中有生命中枢等重要结构，而且神经轴突的损伤可引起神经元胞体发生变性、坏死。因此，当脑干中的神经轴突出现上述病变时，可导致机体生命中枢功能障碍。值得指出的是，脑干损伤后起始段神经轴突的病理改变尤为明显。明确这种改变与其神经元功能障碍的关系将对阐明脑干损伤导致机体死亡的机制具有重要意义。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470766)
邓平(510182 广州医学院神经科学研究所)
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祝家镇(中山医科大学法医学系)
宋一璇(中山医科大学法医学系)
姚青松(广州市公安局刑事科学技术研究所)
参考文献
1，Lee MK, Cleveland DW. Neuronal intermediate filaments. Ann Rev Neurosci, 1996， 19: 187-217.
2，Posmantur RM, Kampfl A, Liu SJ, et al. Cytoskeletal derangements of cortical neuronal processes three hours after traumatic brain injury in rats: an immunofluorescence study. J Neuropathol Exp Neurol, 1996, 55: 68-80.
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3，Murray JM. Neuropathology in depth: the role of confocal microscopy. J Neuropathol Exp Neurol, 1992, 51: 475-487.
4，Yaghmai A, Povlishock JT. Traumatically induced reactive change as visualized through the use of monoclonal antibodies targeted to neurofilament subunits. J Neuropathol Exp Neurol, 1992, 51: 158-176.
5，Povlishock JT. Traumatically induced axonal injury: pathogenesis and pathobiological implications. Brain Pathol, 1992, 2: 1-12.
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7，Cottin P, Ponssard S, Georgescauld D, et al. Free calcium and calpain I activity. Biochem Biophys Acta, 1991, 1079: 139-145.
8，Ishizaki Y, Tashiro T, Kurokawa M. A calcium-activated protease which preferentially degrades the 16000 component of the neurofilament triplet. J Neurosci, 1994, 14: 3934-3938.
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9，Pettus EH, Povlishock JT. Characterization of a distinct set of intra-axonal ultrastructural changes associated with traumatically induced alteration in axolemmal permeability. Brain Res, 1996, 722: 1-11.
10，Maxwell WL, Wyatt C, Graham DI, et al. Ultrastructural evidence of axonal shearing as a result of lateral acceleration of the head in non-human primates. Acta Neuropathol, 1993, 85: 1-9., http://www.100md.com