多形红斑与HLA相关性研究
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中华皮肤科杂志 2000年第33卷第5期
多形红斑与HLA相关性研究
姜海燕 宋芳吉 翟宁 肖毅
摘 要 目的 研究多形红斑与HLA相关性。方法 采用血清学技术和聚合酶链式反应-序列特异性引物技术,检测多形红斑患者HLAⅠ类抗原和HLAⅡ类基因。结果 在30例多形红斑患者中,HLA-A30+31、B13抗原频率较对照组明显增高(A30+31：Pc<0.01,RR=6.64;B13：Pc<10-3,RR=7.88)。HLA-DQB1*04基因频率在多形红斑患者较正常人对照组明显增高(DQB1*04：Pc<10-3,RR=4.8125),而HLA-DQB1*03基因频率较正常人对照组明显降低(DQB1*03:Pc<10-5,RR=0.07)。结论 多形红斑与HLA-A30+31、B13、DQB1*04呈正相关,与HLA-DQB1*03呈负相关。
, 百拇医药
关键词：斑，多形；HLA抗原；聚合酶链反应
自1967年Amiel开创了HLA与疾病的相关性研究以来[1],目前已报道有100多种疾病与各种HLA抗原有关。为探索多形红斑发病机理中免疫遗传因素的作用,我们进行了多形红斑与HLA相关性的研究。现将结果报道如下。
材料和方法
1.研究对象:病例组:30例经门诊诊断的多形红斑患者,均为汉族,彼此间无血缘关系。男12例,女18例,年龄11～70岁。所有多形红斑患者排除药物因素,而且具有靶形红斑。单纯疱疹病毒引起者1例,细菌引起者5例,特发性多形红斑16例,复发性多形红斑8例。30例多形红斑患者同时检测了Ⅰ类抗原、Ⅱ类基因。对照组:Ⅰ类抗原:选择无血缘关系的汉族健康人100例,年龄15～58岁。男57例,女43例。Ⅱ类基因:选择无血缘关系的汉族健康人104例,年龄17～50岁。男50例,女54例。
, 百拇医药
2.实验方法:Ⅰ类抗原的检测:采用国际通用的NIH标准微量淋巴细胞毒试验方法[2,3]:外周血淋巴细胞分离。HLA-AB血清板每孔加1μL淋巴细胞悬液,22℃～24℃孵育30min。每孔加5%伊红染色5min后用37%中性甲醛固定。室温下静置60min后,在倒置显微镜下读数。本实验所用HLA-AB血清板由上海市血液中心HLA血清库提供。HLA-A位点包括HLA-A1、A2、A3、A9、A10、A11、A28、A29、A30、A30+31、A3311个特异性,HLA-B位点包括HLA-B5、B51(5)、B7、B8、B12、B13、B15、B16、B17、B57(17)、B22、B27、B35、B39、B40、B44、B46共17个特异性。Ⅱ类基因的检测:采用聚合酶链式反应-序列特异性引物技术(PCR-SSP)。快速盐析法提取DNA。PCR反应体系为25μL体积中含有模板DNA100ng、10×缓冲液2.5μL、2.5mmol/LdNTP2.5μL、25mmol/LMgCl21.5μL。双蒸水滴加至25μL。每条引物0.25μmol/L。循环参数：94℃预变性4min后,94℃1min,65℃1min,72℃1min,计35个循环,后延伸72℃2min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外线灯下观察结果并照相。本实验所用22种引物由美国Florida大学提供。引物内部指控带为400bp,我们所检测的基因都在300bp以下。内部指控带除作为标准参照物外,尚有质量控制作用,体现各反应体系浓度是否正常。Taq酶、dNTP、10×缓冲液由Promega公司生产。
, 百拇医药
表1 多形红斑患者与正常人HLA-A，B基因频率比较(P<0.05者)
HLA基因
正常人组(n=100)
患者组(n=30)
χ2值
P值
Pc值
RR
阳性例数
抗原频率
基因频率
阳性例数
, 百拇医药
抗原频率
基因频率
A1
4
0.04
0.0202
5
0.17
0.0890
3.95
<0.05
>0.05
4.80
, 百拇医药
A30+31
7
0.07
0.0356
10
0.33
0.1815
11.86
<10-3
<0.01
6.64
B13
10
, 百拇医药
0.10
0.0050
14
0.47
0.2720
18.23
<10-4
<10-3
7.88
B17
9
0.09
0.0461
, 百拇医药
8
0.27
0.1456
4.87
<0.05
>0.05
3.68
表2 多形红斑患者与正常人HLA-DR、DQ基因频率比较(P<0.05者)
HLA基因
正常人组(n=104)
患者组(n=30)
χ2值
, 百拇医药
P值
Pc值
RR
阳性例数
基因频率
阳性例数
基因频率
DQB1*03
77
0.4905
5
0.0871
29.19
, 百拇医药
<10-6
<10-5
0.07
DQB1*04
16
0.0801
14
0.2697
11.37
<10-4
<10-3
4.81
3.统计学处理方法：HLA与疾病相关的统计学计算采用Yata法计算校正χ2值,相对危险度(RR),用Fisher法计算确切P值,校正P值Pc为将所得P值乘以这个位点抗原数[3,4]。
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结果
多形红斑患者与正常人对照组HLA-A、B位点抗原频率、基因频率比较(P<0.05者)见表1。从表1见到多形红斑患者组HLA-A1、A30+31、B13、B17抗原频率明显高于对照组，经校正P值后HLA-A30+31、B13差异仍有显著性(A30+31:Pc<0.01;B13：Pc<10-3)。多形红斑患者组与正常对照组HLA-DR、DQ位点基因频率比较(P<0.05者)见表2。由表2见到多形红斑患者组HLA-DQB1*04基因频率明显高于对照组，HLA-DQB1*03基因频明显低于对照组，经校正P值后差异仍有显著性(DQB1*03:Pc<10-5,DQB1*04:Pc<10-3)。
讨论
1983年Duvic等[5]报道多形红斑与HLA-B15相关。1988年Kampgen等[6]报道单纯疱疹诱导的多形红斑与DQW3相关。同年Lepage等[7]报道多形红斑与HLA-A33和DR53相关。1991年Khalil等[8]报道多形红斑与HLA-DQB1*0301相关，但该文35例患者中有17例是单纯疱疹诱导的多形红斑。1994年Schofield等[9]证实多形红斑与B15、B35、Cw4和DR52相关。1998年Malo等[10]报道复发性单纯疱疹诱导的多形红斑与HLA-DQB1*0302相关。我们对30例多形红斑患者进行HLA-A、B位点抗原分析,结果多形红斑与HLA-A30+31、B13明显相关,即具有HLA-A30+31、B13抗原者患多形红斑的可能性大。由于A30+31与A33均为A19的裂解产物,因此本实验结果与Lepage等报道基本类似。我们同时对30例多形红斑患者进行了HLAⅡ类基因的检测,发现多形红斑患者HLA-DQB1*04基因频率显著增高,而DQB1*03基因频率显著降低。即具有HLA-DQB1*04基因者患多形红斑可能性大,而具有HLA-DQB1*03基因者患多形红斑可能性小。DQB1*03为中国人较常见的HLA基因型，正常人群中频率为49.0%,在多形红斑患者中仅为8.7%；DQB1*04为中国人较少见的HLA基因型，正常人群中频率为8.0%，多形红斑患者中却为27.0%。HLAⅡ类基因检测结果与文献报道不完全一致,我们认为这种差异可能是由于病例选择、人种不同所致。
, 百拇医药
作者单位：宋芳吉(110001沈阳，中国医科大学第一临床医院皮肤科)
翟宁(110001沈阳，中国医科大学第一临床医院皮肤科)
肖毅(110001沈阳，中国医科大学第一临床医院皮肤科)
姜海燕(现在沈阳市第七人民医院皮肤科)
参考文献
[1]Ozawa A,Ohkidom,Tsuji K. Some recent advances in HLA and skin disease. J Am Acad Dermatol, 1981,4:205- 230.
[2]宋芳吉,李惠刚. HLA分型方法及其临床意义. 生理科学，1988,8:204.
, http://www.100md.com
[3]Tiwari JL,Terasaki PI. HLA and disease association.New York : Sping- Verlag, 1985.4- 26.
[4] Rose NR,Demacario EC,Fahey JK,et al. Mannual of clinical laboratory immunology,4th ed.Washinton: American Society for Microbiology, 1992.867- 876.
[5]Duvic M ,Reisner EG,Dawson DV,et al. HLA- B15 association with erythema multiforme. J Am Acad Dermatol, 1983,8:493- 496.
[6]Kampgen E,Burg G,Wank R. Association of herpes simplex virus induced erythema multiforme with the human leukocyte antigen DQw3. Arch Dermatol, 1988,124:1372- 5375.
, 百拇医药
[7]Lepage V, Douay C, Mank R, et al. Erythema multiforme is associated to HLA- A33和 DR53. Tissue Antigens, 1988,32:170- 175.
[8]Khalil I, Lepage V, Douay C,et al. HLA- DQB1* 0301 allele is involved in the susceptibility to erythema multiforme. J Invest Dermatol, 1991,97:697- 700.
[9]Schofield JK, Tatnall FM,Brown J, et al. Recurrent erythema multiforme;tissue typing in a large series of patients. Br J Dermatol, 1994,131: 532- 535.
[10]Malo A, Kampgen E, Wank R Recurrent herpes simplex virus- induced erythema multiforme: different HLA- DQB1 alleles associate with severe mucous membrane versus skin attacks. Scand J Immunol, 1998,47:408- 411., 百拇医药
姜海燕 宋芳吉 翟宁 肖毅
摘 要 目的 研究多形红斑与HLA相关性。方法 采用血清学技术和聚合酶链式反应-序列特异性引物技术,检测多形红斑患者HLAⅠ类抗原和HLAⅡ类基因。结果 在30例多形红斑患者中,HLA-A30+31、B13抗原频率较对照组明显增高(A30+31：Pc<0.01,RR=6.64;B13：Pc<10-3,RR=7.88)。HLA-DQB1*04基因频率在多形红斑患者较正常人对照组明显增高(DQB1*04：Pc<10-3,RR=4.8125),而HLA-DQB1*03基因频率较正常人对照组明显降低(DQB1*03:Pc<10-5,RR=0.07)。结论 多形红斑与HLA-A30+31、B13、DQB1*04呈正相关,与HLA-DQB1*03呈负相关。
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关键词：斑，多形；HLA抗原；聚合酶链反应
自1967年Amiel开创了HLA与疾病的相关性研究以来[1],目前已报道有100多种疾病与各种HLA抗原有关。为探索多形红斑发病机理中免疫遗传因素的作用,我们进行了多形红斑与HLA相关性的研究。现将结果报道如下。
材料和方法
1.研究对象:病例组:30例经门诊诊断的多形红斑患者,均为汉族,彼此间无血缘关系。男12例,女18例,年龄11～70岁。所有多形红斑患者排除药物因素,而且具有靶形红斑。单纯疱疹病毒引起者1例,细菌引起者5例,特发性多形红斑16例,复发性多形红斑8例。30例多形红斑患者同时检测了Ⅰ类抗原、Ⅱ类基因。对照组:Ⅰ类抗原:选择无血缘关系的汉族健康人100例,年龄15～58岁。男57例,女43例。Ⅱ类基因:选择无血缘关系的汉族健康人104例,年龄17～50岁。男50例,女54例。
, 百拇医药
2.实验方法:Ⅰ类抗原的检测:采用国际通用的NIH标准微量淋巴细胞毒试验方法[2,3]:外周血淋巴细胞分离。HLA-AB血清板每孔加1μL淋巴细胞悬液,22℃～24℃孵育30min。每孔加5%伊红染色5min后用37%中性甲醛固定。室温下静置60min后,在倒置显微镜下读数。本实验所用HLA-AB血清板由上海市血液中心HLA血清库提供。HLA-A位点包括HLA-A1、A2、A3、A9、A10、A11、A28、A29、A30、A30+31、A3311个特异性,HLA-B位点包括HLA-B5、B51(5)、B7、B8、B12、B13、B15、B16、B17、B57(17)、B22、B27、B35、B39、B40、B44、B46共17个特异性。Ⅱ类基因的检测:采用聚合酶链式反应-序列特异性引物技术(PCR-SSP)。快速盐析法提取DNA。PCR反应体系为25μL体积中含有模板DNA100ng、10×缓冲液2.5μL、2.5mmol/LdNTP2.5μL、25mmol/LMgCl21.5μL。双蒸水滴加至25μL。每条引物0.25μmol/L。循环参数：94℃预变性4min后,94℃1min,65℃1min,72℃1min,计35个循环,后延伸72℃2min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外线灯下观察结果并照相。本实验所用22种引物由美国Florida大学提供。引物内部指控带为400bp,我们所检测的基因都在300bp以下。内部指控带除作为标准参照物外,尚有质量控制作用,体现各反应体系浓度是否正常。Taq酶、dNTP、10×缓冲液由Promega公司生产。
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表1 多形红斑患者与正常人HLA-A，B基因频率比较(P<0.05者)
HLA基因
正常人组(n=100)
患者组(n=30)
χ2值
P值
Pc值
RR
阳性例数
抗原频率
基因频率
阳性例数
, 百拇医药
抗原频率
基因频率
A1
4
0.04
0.0202
5
0.17
0.0890
3.95
<0.05
>0.05
4.80
, 百拇医药
A30+31
7
0.07
0.0356
10
0.33
0.1815
11.86
<10-3
<0.01
6.64
B13
10
, 百拇医药
0.10
0.0050
14
0.47
0.2720
18.23
<10-4
<10-3
7.88
B17
9
0.09
0.0461
, 百拇医药
8
0.27
0.1456
4.87
<0.05
>0.05
3.68
表2 多形红斑患者与正常人HLA-DR、DQ基因频率比较(P<0.05者)
HLA基因
正常人组(n=104)
患者组(n=30)
χ2值
, 百拇医药
P值
Pc值
RR
阳性例数
基因频率
阳性例数
基因频率
DQB1*03
77
0.4905
5
0.0871
29.19
, 百拇医药
<10-6
<10-5
0.07
DQB1*04
16
0.0801
14
0.2697
11.37
<10-4
<10-3
4.81
3.统计学处理方法：HLA与疾病相关的统计学计算采用Yata法计算校正χ2值,相对危险度(RR),用Fisher法计算确切P值,校正P值Pc为将所得P值乘以这个位点抗原数[3,4]。
, http://www.100md.com
结果
多形红斑患者与正常人对照组HLA-A、B位点抗原频率、基因频率比较(P<0.05者)见表1。从表1见到多形红斑患者组HLA-A1、A30+31、B13、B17抗原频率明显高于对照组，经校正P值后HLA-A30+31、B13差异仍有显著性(A30+31:Pc<0.01;B13：Pc<10-3)。多形红斑患者组与正常对照组HLA-DR、DQ位点基因频率比较(P<0.05者)见表2。由表2见到多形红斑患者组HLA-DQB1*04基因频率明显高于对照组，HLA-DQB1*03基因频明显低于对照组，经校正P值后差异仍有显著性(DQB1*03:Pc<10-5,DQB1*04:Pc<10-3)。
讨论
1983年Duvic等[5]报道多形红斑与HLA-B15相关。1988年Kampgen等[6]报道单纯疱疹诱导的多形红斑与DQW3相关。同年Lepage等[7]报道多形红斑与HLA-A33和DR53相关。1991年Khalil等[8]报道多形红斑与HLA-DQB1*0301相关，但该文35例患者中有17例是单纯疱疹诱导的多形红斑。1994年Schofield等[9]证实多形红斑与B15、B35、Cw4和DR52相关。1998年Malo等[10]报道复发性单纯疱疹诱导的多形红斑与HLA-DQB1*0302相关。我们对30例多形红斑患者进行HLA-A、B位点抗原分析,结果多形红斑与HLA-A30+31、B13明显相关,即具有HLA-A30+31、B13抗原者患多形红斑的可能性大。由于A30+31与A33均为A19的裂解产物,因此本实验结果与Lepage等报道基本类似。我们同时对30例多形红斑患者进行了HLAⅡ类基因的检测,发现多形红斑患者HLA-DQB1*04基因频率显著增高,而DQB1*03基因频率显著降低。即具有HLA-DQB1*04基因者患多形红斑可能性大,而具有HLA-DQB1*03基因者患多形红斑可能性小。DQB1*03为中国人较常见的HLA基因型，正常人群中频率为49.0%,在多形红斑患者中仅为8.7%；DQB1*04为中国人较少见的HLA基因型，正常人群中频率为8.0%，多形红斑患者中却为27.0%。HLAⅡ类基因检测结果与文献报道不完全一致,我们认为这种差异可能是由于病例选择、人种不同所致。
, 百拇医药
作者单位：宋芳吉(110001沈阳，中国医科大学第一临床医院皮肤科)
翟宁(110001沈阳，中国医科大学第一临床医院皮肤科)
肖毅(110001沈阳，中国医科大学第一临床医院皮肤科)
姜海燕(现在沈阳市第七人民医院皮肤科)
参考文献
[1]Ozawa A,Ohkidom,Tsuji K. Some recent advances in HLA and skin disease. J Am Acad Dermatol, 1981,4:205- 230.
[2]宋芳吉,李惠刚. HLA分型方法及其临床意义. 生理科学，1988,8:204.
, http://www.100md.com
[3]Tiwari JL,Terasaki PI. HLA and disease association.New York : Sping- Verlag, 1985.4- 26.
[4] Rose NR,Demacario EC,Fahey JK,et al. Mannual of clinical laboratory immunology,4th ed.Washinton: American Society for Microbiology, 1992.867- 876.
[5]Duvic M ,Reisner EG,Dawson DV,et al. HLA- B15 association with erythema multiforme. J Am Acad Dermatol, 1983,8:493- 496.
[6]Kampgen E,Burg G,Wank R. Association of herpes simplex virus induced erythema multiforme with the human leukocyte antigen DQw3. Arch Dermatol, 1988,124:1372- 5375.
, 百拇医药
[7]Lepage V, Douay C, Mank R, et al. Erythema multiforme is associated to HLA- A33和 DR53. Tissue Antigens, 1988,32:170- 175.
[8]Khalil I, Lepage V, Douay C,et al. HLA- DQB1* 0301 allele is involved in the susceptibility to erythema multiforme. J Invest Dermatol, 1991,97:697- 700.
[9]Schofield JK, Tatnall FM,Brown J, et al. Recurrent erythema multiforme;tissue typing in a large series of patients. Br J Dermatol, 1994,131: 532- 535.
[10]Malo A, Kampgen E, Wank R Recurrent herpes simplex virus- induced erythema multiforme: different HLA- DQB1 alleles associate with severe mucous membrane versus skin attacks. Scand J Immunol, 1998,47:408- 411., 百拇医药