分支杆菌鉴定方法的比较研究
分支杆菌鉴定方法的比较研究
刘金伟 匡铁吉 王金河 裴宁 宋萍 仲斌
关键词：微菌落法；多重聚合酶链反应(PCR)；分支杆菌；菌种鉴定 比较了微菌落法、多重聚合酶链反应(PCR)法和传统法用于分支杆菌临床分离物菌种鉴定的效果，现报告如下。
材料与方法：试验菌株：(1) 标准菌株：结核分支杆菌H37RV、牛分支杆菌、鸟分支杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、瘰疬分支杆菌、偶然分支杆菌和耻垢分支杆菌标准株，均购自北京结核病胸部肿瘤研究所。(2) 临床分离株：来自我院结核病住院患者的痰、胸液和脑脊液。
传统分型鉴定试验：(1) 培养鉴定试验：按常规制备对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基，取试验菌株菌悬液(10-2/ml)0.1 ml接种，37 ℃培养，4周看结果。(2) 生化试验：68 ℃耐热过氧化氢酶试验、硝酸还原试验和吐温80水解试验，均按常规操作。
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微菌落观察法：取试验菌株在37 ℃培养2～3周的斜面生长物，用无菌生理盐水配制相当于10-3 mg湿菌/ml接种液，取0.1 ml接种匡氏琼脂平皿3个，涂匀后置36 ℃含5% CO2的温箱培养3、7、12 d后分别在100倍显微镜下观察微菌形态，记录结果。
多重PCR鉴定法：多重PCR的三对引物是：MT1和MT2、PT1和PT2、IS5和IS6，它们分别扩增表达32 000蛋白的基因序列[1]、MTP40蛋白的基因序列[2]和IS6110插入序列[3]。DNA扩增采用的PCR仪为英国Techne公司产品，型号为GeneE，操作见参考文献[4]。
结果与讨论 三种菌种鉴定法用于分支杆菌鉴定所耗时间见表1。
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表1 三种方法用于200株分支杆菌鉴别耗用时间比较
鉴别方法
鉴别内容
平均耗时(d)
传统法
结核、牛分支杆菌与非结核分支杆菌
28
微菌落观察法
结核菌群与非结核分支杆菌
7.8
多重PCR法
结核、牛分支杆菌与非结核分支杆菌
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2～3
表2 三种方法用于分支杆菌菌型鉴别的结果比较
方 法
受试菌株数
正确鉴别
菌株数
%
传统法
200
193
96.5
微菌落观察法
200
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194
97.0
多重PCR法
200
196
98.0
注：经χ2检验，三种方法鉴别正确率比较P>0.05
三种方法用于200株分支杆菌鉴定结果见表2。200株受试菌株中，有非结核分支杆菌11株，牛分支杆菌2株，其余187株均为结核分支杆菌，其中非结核分支杆菌株占5.5%。采用传统鉴定法，有4株结核分支杆菌株和2株非结核分支杆菌菌株鉴别不明确。微菌落法鉴别错误的有4株，其中2株由于平皿上有杂菌污染而错误地鉴定为非结核分支杆菌菌株。故在操作过程中严防杂菌污染，对提高微菌落法鉴定分支杆菌的准确率具有重要意义。多重PCR扩增分支杆菌DNA时产生1～3条带，其中引物MT1-MT2扩增一条500 bp的分支杆菌属特异DNA片段；引物IS5-IS6扩增一条1 000 bp长的结核分支杆菌菌群特异DNA带；引物PT1-PT2扩增一条约400 bp的结核分支杆菌种特异片段。扩增产物电泳后，结核分支杆菌DNA标本产生3条带，牛分支杆菌DNA标本产生2条带，非结核分支杆菌DNA标本产生1条带。影响多重PCR鉴定分支杆菌效果的主要因素是复性温度和Taq酶质量。多重PCR法复性温度为71 ℃，与延伸温度只差1 ℃，必须很准确。表1结果表明，采用传统法鉴定分支杆菌需28 d，与微菌落法和多重PCR法相比差异有非常显著性(P<0.001)；微菌落法需7.8 d，与多重PCR法相比差异有显著性(P<0.01)。三种方法相比，多重PCR法用于分支杆菌菌种鉴定所耗时间最短，其次是微菌落法，传统法耗时最长。表2结果表明，三种方法用于分支杆菌菌种鉴定的正确率差异无显著性(P>0.05)。本研究提示，微菌落法和多重PCR法对分支杆菌菌种鉴定具有快速、准确的优点，较传统法更能满足结核病临床的需要。
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作者单位：刘金伟(100091 北京，解放军第三○九医院)
匡铁吉(100091 北京，解放军第三○九医院)
王金河(100091 北京，解放军第三○九医院)
裴宁(100091 北京，解放军第三○九医院)
宋萍(100091 北京，解放军第三○九医院)
仲斌(100091 北京，解放军第三○九医院)
参考文献
1.Borremans M, de Witt L, Volckaert G, et al. Cloning, sequence determination, and expression of a 32 kilodalton protein of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun, 1989, 57：3123-3130.
, http://www.100md.com
2.Parra CA, Londono LP, Del Portillo P, et al. Characterization and molecular cloning of a species-specific sequence. Infect Immun, 1991, 59:3411-3417.
3.Thierry D, Brisson-Noel A, Vincent-Levy-Frebault V, et al. Characteristic of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis. J Clin Microbiol, 1990, 28:2668-2673.
4.Del Patricia P, Thomas MC, Martine E, et al. Multiprimer PCR system for differential identification of Mycobacteria in clinical samples. J Clin Microbiol, 1996, 34:324-328., http://www.100md.com
刘金伟 匡铁吉 王金河 裴宁 宋萍 仲斌
关键词：微菌落法；多重聚合酶链反应(PCR)；分支杆菌；菌种鉴定 比较了微菌落法、多重聚合酶链反应(PCR)法和传统法用于分支杆菌临床分离物菌种鉴定的效果，现报告如下。
材料与方法：试验菌株：(1) 标准菌株：结核分支杆菌H37RV、牛分支杆菌、鸟分支杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、瘰疬分支杆菌、偶然分支杆菌和耻垢分支杆菌标准株，均购自北京结核病胸部肿瘤研究所。(2) 临床分离株：来自我院结核病住院患者的痰、胸液和脑脊液。
传统分型鉴定试验：(1) 培养鉴定试验：按常规制备对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基，取试验菌株菌悬液(10-2/ml)0.1 ml接种，37 ℃培养，4周看结果。(2) 生化试验：68 ℃耐热过氧化氢酶试验、硝酸还原试验和吐温80水解试验，均按常规操作。
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微菌落观察法：取试验菌株在37 ℃培养2～3周的斜面生长物，用无菌生理盐水配制相当于10-3 mg湿菌/ml接种液，取0.1 ml接种匡氏琼脂平皿3个，涂匀后置36 ℃含5% CO2的温箱培养3、7、12 d后分别在100倍显微镜下观察微菌形态，记录结果。
多重PCR鉴定法：多重PCR的三对引物是：MT1和MT2、PT1和PT2、IS5和IS6，它们分别扩增表达32 000蛋白的基因序列[1]、MTP40蛋白的基因序列[2]和IS6110插入序列[3]。DNA扩增采用的PCR仪为英国Techne公司产品，型号为GeneE，操作见参考文献[4]。
结果与讨论 三种菌种鉴定法用于分支杆菌鉴定所耗时间见表1。
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表1 三种方法用于200株分支杆菌鉴别耗用时间比较
鉴别方法
鉴别内容
平均耗时(d)
传统法
结核、牛分支杆菌与非结核分支杆菌
28
微菌落观察法
结核菌群与非结核分支杆菌
7.8
多重PCR法
结核、牛分支杆菌与非结核分支杆菌
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表2 三种方法用于分支杆菌菌型鉴别的结果比较
方 法
受试菌株数
正确鉴别
菌株数
%
传统法
200
193
96.5
微菌落观察法
200
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97.0
多重PCR法
200
196
98.0
注：经χ2检验，三种方法鉴别正确率比较P>0.05
三种方法用于200株分支杆菌鉴定结果见表2。200株受试菌株中，有非结核分支杆菌11株，牛分支杆菌2株，其余187株均为结核分支杆菌，其中非结核分支杆菌株占5.5%。采用传统鉴定法，有4株结核分支杆菌株和2株非结核分支杆菌菌株鉴别不明确。微菌落法鉴别错误的有4株，其中2株由于平皿上有杂菌污染而错误地鉴定为非结核分支杆菌菌株。故在操作过程中严防杂菌污染，对提高微菌落法鉴定分支杆菌的准确率具有重要意义。多重PCR扩增分支杆菌DNA时产生1～3条带，其中引物MT1-MT2扩增一条500 bp的分支杆菌属特异DNA片段；引物IS5-IS6扩增一条1 000 bp长的结核分支杆菌菌群特异DNA带；引物PT1-PT2扩增一条约400 bp的结核分支杆菌种特异片段。扩增产物电泳后，结核分支杆菌DNA标本产生3条带，牛分支杆菌DNA标本产生2条带，非结核分支杆菌DNA标本产生1条带。影响多重PCR鉴定分支杆菌效果的主要因素是复性温度和Taq酶质量。多重PCR法复性温度为71 ℃，与延伸温度只差1 ℃，必须很准确。表1结果表明，采用传统法鉴定分支杆菌需28 d，与微菌落法和多重PCR法相比差异有非常显著性(P<0.001)；微菌落法需7.8 d，与多重PCR法相比差异有显著性(P<0.01)。三种方法相比，多重PCR法用于分支杆菌菌种鉴定所耗时间最短，其次是微菌落法，传统法耗时最长。表2结果表明，三种方法用于分支杆菌菌种鉴定的正确率差异无显著性(P>0.05)。本研究提示，微菌落法和多重PCR法对分支杆菌菌种鉴定具有快速、准确的优点，较传统法更能满足结核病临床的需要。
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作者单位：刘金伟(100091 北京，解放军第三○九医院)
匡铁吉(100091 北京，解放军第三○九医院)
王金河(100091 北京，解放军第三○九医院)
裴宁(100091 北京，解放军第三○九医院)
宋萍(100091 北京，解放军第三○九医院)
仲斌(100091 北京，解放军第三○九医院)
参考文献
1.Borremans M, de Witt L, Volckaert G, et al. Cloning, sequence determination, and expression of a 32 kilodalton protein of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun, 1989, 57：3123-3130.
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2.Parra CA, Londono LP, Del Portillo P, et al. Characterization and molecular cloning of a species-specific sequence. Infect Immun, 1991, 59:3411-3417.
3.Thierry D, Brisson-Noel A, Vincent-Levy-Frebault V, et al. Characteristic of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis. J Clin Microbiol, 1990, 28:2668-2673.
4.Del Patricia P, Thomas MC, Martine E, et al. Multiprimer PCR system for differential identification of Mycobacteria in clinical samples. J Clin Microbiol, 1996, 34:324-328., http://www.100md.com