红色毛癣菌和须癣毛癣菌的PCR指纹分析
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中华皮肤科杂志 2000年第33卷第5期
红色毛癣菌和须癣毛癣菌的PCR指纹分析
朱红梅 廖万清 戴建新 李志刚 吴建华 温海
关键词：红色毛癣菌；须癣毛癣菌；PCR指纹
红色毛癣菌和须癣毛癣菌的传统鉴别主要依据培养形态、生理生化等方法，但红色毛癣菌的菌落产红现象受培养基类型、pH、培养温度等因素的影响[1]，我们应用PCR方法，以微小卫星DNA引物，对这2种癣菌的基因组DNA进行扩增，可以在很短时间内把它们区分开来。
泳道1为MarkerλDNA/EcoRⅠ+HindⅢ，泳道2、7、8、9为红色毛癣菌，泳道3～6为须癣毛癣菌
图1(GACA)4作引物的PCR扩增结果
, http://www.100md.com 一、材料与方法
(一)实验菌株：本研究采用红色毛癣菌临床分离株23株,须癣毛癣菌临床分离株11株。红色毛癣菌中11株来自上海地区，3株来自徐州地区，8株来自重庆地区，1株来自广州地区，表型中羊毛型、绒毛型16株，粉末、沟纹型6株，颗粒型1株；须癣毛癣菌有羊毛、绒毛、粉末3种表型，其中4株来自徐州地区，5株来自重庆地区，2株来自广州地区。所有菌株均经上海长征医院真菌室作形态学及马铃薯葡萄糖琼脂培养基、尿素琼脂培养基鉴定。
(二)主要试剂：DNA抽提缓冲液按文献配制[2]，氯化苄为上海试剂三厂产品，TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs为日本Takara公司产品。
(三)DNA制备：实验菌株于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平皿上28℃培养2周，无菌牙签刮取菌丝体，采用氯化苄法提取基因组DNA[2]。
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(四)PCR扩增：以寡核苷酸重复序列(GACA)4、(GTG)5及M13中心序列(5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′)等3种引物，对抽提的基因组DNA进行扩增。PCR反应体积20μL,其中包括：2μL10×PCR反应缓冲液(其中含Mg2mmol/L)，1μLdNTPs(2.5mmol/L),2μL引物(10μmol/L),1μLDNA模板(50ng/μL)，1UrTaqDNA聚合酶(5U/μL)。反应条件：①(GACA)4：起始变性94℃5min；94℃1min，退火47℃1min，延伸72℃1min，38个循环；72℃延伸5min。②M13中心序列及(GTG)5：起始变性94℃5min；94℃1min，退火50℃1min，延伸72℃80s，35个循环；72℃延伸6min。产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳3V/cm，1.5h，紫外灯下照相记录。
二、结果
在电泳凝胶上，可观察到3种引物扩增下红色毛癣菌和须癣毛癣菌均呈现不同的带型(图1)。在(GACA)4作引物时，红色毛癣菌的主要扩增条带有3条，大小约
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1100bp、950bp、600bp左右，特征主条带为950bp、1050bp2条，而须癣毛癣菌的主要扩增条带也有6条，大小约900bp、680bp、600bp、350bp、300bp、280bp左右，特征主条带为600bp一条。特征条带的差距相当明显、直观(图1)。
在以M13中心序列作引物时，可用来区分2种菌的特征条带在红色毛癣菌为700bp、540bp、450bp3条，在须癣毛癣菌为1000bp、750bp、600bp、560bp、500bp5条。虽然某些小片段的大小较为接近，但特征条带的差异还是较为直观的。
而在(GTG)5为引物时两者条带大小更为接近：须癣毛癣菌的特征条带为750bp、550bp、400bp3条；红色毛癣菌的特征条带为800bp、600bp、500bp、340bp、250bp5条，其中340bp、250bp2条小片段的扩增产量虽少，对于区分这2种菌起了关键的作用。就差异条带而言，2种菌以(GACA)4扩增产物的带型对比最为清晰。在每种引物的扩增中，11株须癣毛癣菌之间的特征主带型基本一致。在以M13、(GTG)5作引物进行扩增时,发现有1株上海地区的红色毛癣菌呈现与其它22株同种菌株不同的带型，而全部23株红色毛癣菌以(GACA)4作引物扩增时带型一致。
, 百拇医药
三、讨论
Meyer等[3-5]认为，用寡核苷酸简单重复序列和M13野生株的小卫星DNA中心序列(5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′)等作为特殊单一引物扩增真菌高度可变、重复的微、小卫星DNA序列，通过种、株DNA多态性检测，可以区分真菌种类和说明菌株之间在分类学上的关系。
对3种引物的比较发现，(GACA)4扩增的差异条带对比最为清晰。可以认为，寡核苷酸重复序列(GACA)4是同类PCR方法区分红色毛癣菌和须癣毛癣菌较为理想的引物。我们的方法另一长处在于PCR结果的稳定性：因为产物的特征条带最大也不超过1100bp，可重复性较好。就以M13中心序列为引物作PCR区分红色毛癣菌、须癣毛癣菌而言，与Graser[5]的研究结果相比，我们的PCR产物主条带少，在特征条带的分辨上要优于前者。
军队“九五”基金资助项目(96Z045)
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作者单位：朱红梅(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
廖万清(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
李志刚(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
吴建华(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
温海(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
戴建新(第二军医大学分子遗传教研室)
参考文献
[1]刘维达，王金燕，吕桂霞，等.红色毛癣菌菌落产色变异的实验研究.中华皮肤科杂志，1997，30：312-314.
, 百拇医药
[2]Zhu H,Jun F,Zhu LH.Isolation of genomic DNA from plant fungi and bacteria using benzyl chloride.Nucl Acid Res,1993,21:5279- 5280.
[3]Meyer W,Mitchell TG.Polymerase chain reaction fingerprinting in fungi using single primers specific to minisatellites and simple repetitive DNA sequences: strain variation in Cryptococcus neoformans.Electrophoresis,1995,16(9):1648- 1656.
[4]Meyer W,Lieckfeldt E,Kuhls K,et al.DNA- and PCR- fingerprinting in fungi.EXS,1993， 67:311- 320.
[5]Graser Y,el Fari M,Presber W,et al. Identification of common dermatophyton(Trichophyton， Microsporum,Epidermophyton) using polymerase chain reactions.Br J Dermatol,1998,138:576- 582., http://www.100md.com
朱红梅 廖万清 戴建新 李志刚 吴建华 温海
关键词：红色毛癣菌；须癣毛癣菌；PCR指纹
红色毛癣菌和须癣毛癣菌的传统鉴别主要依据培养形态、生理生化等方法，但红色毛癣菌的菌落产红现象受培养基类型、pH、培养温度等因素的影响[1]，我们应用PCR方法，以微小卫星DNA引物，对这2种癣菌的基因组DNA进行扩增，可以在很短时间内把它们区分开来。
泳道1为MarkerλDNA/EcoRⅠ+HindⅢ，泳道2、7、8、9为红色毛癣菌，泳道3～6为须癣毛癣菌
图1(GACA)4作引物的PCR扩增结果
, http://www.100md.com 一、材料与方法
(一)实验菌株：本研究采用红色毛癣菌临床分离株23株,须癣毛癣菌临床分离株11株。红色毛癣菌中11株来自上海地区，3株来自徐州地区，8株来自重庆地区，1株来自广州地区，表型中羊毛型、绒毛型16株，粉末、沟纹型6株，颗粒型1株；须癣毛癣菌有羊毛、绒毛、粉末3种表型，其中4株来自徐州地区，5株来自重庆地区，2株来自广州地区。所有菌株均经上海长征医院真菌室作形态学及马铃薯葡萄糖琼脂培养基、尿素琼脂培养基鉴定。
(二)主要试剂：DNA抽提缓冲液按文献配制[2]，氯化苄为上海试剂三厂产品，TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs为日本Takara公司产品。
(三)DNA制备：实验菌株于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平皿上28℃培养2周，无菌牙签刮取菌丝体，采用氯化苄法提取基因组DNA[2]。
, 百拇医药
(四)PCR扩增：以寡核苷酸重复序列(GACA)4、(GTG)5及M13中心序列(5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′)等3种引物，对抽提的基因组DNA进行扩增。PCR反应体积20μL,其中包括：2μL10×PCR反应缓冲液(其中含Mg2mmol/L)，1μLdNTPs(2.5mmol/L),2μL引物(10μmol/L),1μLDNA模板(50ng/μL)，1UrTaqDNA聚合酶(5U/μL)。反应条件：①(GACA)4：起始变性94℃5min；94℃1min，退火47℃1min，延伸72℃1min，38个循环；72℃延伸5min。②M13中心序列及(GTG)5：起始变性94℃5min；94℃1min，退火50℃1min，延伸72℃80s，35个循环；72℃延伸6min。产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳3V/cm，1.5h，紫外灯下照相记录。
二、结果
在电泳凝胶上，可观察到3种引物扩增下红色毛癣菌和须癣毛癣菌均呈现不同的带型(图1)。在(GACA)4作引物时，红色毛癣菌的主要扩增条带有3条，大小约
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1100bp、950bp、600bp左右，特征主条带为950bp、1050bp2条，而须癣毛癣菌的主要扩增条带也有6条，大小约900bp、680bp、600bp、350bp、300bp、280bp左右，特征主条带为600bp一条。特征条带的差距相当明显、直观(图1)。
在以M13中心序列作引物时，可用来区分2种菌的特征条带在红色毛癣菌为700bp、540bp、450bp3条，在须癣毛癣菌为1000bp、750bp、600bp、560bp、500bp5条。虽然某些小片段的大小较为接近，但特征条带的差异还是较为直观的。
而在(GTG)5为引物时两者条带大小更为接近：须癣毛癣菌的特征条带为750bp、550bp、400bp3条；红色毛癣菌的特征条带为800bp、600bp、500bp、340bp、250bp5条，其中340bp、250bp2条小片段的扩增产量虽少，对于区分这2种菌起了关键的作用。就差异条带而言，2种菌以(GACA)4扩增产物的带型对比最为清晰。在每种引物的扩增中，11株须癣毛癣菌之间的特征主带型基本一致。在以M13、(GTG)5作引物进行扩增时,发现有1株上海地区的红色毛癣菌呈现与其它22株同种菌株不同的带型，而全部23株红色毛癣菌以(GACA)4作引物扩增时带型一致。
, 百拇医药
三、讨论
Meyer等[3-5]认为，用寡核苷酸简单重复序列和M13野生株的小卫星DNA中心序列(5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′)等作为特殊单一引物扩增真菌高度可变、重复的微、小卫星DNA序列，通过种、株DNA多态性检测，可以区分真菌种类和说明菌株之间在分类学上的关系。
对3种引物的比较发现，(GACA)4扩增的差异条带对比最为清晰。可以认为，寡核苷酸重复序列(GACA)4是同类PCR方法区分红色毛癣菌和须癣毛癣菌较为理想的引物。我们的方法另一长处在于PCR结果的稳定性：因为产物的特征条带最大也不超过1100bp，可重复性较好。就以M13中心序列为引物作PCR区分红色毛癣菌、须癣毛癣菌而言，与Graser[5]的研究结果相比，我们的PCR产物主条带少，在特征条带的分辨上要优于前者。
军队“九五”基金资助项目(96Z045)
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作者单位：朱红梅(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
廖万清(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
李志刚(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
吴建华(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
温海(200003上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科)
戴建新(第二军医大学分子遗传教研室)
参考文献
[1]刘维达，王金燕，吕桂霞，等.红色毛癣菌菌落产色变异的实验研究.中华皮肤科杂志，1997，30：312-314.
, 百拇医药
[2]Zhu H,Jun F,Zhu LH.Isolation of genomic DNA from plant fungi and bacteria using benzyl chloride.Nucl Acid Res,1993,21:5279- 5280.
[3]Meyer W,Mitchell TG.Polymerase chain reaction fingerprinting in fungi using single primers specific to minisatellites and simple repetitive DNA sequences: strain variation in Cryptococcus neoformans.Electrophoresis,1995,16(9):1648- 1656.
[4]Meyer W,Lieckfeldt E,Kuhls K,et al.DNA- and PCR- fingerprinting in fungi.EXS,1993， 67:311- 320.
[5]Graser Y,el Fari M,Presber W,et al. Identification of common dermatophyton(Trichophyton， Microsporum,Epidermophyton) using polymerase chain reactions.Br J Dermatol,1998,138:576- 582., http://www.100md.com