多发性骨髓瘤生物学及诊疗进展
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CSCO 2000年第四届学术年会
张凤春
关键词：多发性骨髓瘤；B淋巴细胞克隆性肿瘤；生物学进展；诊断；治疗
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是B淋巴细胞克隆性肿瘤性增生疾病。
一. MM生物学进展
1. 恶性细胞的来源
(1)免疫基因型
恶性细胞产生单克隆Ig---基因---恶性细胞的分子标志。
Ig特异性取决于可变区基因重排及可变区内与抗原直接结合的互补决定区(CDRs)的核酸突变-它使抗体抗原结合得更加紧密。
, 百拇医药
多发性骨髓瘤具有如下特点：
① CDRs具有明显的突变(8%)，此突变仅出现在抗原刺激终末分化B细胞、提示恶性细胞的生成与抗原刺激有关。
② 病人间VH基因无明显变异。在病程中无克隆演变，这与其他起源于生发中心早期分化阶段的B细胞肿瘤不同，提示恶性变发生在B细胞非常晚期的分化阶段。
(2)免疫表型
表：恶性浆细胞的表面抗原
标志
特 征
CD10
少数MM细胞表达，平均25%(10-60%)，表达此抗原的瘤细胞恶性度低，但现在认为所有恶性细胞都有少量表达，与疾病进展有关，进展期病人血中有CD10表达的肿瘤细胞。
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CD19,CD20
极少表达，数量与预后成反比。
CD28，CD86(CD28配基)
与进展期疾病有关。
CD38
大多数，但不是全部，恶性细胞表达。而CD38(-) 恶性细胞可能代表更不成熟、更具增生活性的恶性细胞。
CD56
在MGUS和浆细胞白血病阴性，高表达与预后不良有关。
CD95(Fas抗原 )
不表达与突变有关，意义未明。
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3.HHV-8感染与MM
(1) HHV-8在卡波氏肉瘤中发现了一种疱疹病毒家族的新成员一卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)，又称HHV-8。在卡波氏肉瘤患者血液中，凡具有巨噬细胞和树突状细胞标志的细胞上皆有HHV-8的表达，几乎一半患者外周血B细胞发现该病毒的DNA。此病毒还可存在于原发浆膜腔的淋巴瘤和多中心的Castleman病。该病毒包含IL-6同系化合物、而这三种疾病均以IL-6作为生长因子。
(2)HHV-8与MM关系
1997年Rettig等[2]和Saic等[3]利用PCR和原位杂交(FISH)的方法，在MM患者长期培养的骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)和骨髓活检标本中检出KSHV-DNA序列，阳性率高达100%。(15/15)，85%(17/20)，MGUS中的阳性率为25%(5/20)，而且发现KSHV只感染BMSCs而不感染骨髓瘤细胞。KSHV编码IL—6同源物刺激鼠和人MM细胞生长抑制其凋亡。提示HHV-8可能通过感染BMSCs改变骨髓微环境，表达病毒基因产物(vIL-6)刺激和维持MM细胞生长和存活。
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另外一些有病毒感染证据的MM临床表现为复发或化疗耐药，无病毒的患者则多为经VAD方案或自体外周血干细胞移植治疗后完全缓解。提示病毒感染与临床结果有关。
2. 骨髓微环境和MM
骨髓微环境主要包括BMSCs，基质蛋白，多种细胞因子以及支配神经和血管系统。微环境在MM的发病机制中扮有重要角色。
2.1 粘附分子
2、2 微环境与骨质破坏
双磷酸盐能阻断这种恶性循环，此效应可被bCL-2蛋白过度表达所阻断。
2、3 微环境与MM化疗耐药：
MM细胞表面CD40与CD40L结合-----bCL-2表达------MM细胞耐药性。
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局部高浓度IL-6---活化STAT-3途径----bCL-XL表达----诱导多药耐药(MDR)表型，MM细胞通过β1整合素粘附于纤维连接蛋白，上凋P27(周期依赖性激酶抑制因子)--MM细胞于G1期---细胞粘附介导的药物耐药(CAM—DR)，如对阿霉素和马法兰耐药。
化疗本身通过活化MDR细胞NF-KB---bCL-2表达----耐药产生。
2、4 IL-6，IL-15和MM细胞生长存活。
IL-6是多功能细胞因子，诱导B细胞分化刺激人MM细胞及IL-6依赖细胞株的增殖。IL-6活化RAS依赖的MAPKL(Mitogcn-activatecl Protein Kinase)级联信号途径刺激MM细胞生长，活化JAK-STAT途径维持MM细胞生存。MM细胞表面高表达CD38和其配体CD31(血小板内皮细胞粘附分子)，CD31与 CD38 结合激化NF-KB。RAS和NF-KB活化不仅诱导MM细胞增殖，而且也能促进前血管形成因子分泌，IL-6的来源途径有：
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1)触发细胞表面 CD40活化NF-KB自分泌IL—6。
2)MM细胞粘附于BMSCs刺激BMSCS旁分泌IL-6。
3)可能来自感染BMSCs的KSHV编码的VIL-6，IL-15与IL-6一样也是多功能细胞因子，IL-15能诱导人T、B淋巴细胞NK细胞，中性粒细胞增殖，促进细胞生存。阻断IL-15增加MM细胞自发凋亡的比例。3)IL-15能代替IL-6促进MM细胞生存，能够降低对FAS诱导凋亡的反应性，以及对细胞毒药如VCR和ADM治疗的反应性，但对地塞米松无影响。研究结果表明IL-15是促进MM细胞生存的重要细胞因子之一，IL-15为一新发现的作用于MM细胞的生长因子，将有可能成为未来治疗MM的新靶标。
3、细胞遗传学改变
细胞遗传学异常是MM重要的特征，而且也是MM重要的预后因素之一，13染色体部分或完全缺失以及11号染色体长臂(11q)异常，提示MM预后较差，14q32IgH位点MM染色体易位最常累及，细胞遗传学技术如FISH已显示有74%的病例，存在14q32IgH位点重排，发现有多个与14q32易位的伙伴染色体(Partner Chromosome)其中最常见的有三个：1)t(11，14)(q13，q32)，与CychinD1，2)t(4，14)(p16,q32)与纤细母细胞生长因子受体3基因(FGFR3)异位表达有关，3)t(14，16)(q3，q23)，与癌基因C-maf适度表达有关。
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从细胞遗传学角度，MM是一组异质性疾病，包括不同的分子亚型，因此治疗上要针对每一典型，可能为MM治疗开辟新的途径。
二 、MM 诊断进展
MM的诊断标准：骨髓瘤细胞>10%,或活检证实浆细胞瘤,含有一下任何一项：
1. 血清M蛋白>3g/DL，2. 尿中发现M-蛋白，3. 溶骨损害。必须除外转移瘤，结缔组织病，淋巴瘤或慢性感染，1 .M-蛋白的检测
血清M-蛋白>3g/DL作为MM诊断的最低标准，近几年重视血清轻链κ、λ的含量及κ/λ比值的测定，κ/λ比例不平衡，反映单克隆成分增高及多克隆Ig减少。
2.骨髓浆细胞
骨髓浆细胞至少10-15%，骨髓活检可提供更为精确的诊断依据。
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浆细胞形态也很重要，例如核-浆发育不平衡，核异常(多核浆细胞)，浆细胞大小的变异，对诊断均有价值。
3.应进行全面的骨X线检查
X线检查、骨扫描、CT及MRI有助于提高检出率，4.其他诊断技术
(1) 浆细胞标记指数(PCLL)：增高提示患者为MM或即将转化为MM。有助于与MGUS，SMM鉴别，MM组的LI均值为1%，而MGUS，SMM为0.1%。
(2) 外周检出单克隆浆细胞：80%有症状MM病人可检出外周血浆细胞，复发或难治MM病人约有90%可检出，而MGUS或SMM一般未能检出单克隆浆细胞。
(3) 骨髓瘤细胞免疫表型：骨髓瘤浆细胞CD56及CD38高表达，MGUS及反应性浆细胞增多症不表达或弱表达。
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(4) 细胞遗传学异常： MM患者非整倍体染色体发生率占80-90%，(5) 分子遗传学技术：骨髓瘤细胞有特异性免疫球蛋白基因重排，作为B细胞系恶性增生性疾病的诊断标记。
三、MM治疗进展
1常规剂量化疗(Conventional dose chemotherapy)
马法兰(MEL).环磷酰胺(CTX).糖皮质激素是治疗最有效的化疗药物，经典的MP方案
M2方案
ECOG[4]进行Ⅲ期临床随机比较VBMCP方案和MP方案，发现，VBMCP在缓解率，缓解持续时间方面比MP更有效(72%/51% p< 0.001, 24/18月 P=0.001)，五年生存率也明显优于MP，但总的生存期(OS)两者之间未见明显差异(P=0.30)。
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VAD方案持续静脉滴注可使新诊断MM患者获得55-84%的反应率，方案为1.VCR 0.4mg/d
ADM 9mg/m2.d-经中央静脉导管持续输注4天，Dex 20mg/m2.d po 从第1、9、17天连续口服4天，2. VAD持续静输方案改良为快速静脉输注
(VCR 0.4mg/d ,ADM 9mg/m2.d各加入0.9%NaCl
100ml静点30分钟,Dex用法不变)治疗139例患者，可评估134 例中经3-4个疗程诱导化疗，62%PR，5%CR，而毒副反应较传统VAD方案更小，建议作为初治MM的一线方案[3]。
MM细胞表达MDR，尤其是化疗后MDR高表达，表现为多药耐药，或难治性MM，主要分为原发耐药和继发耐药，可能的耐药方式[5、6、7、8]，1)P-糖蛋白药物转运泵。2)肺耐药相关蛋白(LRP)。3)细胞粘附介导的药物耐受(GAM-DR)。4)bcl-2表达上调，。IDA[9]对P-gP不敏感，能诱导骨髓瘤细胞株和MDR细胞株凋亡，与DNR和ADM无交叉耐药，可作为治疗MM尤其是难治性MM药物。CEVAD方案，治疗难治性MM，具体方案如下：VP16 50mg/m2d1-4,CTX 1000mg/ m2d 6+VAD,GM-CSF 250mg m2d7,直至ANC>2.0×108/L。最近报道治疗36例难治性MM，无CR，PR仅为42%(15/36)，不优于VAD。
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2、大剂量化疗(High-dose Chemotherapy和干细胞移植(Stem cell transplant)HDM 140mg/ m2能克服对低剂量马法兰的耐药性，能使20-30%病人获得CR(M蛋白消失)，初治病人治疗相关死亡率约10%,而在复治病人超过20%，ASCT 加快了大剂量化疗后造血和免疫功能重建，非对照研究显示[1]：新诊断MM患者联合应用常规诱导化疗和大剂量化疗后ASCT产生30-35%CR率，并能延长生存期。前瞻性随机对照研究证实大剂量化疗后ABMT较常规化疗(VMCP/VBAP)显著提高缓解率(84%/57%CR22%/5%,p<0.001)，5年无事件生存率(Efs)和5年总体生存率(OS)，而治疗相关死亡率两组相似。近年来越来越多的人倾向于把大剂量化疗后ASCT作为新诊断MM患者(年龄<65岁)的第一线治疗方案， Palarb等报道[15]MEL100加ASCT治疗中位年龄64岁MM患者缓解率EFS，OS均明显优于标准化疗组，表达大剂量化疗ASCT也适用于年龄较大患者。
, 百拇医药 到目前为止，给人印象最深的是t总体治疗(Total therapy)方案[16]，该治疗为非交叉耐药，诱导方案诱导化疗，然后给予两次自体移植(Total therapy transplant)，IFN维持治疗直到复发。具体方案如下：
1、 VAD×3(d1-24)于第35天开始下一疗程，如2个疗程后肿瘤减少75%，再予大剂量环磷酰胺(HDCTX)
2、 HDCTX：6g/ m2分5个剂量，每3小时予1-2g/m2,加Mesna3.6g/m2 24小时持续点滴×1加GM-CSF250mg/ m2收集外周血干细胞和骨髓(PBSC和BMM)
3 EDAP：VP16 100mg/ m2d1-4 CIV
Dex 40mg/ m2 d1-5 PO
, 百拇医药 Are-C 1g/ m2 d5 CIV
Cisplatin 25mg/ m2 d1-4 CIV
GM-CSF 250mg/ m2 d6 S、C直至血象恢复。
第一次移植: MEL 100mg/ m2 d-3,d-2
PBSC ±ABMT在d0输入，于d1+予以
GM- CSF 250mg/ m2 S、C直至血象恢复。
第二次移植：于Tx-1 3～6个月后
如Tx-1获得>PR时，重复MEL 200mg/ m2
分5-6次，d-3,d-2,d-1,PBSC±ABMT在d0,GM-CSF250mg/ m2
在d+1直至血象恢复。
维持治疗：
于Tx-2移植后WBC>1.5×109/L可予IFN-α2b 3Mu/ m2 S,C.TIW直至复发。
231例新诊断病人最新结果显示，移植后CR/PR率26%/75%，二次移植后CR/PR率为38%/81%，中位EFS42个月，OS 65个月，中位CR持续时间54个月。对连续两次ASCT预后较好的因素经多变量回归分析显示：1)无不利核型改变(13，11染色体正常)2)、β2-M 2.15mg/L,CRP<4mg/L LDH<170U/L)初次治疗距移植 <12个月4)化疗敏感(移植前肿瘤总量减少50%。5)诱导后6个月内获得CR。
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目前大剂量化疗和ASCT尚存一些问题主要表现为：
2、二次移植是否优于单次移植？
3. 自体移植物净化问题
PBSC更常用于ASCT。PBSCT与ABMT相比易植入造血重建快，肿瘤细胞污染率低。PBSCT后再生不良时间缩短，输血要求减少，而PBSCT和ABMT后复发率并未见明显差异[19]。Lacasse等[23]报道MM细胞表面有SLT-IR(CD71),而CD34+干细胞缺乏此受体，用SLT-1净化G-CSF动员的PBSC移植物有清除超过3个对数级的克隆性MM细胞而对造血祖细胞无毒性损伤，推测SLT-1净化自身干细胞移植均可能改善病人的生存率。但目前尚无大系列随机试给证实净化PBSCT优于未净化PBSCT。认为体内残存的瘤细胞是移植后复发的原因所在而不是自身移植物污染的结果。
, 百拇医药
2、3 异基因骨髓移植
allo-BMT治疗相关死亡率(TRM)明显高于ASCT，多家临床研究报道TRM在35%-57%,中位OS18-28个月, EBMT回顾性分析178例MM患者，接受ASCT组OS明显长于allo-BMT(34/18月)，但这种生存优势仅见于男性。移植后1年仍存活者allo-BMT组似比ASCT组具有更长的EFS和OS。allo-BMT在MM治疗中的角色仍待于随机试验证实。
此外，近年国外推出骨髓非清除性造血干细胞移植的新方法[29]，即通过相对较低的放化疗剂量进行非清除性预处理，产生免疫耐受，使移植物植入导致移植物和宿主间的双向免疫耐受，形成混合嵌合体。因其预处理毒性较低，感染出血机会减少，排斥和GVHD较轻。因此对年龄较大，体质较差，不能耐受传统标准剂量者，非清除性干细胞不失为一安全可靠的方法，已有用于MM患者的治疗，值得临床推广
, 百拇医药 3. 免疫治疗和其它
3.1 IFN-α维持治疗。
IFN-α早已应用于MM治疗，几项随机试验的结论不一致，有关ASCT后IFN-α维持治疗试验的，Cuhninghan等[34]报道的随机试验，中位随访52个月表明：IFN维持治疗组中位EFS明显优于对照组(40/27 P<0.0025)，OS在IFN组也明显延找，但在随访77个月后，这种生存优势消失。对CR患者能获得较长的EFS，但OS无明显差异，因此ASCT后IFN维持治疗未证明对病人有明显益处。需更多的大规模随机试验确认IFN在治疗MM患者MRD中的地位。
3、2供者T淋巴细胞输注(DLI)
allo-BMT后获得持续分子水平缓解和低复发率得益于移植物抗骨髓瘤效应(GVM)[35]。一项新近报道用DLI治疗allo-BMT后复发患者重新获得缓解。证实了GVM存在[36、37]。
, 百拇医药
建议对MM病人开始 T细胞量≥1.0×108/kg
若无反应或GVAD 输注剂量到5.0×108/kg，若仍未出现反 可用IL-2和IFN-α来增强GVAD 供者T淋巴细胞转染自杀基因病毒的胸苷激酶(TL)或输注纯化的异基因免疫细胞有助于控制GVAD保留GVM效应[39、40]。
Alegea等给40例allo-BMT复发血液肿瘤患者输注体外去除CD8+细胞供者淋巴细胞，TRM为3%，6例MM病人5例获得缓解。48%反应患者未出现GVHD临床表现，表明可能为肿瘤抗原参与GVM反应。据此GVM的出现不一定依赖于GVHD，但介导GVM与GVAD的T细胞亚群尚未完全弄清。
3、3独特型蛋白和树突状细胞疫苗治疗
Ig基因重排产生单克隆Ig是恶性克隆特异，其可变区上的独特型可作为肿瘤特异性抗原，研究证实[41、42、43]①MM和MUGS病人体内存在抗独特型抗原反应性CD4和CD8Tcell ,②独特型蛋白联合GM-CSF免疫患者诱导产生MHC-I型限制性CD8和CD4特异性T细胞反应。
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树突状细胞(DC)是“职业”抗原递呈细胞，DC通过MHC-I抗原多肽复合物。在适当的共刺激信号辅助下激活T淋巴细胞，启动免疫反应。培养的DC能有效地递呈可溶性抗原。Cull等采用MM患者自身独特型蛋白刺激的DC联合GM-CSF免疫进展期难治性MM患者，均出现T细胞增殖性反应，并产生IFN-γ。1例病人检测到抗独特型IgM，但未能证实存在独特型特异性CTL反应。1例患者免疫期间MM蛋白水平上升减慢，另1例MM蛋白水平无变化。临床治疗难治性MM反应差可能与下列因素有关：1、免疫麻痹2、T细胞质和量缺乏3、不能诱导有效的细胞免疫。因此独特型刺激的DC治疗难治性MM值得怀疑。但用于干细胞移植后消除MRD可能是一种有效的治疗手段。临床上用于ASCT后进一步减少MRD是可行的。应进一步研究：1、树突状细胞的来源和制备。2、体外抗原刺激DC的有效扩增方法。3、诱导具有明显临床意义的特异的细胞免疫反应方法。
2、 其他治疗方法
4、1 Tamoxifen[46]
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最近发现MM细胞表达雌激素受体，抗雌激素药物能下调IL-6和gP130抑制MM细胞增殖。Tamoxifen(抗雌激素药)能诱导MM细胞株和骨髓瘤病人MM细胞凋亡，抑制MM细胞增殖的药物浓度与临床上试用大剂量口服Tamoxifen联合细胞毒药物如长春花碱和柔红霉素治疗其他癌的浓度相似，临床上应用Tamoxifen治疗雌激素受体阳性的乳腺癌患者的经验，提示应进行用Tamoxifen抗雌激素治疗MM的临床试验。比如在ASCT移植后或联合常规化疗治疗不适于移植的患者。
4、2反应停(Thalidomide)[4]
Thalidomide抑制血管形成.
Thalidomide抗MM作用机制包括：
1、 改变MM细胞粘附分子表达。
, 百拇医药 2、 抑制IFN-α产生，增加IL-1产生。
3、 直接刺激CTL增强细胞介导的免疫反应。
4、 增加CD8+和CD4+淋巴细胞数量，及可溶性IL-2R水平，诱导TH2抑制TH1细胞因子产生。
Seemasinghae等新近单用Thalidomide 治疗84例难治性MM(76例为大剂量化疗后复发)，Thalidomide开始200 mg/d每两周增加200 mg/d直至达800 mg/d，中位治疗时间80天(2到465天)，10%病人获得CR或近CR，总反应率为32%，副反应主要为轻或中度便秘，疲乏，嗜睡。随访2个月，EFS为22±5%，OS为58±5%。研究发现反应患者骨髓微血管密度无明显减小，具体原因需进一步研究，Thalidomide抗肿瘤活性提示Thalidomide可能为一理想的与化疗联合治疗MM的药物。
4.3全反式维甲酸(ATRA)
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最初的研究认为ATRA下调IL-6R2表达，抑制骨髓瘤细胞生长,认为维甲酸适用血清IL-6含量升高的病人。
最近研究表明[48]ATRA抑制MM细胞株生长不是通过下调IL-6R2，而是上调P21WAF1表达，导致视网腊母细胞瘤蛋白(PRB)去磷酸化，使MM细胞停止于G期，不能过渡到S期，增殖受抑。
4.4抗-HM1.24抗体：
HM1.24是新发现的浆细胞特异抗原，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，分子量29到33KD，选择性表达于终未分化的正常和肿瘤性B细胞上，因此HM1.24是MM免疫治疗的理想靶分子。研究证实人抗HM1.24 MoAb在效应细胞(PBMCS)存在条件下介导对MM细胞株和MM肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性反应(ADCC)，能有效杀灭MM细胞。
人抗HM1.24 MoAb免疫治疗还存在以下优点：
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① MM细胞主要定位于骨髓，容易与MoAb接触。
② 血清中无可溶性HM1.24抗原，不会阻断人抗HM1.24 MoAb与瘤细胞结合。
③ 人抗HM1.24 MoAb无诱发人补体活性作用，不会引起严重副作用。
④ MM病人B细胞功能短暂受抑，可能不产生抗体，即人抗HM1.24 MoAb免疫原性低，注入体内疗效会较持久。因此人抗HM1.24 MoAb将是很有希望的免疫治疗MM的新方法。
另尚有应用Clarithromycin(大环内酯类抗生素)治疗MM[51、52]，疗效报道不一。
MM细胞可被ganciclovir杀死导致诱生肿瘤消退。
其他基因治疗还有转导GM-CSF基因至MM细胞增强其免疫原性作为疫苗免疫治疗MM，逆转录病毒转染B7-1基因诱导MM细胞表达B7-1分子产生肿瘤特异CTL反应等[53、54]。
作者单位：白求恩医科大学第三临床学院(中日联谊医院)血液·肿瘤科, 百拇医药
关键词：多发性骨髓瘤；B淋巴细胞克隆性肿瘤；生物学进展；诊断；治疗
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是B淋巴细胞克隆性肿瘤性增生疾病。
一. MM生物学进展
1. 恶性细胞的来源
(1)免疫基因型
恶性细胞产生单克隆Ig---基因---恶性细胞的分子标志。
Ig特异性取决于可变区基因重排及可变区内与抗原直接结合的互补决定区(CDRs)的核酸突变-它使抗体抗原结合得更加紧密。
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多发性骨髓瘤具有如下特点：
① CDRs具有明显的突变(8%)，此突变仅出现在抗原刺激终末分化B细胞、提示恶性细胞的生成与抗原刺激有关。
② 病人间VH基因无明显变异。在病程中无克隆演变，这与其他起源于生发中心早期分化阶段的B细胞肿瘤不同，提示恶性变发生在B细胞非常晚期的分化阶段。
(2)免疫表型
表：恶性浆细胞的表面抗原
标志
特 征
CD10
少数MM细胞表达，平均25%(10-60%)，表达此抗原的瘤细胞恶性度低，但现在认为所有恶性细胞都有少量表达，与疾病进展有关，进展期病人血中有CD10表达的肿瘤细胞。
, 百拇医药
CD19,CD20
极少表达，数量与预后成反比。
CD28，CD86(CD28配基)
与进展期疾病有关。
CD38
大多数，但不是全部，恶性细胞表达。而CD38(-) 恶性细胞可能代表更不成熟、更具增生活性的恶性细胞。
CD56
在MGUS和浆细胞白血病阴性，高表达与预后不良有关。
CD95(Fas抗原 )
不表达与突变有关，意义未明。
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3.HHV-8感染与MM
(1) HHV-8在卡波氏肉瘤中发现了一种疱疹病毒家族的新成员一卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)，又称HHV-8。在卡波氏肉瘤患者血液中，凡具有巨噬细胞和树突状细胞标志的细胞上皆有HHV-8的表达，几乎一半患者外周血B细胞发现该病毒的DNA。此病毒还可存在于原发浆膜腔的淋巴瘤和多中心的Castleman病。该病毒包含IL-6同系化合物、而这三种疾病均以IL-6作为生长因子。
(2)HHV-8与MM关系
1997年Rettig等[2]和Saic等[3]利用PCR和原位杂交(FISH)的方法，在MM患者长期培养的骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)和骨髓活检标本中检出KSHV-DNA序列，阳性率高达100%。(15/15)，85%(17/20)，MGUS中的阳性率为25%(5/20)，而且发现KSHV只感染BMSCs而不感染骨髓瘤细胞。KSHV编码IL—6同源物刺激鼠和人MM细胞生长抑制其凋亡。提示HHV-8可能通过感染BMSCs改变骨髓微环境，表达病毒基因产物(vIL-6)刺激和维持MM细胞生长和存活。
, 百拇医药
另外一些有病毒感染证据的MM临床表现为复发或化疗耐药，无病毒的患者则多为经VAD方案或自体外周血干细胞移植治疗后完全缓解。提示病毒感染与临床结果有关。
2. 骨髓微环境和MM
骨髓微环境主要包括BMSCs，基质蛋白，多种细胞因子以及支配神经和血管系统。微环境在MM的发病机制中扮有重要角色。
2.1 粘附分子
2、2 微环境与骨质破坏
双磷酸盐能阻断这种恶性循环，此效应可被bCL-2蛋白过度表达所阻断。
2、3 微环境与MM化疗耐药：
MM细胞表面CD40与CD40L结合-----bCL-2表达------MM细胞耐药性。
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局部高浓度IL-6---活化STAT-3途径----bCL-XL表达----诱导多药耐药(MDR)表型，MM细胞通过β1整合素粘附于纤维连接蛋白，上凋P27(周期依赖性激酶抑制因子)--MM细胞于G1期---细胞粘附介导的药物耐药(CAM—DR)，如对阿霉素和马法兰耐药。
化疗本身通过活化MDR细胞NF-KB---bCL-2表达----耐药产生。
2、4 IL-6，IL-15和MM细胞生长存活。
IL-6是多功能细胞因子，诱导B细胞分化刺激人MM细胞及IL-6依赖细胞株的增殖。IL-6活化RAS依赖的MAPKL(Mitogcn-activatecl Protein Kinase)级联信号途径刺激MM细胞生长，活化JAK-STAT途径维持MM细胞生存。MM细胞表面高表达CD38和其配体CD31(血小板内皮细胞粘附分子)，CD31与 CD38 结合激化NF-KB。RAS和NF-KB活化不仅诱导MM细胞增殖，而且也能促进前血管形成因子分泌，IL-6的来源途径有：
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1)触发细胞表面 CD40活化NF-KB自分泌IL—6。
2)MM细胞粘附于BMSCs刺激BMSCS旁分泌IL-6。
3)可能来自感染BMSCs的KSHV编码的VIL-6，IL-15与IL-6一样也是多功能细胞因子，IL-15能诱导人T、B淋巴细胞NK细胞，中性粒细胞增殖，促进细胞生存。阻断IL-15增加MM细胞自发凋亡的比例。3)IL-15能代替IL-6促进MM细胞生存，能够降低对FAS诱导凋亡的反应性，以及对细胞毒药如VCR和ADM治疗的反应性，但对地塞米松无影响。研究结果表明IL-15是促进MM细胞生存的重要细胞因子之一，IL-15为一新发现的作用于MM细胞的生长因子，将有可能成为未来治疗MM的新靶标。
3、细胞遗传学改变
细胞遗传学异常是MM重要的特征，而且也是MM重要的预后因素之一，13染色体部分或完全缺失以及11号染色体长臂(11q)异常，提示MM预后较差，14q32IgH位点MM染色体易位最常累及，细胞遗传学技术如FISH已显示有74%的病例，存在14q32IgH位点重排，发现有多个与14q32易位的伙伴染色体(Partner Chromosome)其中最常见的有三个：1)t(11，14)(q13，q32)，与CychinD1，2)t(4，14)(p16,q32)与纤细母细胞生长因子受体3基因(FGFR3)异位表达有关，3)t(14，16)(q3，q23)，与癌基因C-maf适度表达有关。
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从细胞遗传学角度，MM是一组异质性疾病，包括不同的分子亚型，因此治疗上要针对每一典型，可能为MM治疗开辟新的途径。
二 、MM 诊断进展
MM的诊断标准：骨髓瘤细胞>10%,或活检证实浆细胞瘤,含有一下任何一项：
1. 血清M蛋白>3g/DL，2. 尿中发现M-蛋白，3. 溶骨损害。必须除外转移瘤，结缔组织病，淋巴瘤或慢性感染，1 .M-蛋白的检测
血清M-蛋白>3g/DL作为MM诊断的最低标准，近几年重视血清轻链κ、λ的含量及κ/λ比值的测定，κ/λ比例不平衡，反映单克隆成分增高及多克隆Ig减少。
2.骨髓浆细胞
骨髓浆细胞至少10-15%，骨髓活检可提供更为精确的诊断依据。
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浆细胞形态也很重要，例如核-浆发育不平衡，核异常(多核浆细胞)，浆细胞大小的变异，对诊断均有价值。
3.应进行全面的骨X线检查
X线检查、骨扫描、CT及MRI有助于提高检出率，4.其他诊断技术
(1) 浆细胞标记指数(PCLL)：增高提示患者为MM或即将转化为MM。有助于与MGUS，SMM鉴别，MM组的LI均值为1%，而MGUS，SMM为0.1%。
(2) 外周检出单克隆浆细胞：80%有症状MM病人可检出外周血浆细胞，复发或难治MM病人约有90%可检出，而MGUS或SMM一般未能检出单克隆浆细胞。
(3) 骨髓瘤细胞免疫表型：骨髓瘤浆细胞CD56及CD38高表达，MGUS及反应性浆细胞增多症不表达或弱表达。
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(4) 细胞遗传学异常： MM患者非整倍体染色体发生率占80-90%，(5) 分子遗传学技术：骨髓瘤细胞有特异性免疫球蛋白基因重排，作为B细胞系恶性增生性疾病的诊断标记。
三、MM治疗进展
1常规剂量化疗(Conventional dose chemotherapy)
马法兰(MEL).环磷酰胺(CTX).糖皮质激素是治疗最有效的化疗药物，经典的MP方案
M2方案
ECOG[4]进行Ⅲ期临床随机比较VBMCP方案和MP方案，发现，VBMCP在缓解率，缓解持续时间方面比MP更有效(72%/51% p< 0.001, 24/18月 P=0.001)，五年生存率也明显优于MP，但总的生存期(OS)两者之间未见明显差异(P=0.30)。
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VAD方案持续静脉滴注可使新诊断MM患者获得55-84%的反应率，方案为1.VCR 0.4mg/d
ADM 9mg/m2.d-经中央静脉导管持续输注4天，Dex 20mg/m2.d po 从第1、9、17天连续口服4天，2. VAD持续静输方案改良为快速静脉输注
(VCR 0.4mg/d ,ADM 9mg/m2.d各加入0.9%NaCl
100ml静点30分钟,Dex用法不变)治疗139例患者，可评估134 例中经3-4个疗程诱导化疗，62%PR，5%CR，而毒副反应较传统VAD方案更小，建议作为初治MM的一线方案[3]。
MM细胞表达MDR，尤其是化疗后MDR高表达，表现为多药耐药，或难治性MM，主要分为原发耐药和继发耐药，可能的耐药方式[5、6、7、8]，1)P-糖蛋白药物转运泵。2)肺耐药相关蛋白(LRP)。3)细胞粘附介导的药物耐受(GAM-DR)。4)bcl-2表达上调，。IDA[9]对P-gP不敏感，能诱导骨髓瘤细胞株和MDR细胞株凋亡，与DNR和ADM无交叉耐药，可作为治疗MM尤其是难治性MM药物。CEVAD方案，治疗难治性MM，具体方案如下：VP16 50mg/m2d1-4,CTX 1000mg/ m2d 6+VAD,GM-CSF 250mg m2d7,直至ANC>2.0×108/L。最近报道治疗36例难治性MM，无CR，PR仅为42%(15/36)，不优于VAD。
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2、大剂量化疗(High-dose Chemotherapy和干细胞移植(Stem cell transplant)HDM 140mg/ m2能克服对低剂量马法兰的耐药性，能使20-30%病人获得CR(M蛋白消失)，初治病人治疗相关死亡率约10%,而在复治病人超过20%，ASCT 加快了大剂量化疗后造血和免疫功能重建，非对照研究显示[1]：新诊断MM患者联合应用常规诱导化疗和大剂量化疗后ASCT产生30-35%CR率，并能延长生存期。前瞻性随机对照研究证实大剂量化疗后ABMT较常规化疗(VMCP/VBAP)显著提高缓解率(84%/57%CR22%/5%,p<0.001)，5年无事件生存率(Efs)和5年总体生存率(OS)，而治疗相关死亡率两组相似。近年来越来越多的人倾向于把大剂量化疗后ASCT作为新诊断MM患者(年龄<65岁)的第一线治疗方案， Palarb等报道[15]MEL100加ASCT治疗中位年龄64岁MM患者缓解率EFS，OS均明显优于标准化疗组，表达大剂量化疗ASCT也适用于年龄较大患者。
, 百拇医药 到目前为止，给人印象最深的是t总体治疗(Total therapy)方案[16]，该治疗为非交叉耐药，诱导方案诱导化疗，然后给予两次自体移植(Total therapy transplant)，IFN维持治疗直到复发。具体方案如下：
1、 VAD×3(d1-24)于第35天开始下一疗程，如2个疗程后肿瘤减少75%，再予大剂量环磷酰胺(HDCTX)
2、 HDCTX：6g/ m2分5个剂量，每3小时予1-2g/m2,加Mesna3.6g/m2 24小时持续点滴×1加GM-CSF250mg/ m2收集外周血干细胞和骨髓(PBSC和BMM)
3 EDAP：VP16 100mg/ m2d1-4 CIV
Dex 40mg/ m2 d1-5 PO
, 百拇医药 Are-C 1g/ m2 d5 CIV
Cisplatin 25mg/ m2 d1-4 CIV
GM-CSF 250mg/ m2 d6 S、C直至血象恢复。
第一次移植: MEL 100mg/ m2 d-3,d-2
PBSC ±ABMT在d0输入，于d1+予以
GM- CSF 250mg/ m2 S、C直至血象恢复。
第二次移植：于Tx-1 3～6个月后
如Tx-1获得>PR时，重复MEL 200mg/ m2
分5-6次，d-3,d-2,d-1,PBSC±ABMT在d0,GM-CSF250mg/ m2
在d+1直至血象恢复。
维持治疗：
于Tx-2移植后WBC>1.5×109/L可予IFN-α2b 3Mu/ m2 S,C.TIW直至复发。
231例新诊断病人最新结果显示，移植后CR/PR率26%/75%，二次移植后CR/PR率为38%/81%，中位EFS42个月，OS 65个月，中位CR持续时间54个月。对连续两次ASCT预后较好的因素经多变量回归分析显示：1)无不利核型改变(13，11染色体正常)2)、β2-M 2.15mg/L,CRP<4mg/L LDH<170U/L)初次治疗距移植 <12个月4)化疗敏感(移植前肿瘤总量减少50%。5)诱导后6个月内获得CR。
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目前大剂量化疗和ASCT尚存一些问题主要表现为：
2、二次移植是否优于单次移植？
3. 自体移植物净化问题
PBSC更常用于ASCT。PBSCT与ABMT相比易植入造血重建快，肿瘤细胞污染率低。PBSCT后再生不良时间缩短，输血要求减少，而PBSCT和ABMT后复发率并未见明显差异[19]。Lacasse等[23]报道MM细胞表面有SLT-IR(CD71),而CD34+干细胞缺乏此受体，用SLT-1净化G-CSF动员的PBSC移植物有清除超过3个对数级的克隆性MM细胞而对造血祖细胞无毒性损伤，推测SLT-1净化自身干细胞移植均可能改善病人的生存率。但目前尚无大系列随机试给证实净化PBSCT优于未净化PBSCT。认为体内残存的瘤细胞是移植后复发的原因所在而不是自身移植物污染的结果。
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2、3 异基因骨髓移植
allo-BMT治疗相关死亡率(TRM)明显高于ASCT，多家临床研究报道TRM在35%-57%,中位OS18-28个月, EBMT回顾性分析178例MM患者，接受ASCT组OS明显长于allo-BMT(34/18月)，但这种生存优势仅见于男性。移植后1年仍存活者allo-BMT组似比ASCT组具有更长的EFS和OS。allo-BMT在MM治疗中的角色仍待于随机试验证实。
此外，近年国外推出骨髓非清除性造血干细胞移植的新方法[29]，即通过相对较低的放化疗剂量进行非清除性预处理，产生免疫耐受，使移植物植入导致移植物和宿主间的双向免疫耐受，形成混合嵌合体。因其预处理毒性较低，感染出血机会减少，排斥和GVHD较轻。因此对年龄较大，体质较差，不能耐受传统标准剂量者，非清除性干细胞不失为一安全可靠的方法，已有用于MM患者的治疗，值得临床推广
, 百拇医药 3. 免疫治疗和其它
3.1 IFN-α维持治疗。
IFN-α早已应用于MM治疗，几项随机试验的结论不一致，有关ASCT后IFN-α维持治疗试验的，Cuhninghan等[34]报道的随机试验，中位随访52个月表明：IFN维持治疗组中位EFS明显优于对照组(40/27 P<0.0025)，OS在IFN组也明显延找，但在随访77个月后，这种生存优势消失。对CR患者能获得较长的EFS，但OS无明显差异，因此ASCT后IFN维持治疗未证明对病人有明显益处。需更多的大规模随机试验确认IFN在治疗MM患者MRD中的地位。
3、2供者T淋巴细胞输注(DLI)
allo-BMT后获得持续分子水平缓解和低复发率得益于移植物抗骨髓瘤效应(GVM)[35]。一项新近报道用DLI治疗allo-BMT后复发患者重新获得缓解。证实了GVM存在[36、37]。
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建议对MM病人开始 T细胞量≥1.0×108/kg
若无反应或GVAD 输注剂量到5.0×108/kg，若仍未出现反 可用IL-2和IFN-α来增强GVAD 供者T淋巴细胞转染自杀基因病毒的胸苷激酶(TL)或输注纯化的异基因免疫细胞有助于控制GVAD保留GVM效应[39、40]。
Alegea等给40例allo-BMT复发血液肿瘤患者输注体外去除CD8+细胞供者淋巴细胞，TRM为3%，6例MM病人5例获得缓解。48%反应患者未出现GVHD临床表现，表明可能为肿瘤抗原参与GVM反应。据此GVM的出现不一定依赖于GVHD，但介导GVM与GVAD的T细胞亚群尚未完全弄清。
3、3独特型蛋白和树突状细胞疫苗治疗
Ig基因重排产生单克隆Ig是恶性克隆特异，其可变区上的独特型可作为肿瘤特异性抗原，研究证实[41、42、43]①MM和MUGS病人体内存在抗独特型抗原反应性CD4和CD8Tcell ,②独特型蛋白联合GM-CSF免疫患者诱导产生MHC-I型限制性CD8和CD4特异性T细胞反应。
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树突状细胞(DC)是“职业”抗原递呈细胞，DC通过MHC-I抗原多肽复合物。在适当的共刺激信号辅助下激活T淋巴细胞，启动免疫反应。培养的DC能有效地递呈可溶性抗原。Cull等采用MM患者自身独特型蛋白刺激的DC联合GM-CSF免疫进展期难治性MM患者，均出现T细胞增殖性反应，并产生IFN-γ。1例病人检测到抗独特型IgM，但未能证实存在独特型特异性CTL反应。1例患者免疫期间MM蛋白水平上升减慢，另1例MM蛋白水平无变化。临床治疗难治性MM反应差可能与下列因素有关：1、免疫麻痹2、T细胞质和量缺乏3、不能诱导有效的细胞免疫。因此独特型刺激的DC治疗难治性MM值得怀疑。但用于干细胞移植后消除MRD可能是一种有效的治疗手段。临床上用于ASCT后进一步减少MRD是可行的。应进一步研究：1、树突状细胞的来源和制备。2、体外抗原刺激DC的有效扩增方法。3、诱导具有明显临床意义的特异的细胞免疫反应方法。
2、 其他治疗方法
4、1 Tamoxifen[46]
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最近发现MM细胞表达雌激素受体，抗雌激素药物能下调IL-6和gP130抑制MM细胞增殖。Tamoxifen(抗雌激素药)能诱导MM细胞株和骨髓瘤病人MM细胞凋亡，抑制MM细胞增殖的药物浓度与临床上试用大剂量口服Tamoxifen联合细胞毒药物如长春花碱和柔红霉素治疗其他癌的浓度相似，临床上应用Tamoxifen治疗雌激素受体阳性的乳腺癌患者的经验，提示应进行用Tamoxifen抗雌激素治疗MM的临床试验。比如在ASCT移植后或联合常规化疗治疗不适于移植的患者。
4、2反应停(Thalidomide)[4]
Thalidomide抑制血管形成.
Thalidomide抗MM作用机制包括：
1、 改变MM细胞粘附分子表达。
, 百拇医药 2、 抑制IFN-α产生，增加IL-1产生。
3、 直接刺激CTL增强细胞介导的免疫反应。
4、 增加CD8+和CD4+淋巴细胞数量，及可溶性IL-2R水平，诱导TH2抑制TH1细胞因子产生。
Seemasinghae等新近单用Thalidomide 治疗84例难治性MM(76例为大剂量化疗后复发)，Thalidomide开始200 mg/d每两周增加200 mg/d直至达800 mg/d，中位治疗时间80天(2到465天)，10%病人获得CR或近CR，总反应率为32%，副反应主要为轻或中度便秘，疲乏，嗜睡。随访2个月，EFS为22±5%，OS为58±5%。研究发现反应患者骨髓微血管密度无明显减小，具体原因需进一步研究，Thalidomide抗肿瘤活性提示Thalidomide可能为一理想的与化疗联合治疗MM的药物。
4.3全反式维甲酸(ATRA)
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最初的研究认为ATRA下调IL-6R2表达，抑制骨髓瘤细胞生长,认为维甲酸适用血清IL-6含量升高的病人。
最近研究表明[48]ATRA抑制MM细胞株生长不是通过下调IL-6R2，而是上调P21WAF1表达，导致视网腊母细胞瘤蛋白(PRB)去磷酸化，使MM细胞停止于G期，不能过渡到S期，增殖受抑。
4.4抗-HM1.24抗体：
HM1.24是新发现的浆细胞特异抗原，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，分子量29到33KD，选择性表达于终未分化的正常和肿瘤性B细胞上，因此HM1.24是MM免疫治疗的理想靶分子。研究证实人抗HM1.24 MoAb在效应细胞(PBMCS)存在条件下介导对MM细胞株和MM肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性反应(ADCC)，能有效杀灭MM细胞。
人抗HM1.24 MoAb免疫治疗还存在以下优点：
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① MM细胞主要定位于骨髓，容易与MoAb接触。
② 血清中无可溶性HM1.24抗原，不会阻断人抗HM1.24 MoAb与瘤细胞结合。
③ 人抗HM1.24 MoAb无诱发人补体活性作用，不会引起严重副作用。
④ MM病人B细胞功能短暂受抑，可能不产生抗体，即人抗HM1.24 MoAb免疫原性低，注入体内疗效会较持久。因此人抗HM1.24 MoAb将是很有希望的免疫治疗MM的新方法。
另尚有应用Clarithromycin(大环内酯类抗生素)治疗MM[51、52]，疗效报道不一。
MM细胞可被ganciclovir杀死导致诱生肿瘤消退。
其他基因治疗还有转导GM-CSF基因至MM细胞增强其免疫原性作为疫苗免疫治疗MM，逆转录病毒转染B7-1基因诱导MM细胞表达B7-1分子产生肿瘤特异CTL反应等[53、54]。
作者单位：白求恩医科大学第三临床学院(中日联谊医院)血液·肿瘤科, 百拇医药