石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4基因改变的检测
谷丽君 崔全才 陈杰 李理 刘彤华
摘 要 目的 研究石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4基因的改变。方法 用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)银染技术检测46例石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4基因的缺失和突变。结果 DPC4基因第1、2、3、4、8和11外显子的纯合性缺失率为13/46(28.3%)，具体分布为1例在第11外显子；1例在第1、11外显子；1例在第2、3外显子；1例在第3、8外显子；1例在第1、2、8外显子；1例在第2、4、11外显子；1例在第3、4、11外显子；3例在第3、4、8外显子；1例在第2、3、4、8外显子；1例在第2、3、8、11外显子；1例在第2、3、4、8、11外显子。基因突变率为10/46(21.7%)，分布于DPC4基因的第1外显子1例、第2外显子1例、第8外显子有3例、第11外显子4例、第4、11外显子1例。石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4基因的总改变率为21/46(45.6%)。结论 DPC4作为一种抑癌基因，其改变在胰腺癌的形成中可能起重要作用。
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关键词：胰腺肿瘤；基因，抑制，肿瘤；DNA突变分析
胰腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤，5年生存率不足1%。研究证实胰腺癌的发生发展伴随许多基因改变，如Ki-ras、P53、P16和新近报道的DPC4基因[1]。我们以常规甲醛固定、石蜡包埋的胰腺癌及癌旁正常胰腺组织为材料，用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)银染技术检测DPC4基因的缺失和突变情况，以期了解其在胰腺癌中的可能作用机制。
材料与方法
1.标本来源：46例石蜡包埋胰腺癌(39例腺癌、5例粘液腺癌、1例腺鳞癌、1例多形性癌)及癌旁胰腺组织为我科1995～1998年经Whipple手术切除标本。
2.DNA的提取及模板DNA鉴定：46例石蜡包埋胰腺癌及癌旁正常胰腺组织分别以2种方法提取2组DNA。方法(1)常规酚/氯仿抽提法，方法(2)参照文献[2]的方法A。对2种方法所提石蜡包埋组织DNA行紫外分光光度计法定量测定和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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3.PCR：对Ki-ras 基因(内参照) 第1外显子和DPC4基因的第1、2、3、4、8、11外显子分别进行双重PCR反应。以正常成人外周血白细胞基因组DNA为PCR的阳性对照。25 μl反应体系中含：1×PCR缓冲液、4 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、100 pmol/L引物、2 U Taq酶(Sangon公司)，500 ng模板。循环设置为：94℃预变性3 min，94℃ 30 s，退火60 s、72℃ 90 s，45个循环，最后72℃延伸10 min。PCR所用引物由CyberSyn公司合成，Ki-ras序列参见文献[3]、DPC4第11外显子序列见文献[4]、余见文献[5]。
4.SSCP[6]：以正常成人外周血白细胞基因组DNA为SSCP的阴性对照，检测DPC4基因PCR阳性病例。取10 μl的PCR产物加等量甲酰胺变性缓冲液，100℃变性10 min后，迅速置冰上5 min，上样，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶亚甲双丙烯酰胺=39∶1)、4℃、恒压80 V、电泳12 h，10%乙醇和0.5%冰乙酸溶液固定凝胶1 h，0.2%硝酸银溶液避光染色30 min，1.5%氢氧化钠和0.4%甲醛溶液显色至凝胶上条带清晰，最后置10%冰乙酸溶液中定影，进行SSCP分析并照相。
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5.统计学方法：χ2检验。
结果
1.模板DNA的鉴定结果：方法(2)所提组织DNA长度均大于500 bp，方法(1)所提46例配对组织DNA长度有3例小于500 bp，2例DNA量过少。再对2组DNA进行DPC4基因第2外显子(530 bp)和内参照Ki-ras第1外显子(115 bp) PCR共扩增，结果2组DNA的Ki-ras扩增阳性率均为100%；DPC4扩增阳性率分别为78.3%、87.0% (P>0.05)，但方法(1)PCR产量较方法(2)低，需要将第1轮产物稀释100倍后，作为第2轮的模板继续扩增。故我们以方法(2)所提DNA为PCR-SSCP的模板。
2.DPC4基因纯合性缺失的检测结果：13例胰腺癌未扩增出DPC4条带，具体分布为1例在第11外显子；1例在第1、11外显子；1例在第2、3外显子；1例在第3、8外显子；1例在第1、2、8外显子；1例在第2、4、11外显子；1例在第3、4、11外显子；3例在第3、4、8外显子；1例在第2、3、4、8外显子；1例在第2、3、8、11外显子；1例在第2、3、4、8、11外显子。而用作对照的癌旁胰腺组织均扩增出目的DNA产物，从而判定DPC4第1、2、3、4、8和11外显子的纯合性缺失率为28.3% (13/46)(图1)。
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M：pBR322/Hinf I 标记物；C：阴性对照；
W：阳性对照(正常成人外周血白细胞DNA)；
T、N：同一病例的胰腺癌组织及癌旁正常胰腺组织
图1 DPC4基因第3外显子与Ki-ras基因PCR共扩增结果
3.DPC4基因突变的检测结果：10例胰腺癌见异常泳动带，分布为第1外显子1例；第2外显子1例；第8外显子有3例(图2)；第11外显子4例；第4、11外显子1例。基因突变率为21.7% (10/46)。而用作对照的癌旁胰腺组织均未见异常泳动带，所有PCR-SSCP实验重复3次，结果一致。
W：阴性对照(正常成人外周血白细胞DNA)；
T、N：同一病例的胰腺癌组织和癌旁正常胰腺组织；ssDNA：单链DNA；
, 百拇医药
dsDNA：残存的双链DNA；→所示为异常泳动带
图2 PCR-SSCP银染检测DPC4基因第8外显子突变结果
4.DPC4基因改变与临床病理资料关系：DPC4基因改变与胰腺癌细胞分化程度密切相关，中、低分化癌组与高分化癌组差异有非常显著性意义(P<0.01)，而中、低分化癌组间差异无显著性意义(P>0.05)。DPC4基因改变与胰腺癌患者性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型、周围组织浸润、转移情况差异无显著性意义(P>0.05)。详见表1。
表1 DPC4基因改变与胰腺癌患者临床病理资料的关系
分析指标
样本数
DPC4
, http://www.100md.com
基因改
变例数
χ2值
P值
胰腺癌组织
46
21
27.211
<0.01
癌旁组织
46
0
性别
, http://www.100md.com
男
32
15
0.063
>0.05
女
14
6
年龄(岁)
<40
2
2
40-49
, http://www.100md.com 9
4
0.461
>0.05
50-59
14
7
0.889
>0.05
60-70
17
6
>70
, http://www.100md.com 4
2
肿瘤部位
胰头
32
15
0.063
>0.05
胰体尾
全胰
8
4
分化程度
6
, http://www.100md.com
2
高分化
11
1
7.789*
<0.01*
中分化
25
15
0.002**
>0.05**
低分化
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组织类型
10
5
腺癌
39
18
0.146
>0.05
粘液腺癌
5
2
, 百拇医药
腺鳞癌
1
1
多形性癌
1
0
周围组织浸润
无
3
1
0.025
>0.05
有
43
, http://www.100md.com
20
转移情况
无
21
10
0.060
>0.05
有
25
11
*高分化组与中、低分化组比较 **中分化组与低分化组比较
讨论
, 百拇医药
1996年初Kern小组首次报道了他们鉴定的DPC4基因，该基因具有2 680 bp转录单位，编码552个氨基酸序列，有11个外显子，10个内含子。其蛋白序列与黑腹果蝇(Drosophila)的Mad基因具有高度相似性，是转化生长因子β(TGF-β)的超家族成员，推测DPC4的功能可能是在TGF-β受体介导的信号传导环路中作为一种转录因子，其基因缺失、突变导致细胞过度增殖与生长[7]。目前发现DPC4基因改变亦存在于人结肠直肠癌[8]、胆管癌[5]等。
本实验显示石蜡包埋胰腺癌组织的DPC4基因第1、2、3、4、8和11外显子的纯合性缺失率为28.3%，基因突变率为21.74%，总改变率为45.6%(21/46)(有2例缺失和突变同时存在)，略低于Hahn等[9]、Schutte等[10]报道50%的胰腺癌有DPC4基因改变。原因可能是(1) PCR反应失败所致假阴性。以固定石蜡包埋组织为材料作PCR成功与否取决于组织制作过程中使用的固定剂；固定持续时间；石蜡块保存时间；要扩增的DNA片段长度[11]。(2) 原发性肿瘤标本中存在间质细胞和炎性细胞，致PCR出现假阴性。(3) PCR-SSCP技术虽是一种高效、简便的基因筛查方法，但因它受一系列条件影响(如电泳温度、甘油浓度、丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺浓度、缓冲液浓度等)，在不同系统中突变检出率为70%～95%[12]，可能漏检一些突变。尽管如此，我们的实验DPC4异常率达45.6%，提示 DPC4作为一种抑癌基因，其改变对胰腺癌的发生发展可能起重要作用。
, 百拇医药
比较DPC4基因改变结果与临床病理资料，可见(1) DPC4基因改变与胰腺癌细胞分化程度密切相关，中、低分化癌组与高分化癌组差异有显著性意义，而中、低分化癌组间差异无显著性意义。(2) DPC4基因改变与胰腺癌患者性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型、周围组织浸润、转移情况差异无显著性意义。
我们采用2种方法提取石蜡包埋组织DNA，结果与Frank等[2]报道基本一致。表明方法(2)即蛋白酶K中无去污剂和EDTA，不用酚/氯仿抽提，蛋白酶K煮沸灭活后直接行PCR，是一种简单、有效的提取石蜡包埋组织DNA方法，尤其对于长度较大的基因片段进行PCR时优于传统的酚/氯仿抽提法。
基金项目：国家杰出青年基金(39625012)；国家教委跨世纪优秀人才计划基金资助项目
作者单位：崔全才(100730 中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院病理科)
, 百拇医药
陈杰(100730 中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院病理科)
李理(100730 中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院病理科)
刘彤华(100730 中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院病理科)
谷丽君(现在大连医科大学附属第一医院妇科)
通信作者：陈杰(Email:chen J@csc.pumch.ac.cn)
参考文献
[1]Claire O′Brien. New tumor suppressor found in pancreatic cancer. Science,1996,271:294.
, http://www.100md.com
[2]Frank TS，Svoboda-Newman SM，His ED. Comparison of methods for extracting DNA from formalin-fixed paraffin sections for nonisotopic PCR. Diagn Mol Pathol，1996，5: 220-224.
[3]Banerjee SK ,Makdisi WF，Weston AP,et al. A two-step enriched-nested PCR technique enhances sensitivity for detection of codon 12 Ki-ras mutations in pancreatic adenocarcionma. Pancreas，1997,15: 16-24.
[4]Hahn SA，Bartsch D，Schroers A，et al. Mutations of the DPC4/Smad4 gene in biliary tract carcinoma. Cancer Res,1998,58:1124-1126.
, 百拇医药
[5]Moskaluk CA，Hruban RH，Schutte M，et al. Genomic Sequencing of DPC4 in the analysis of familial pancreatic carcinoma. Diagn Mol Pathol,1997,6:85-90.
[6]Orita M，Iwahana H，Kanazawa H，et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86: 2766-2770.
[7]Hunt KK,Fleming JB，Abramian A，et al.Overexpression of the tumor suppressor gene Smad4/DPC4 Induces p21waf1 expression and growth inhibition in human carcinoma cells. Cancer Res，1998,58: 5656-5661.
, 百拇医药
[8]Takagi Y,Futamura M,Kida H,et al. Somatic alterations of the DPC4 gene in human colorectal cancers in vivo. Gastroenterology，1996,111:1369-1372.
[9]Hahn SA，Hoque AT，Moskaluk CA，et al. Homozygous deletion map at 18q21.1 in pancreatic cancer. Cancer Res,1996,56:490-494.
[10]Schutte M，Hruban R，Hedrick L，et al. DPC4 gene in various tumor types. Cancer Res,1996,56:2527-2530.
[11]Dieffenbach CW，Dveksler GS. PCR技术实验指南. 黄培堂译.北京：科学出版社，1998. 65.
[12]Fan E，Levin DB，Glickman BW，et al. Limitations in the use of SSCP analysis. Mutant Res ,1993，288:85-92., 百拇医药
摘 要 目的 研究石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4基因的改变。方法 用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)银染技术检测46例石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4基因的缺失和突变。结果 DPC4基因第1、2、3、4、8和11外显子的纯合性缺失率为13/46(28.3%)，具体分布为1例在第11外显子；1例在第1、11外显子；1例在第2、3外显子；1例在第3、8外显子；1例在第1、2、8外显子；1例在第2、4、11外显子；1例在第3、4、11外显子；3例在第3、4、8外显子；1例在第2、3、4、8外显子；1例在第2、3、8、11外显子；1例在第2、3、4、8、11外显子。基因突变率为10/46(21.7%)，分布于DPC4基因的第1外显子1例、第2外显子1例、第8外显子有3例、第11外显子4例、第4、11外显子1例。石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4基因的总改变率为21/46(45.6%)。结论 DPC4作为一种抑癌基因，其改变在胰腺癌的形成中可能起重要作用。
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关键词：胰腺肿瘤；基因，抑制，肿瘤；DNA突变分析
胰腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤，5年生存率不足1%。研究证实胰腺癌的发生发展伴随许多基因改变，如Ki-ras、P53、P16和新近报道的DPC4基因[1]。我们以常规甲醛固定、石蜡包埋的胰腺癌及癌旁正常胰腺组织为材料，用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)银染技术检测DPC4基因的缺失和突变情况，以期了解其在胰腺癌中的可能作用机制。
材料与方法
1.标本来源：46例石蜡包埋胰腺癌(39例腺癌、5例粘液腺癌、1例腺鳞癌、1例多形性癌)及癌旁胰腺组织为我科1995～1998年经Whipple手术切除标本。
2.DNA的提取及模板DNA鉴定：46例石蜡包埋胰腺癌及癌旁正常胰腺组织分别以2种方法提取2组DNA。方法(1)常规酚/氯仿抽提法，方法(2)参照文献[2]的方法A。对2种方法所提石蜡包埋组织DNA行紫外分光光度计法定量测定和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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3.PCR：对Ki-ras 基因(内参照) 第1外显子和DPC4基因的第1、2、3、4、8、11外显子分别进行双重PCR反应。以正常成人外周血白细胞基因组DNA为PCR的阳性对照。25 μl反应体系中含：1×PCR缓冲液、4 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、100 pmol/L引物、2 U Taq酶(Sangon公司)，500 ng模板。循环设置为：94℃预变性3 min，94℃ 30 s，退火60 s、72℃ 90 s，45个循环，最后72℃延伸10 min。PCR所用引物由CyberSyn公司合成，Ki-ras序列参见文献[3]、DPC4第11外显子序列见文献[4]、余见文献[5]。
4.SSCP[6]：以正常成人外周血白细胞基因组DNA为SSCP的阴性对照，检测DPC4基因PCR阳性病例。取10 μl的PCR产物加等量甲酰胺变性缓冲液，100℃变性10 min后，迅速置冰上5 min，上样，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶亚甲双丙烯酰胺=39∶1)、4℃、恒压80 V、电泳12 h，10%乙醇和0.5%冰乙酸溶液固定凝胶1 h，0.2%硝酸银溶液避光染色30 min，1.5%氢氧化钠和0.4%甲醛溶液显色至凝胶上条带清晰，最后置10%冰乙酸溶液中定影，进行SSCP分析并照相。
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5.统计学方法：χ2检验。
结果
1.模板DNA的鉴定结果：方法(2)所提组织DNA长度均大于500 bp，方法(1)所提46例配对组织DNA长度有3例小于500 bp，2例DNA量过少。再对2组DNA进行DPC4基因第2外显子(530 bp)和内参照Ki-ras第1外显子(115 bp) PCR共扩增，结果2组DNA的Ki-ras扩增阳性率均为100%；DPC4扩增阳性率分别为78.3%、87.0% (P>0.05)，但方法(1)PCR产量较方法(2)低，需要将第1轮产物稀释100倍后，作为第2轮的模板继续扩增。故我们以方法(2)所提DNA为PCR-SSCP的模板。
2.DPC4基因纯合性缺失的检测结果：13例胰腺癌未扩增出DPC4条带，具体分布为1例在第11外显子；1例在第1、11外显子；1例在第2、3外显子；1例在第3、8外显子；1例在第1、2、8外显子；1例在第2、4、11外显子；1例在第3、4、11外显子；3例在第3、4、8外显子；1例在第2、3、4、8外显子；1例在第2、3、8、11外显子；1例在第2、3、4、8、11外显子。而用作对照的癌旁胰腺组织均扩增出目的DNA产物，从而判定DPC4第1、2、3、4、8和11外显子的纯合性缺失率为28.3% (13/46)(图1)。
, 百拇医药
M：pBR322/Hinf I 标记物；C：阴性对照；
W：阳性对照(正常成人外周血白细胞DNA)；
T、N：同一病例的胰腺癌组织及癌旁正常胰腺组织
图1 DPC4基因第3外显子与Ki-ras基因PCR共扩增结果
3.DPC4基因突变的检测结果：10例胰腺癌见异常泳动带，分布为第1外显子1例；第2外显子1例；第8外显子有3例(图2)；第11外显子4例；第4、11外显子1例。基因突变率为21.7% (10/46)。而用作对照的癌旁胰腺组织均未见异常泳动带，所有PCR-SSCP实验重复3次，结果一致。
W：阴性对照(正常成人外周血白细胞DNA)；
T、N：同一病例的胰腺癌组织和癌旁正常胰腺组织；ssDNA：单链DNA；
, 百拇医药
dsDNA：残存的双链DNA；→所示为异常泳动带
图2 PCR-SSCP银染检测DPC4基因第8外显子突变结果
4.DPC4基因改变与临床病理资料关系：DPC4基因改变与胰腺癌细胞分化程度密切相关，中、低分化癌组与高分化癌组差异有非常显著性意义(P<0.01)，而中、低分化癌组间差异无显著性意义(P>0.05)。DPC4基因改变与胰腺癌患者性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型、周围组织浸润、转移情况差异无显著性意义(P>0.05)。详见表1。
表1 DPC4基因改变与胰腺癌患者临床病理资料的关系
分析指标
样本数
DPC4
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基因改
变例数
χ2值
P值
胰腺癌组织
46
21
27.211
<0.01
癌旁组织
46
0
性别
, http://www.100md.com
男
32
15
0.063
>0.05
女
14
6
年龄(岁)
<40
2
2
40-49
, http://www.100md.com 9
4
0.461
>0.05
50-59
14
7
0.889
>0.05
60-70
17
6
>70
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2
肿瘤部位
胰头
32
15
0.063
>0.05
胰体尾
全胰
8
4
分化程度
6
, http://www.100md.com
2
高分化
11
1
7.789*
<0.01*
中分化
25
15
0.002**
>0.05**
低分化
, 百拇医药
组织类型
10
5
腺癌
39
18
0.146
>0.05
粘液腺癌
5
2
, 百拇医药
腺鳞癌
1
1
多形性癌
1
0
周围组织浸润
无
3
1
0.025
>0.05
有
43
, http://www.100md.com
20
转移情况
无
21
10
0.060
>0.05
有
25
11
*高分化组与中、低分化组比较 **中分化组与低分化组比较
讨论
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1996年初Kern小组首次报道了他们鉴定的DPC4基因，该基因具有2 680 bp转录单位，编码552个氨基酸序列，有11个外显子，10个内含子。其蛋白序列与黑腹果蝇(Drosophila)的Mad基因具有高度相似性，是转化生长因子β(TGF-β)的超家族成员，推测DPC4的功能可能是在TGF-β受体介导的信号传导环路中作为一种转录因子，其基因缺失、突变导致细胞过度增殖与生长[7]。目前发现DPC4基因改变亦存在于人结肠直肠癌[8]、胆管癌[5]等。
本实验显示石蜡包埋胰腺癌组织的DPC4基因第1、2、3、4、8和11外显子的纯合性缺失率为28.3%，基因突变率为21.74%，总改变率为45.6%(21/46)(有2例缺失和突变同时存在)，略低于Hahn等[9]、Schutte等[10]报道50%的胰腺癌有DPC4基因改变。原因可能是(1) PCR反应失败所致假阴性。以固定石蜡包埋组织为材料作PCR成功与否取决于组织制作过程中使用的固定剂；固定持续时间；石蜡块保存时间；要扩增的DNA片段长度[11]。(2) 原发性肿瘤标本中存在间质细胞和炎性细胞，致PCR出现假阴性。(3) PCR-SSCP技术虽是一种高效、简便的基因筛查方法，但因它受一系列条件影响(如电泳温度、甘油浓度、丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺浓度、缓冲液浓度等)，在不同系统中突变检出率为70%～95%[12]，可能漏检一些突变。尽管如此，我们的实验DPC4异常率达45.6%，提示 DPC4作为一种抑癌基因，其改变对胰腺癌的发生发展可能起重要作用。
, 百拇医药
比较DPC4基因改变结果与临床病理资料，可见(1) DPC4基因改变与胰腺癌细胞分化程度密切相关，中、低分化癌组与高分化癌组差异有显著性意义，而中、低分化癌组间差异无显著性意义。(2) DPC4基因改变与胰腺癌患者性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型、周围组织浸润、转移情况差异无显著性意义。
我们采用2种方法提取石蜡包埋组织DNA，结果与Frank等[2]报道基本一致。表明方法(2)即蛋白酶K中无去污剂和EDTA，不用酚/氯仿抽提，蛋白酶K煮沸灭活后直接行PCR，是一种简单、有效的提取石蜡包埋组织DNA方法，尤其对于长度较大的基因片段进行PCR时优于传统的酚/氯仿抽提法。
基金项目：国家杰出青年基金(39625012)；国家教委跨世纪优秀人才计划基金资助项目
作者单位：崔全才(100730 中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院病理科)
, 百拇医药
陈杰(100730 中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院病理科)
李理(100730 中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院病理科)
刘彤华(100730 中国医学科学院，中国协和医科大学北京协和医院病理科)
谷丽君(现在大连医科大学附属第一医院妇科)
通信作者：陈杰(Email:chen J@csc.pumch.ac.cn)
参考文献
[1]Claire O′Brien. New tumor suppressor found in pancreatic cancer. Science,1996,271:294.
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