正常人活体角膜组织结构的共焦显微镜观察
谢立信 史伟云 郭萍 袁风波 李绍伟
摘 要 目的 用共焦显微镜对正常人活体角膜各层组织结构进行观察和分析。方法 60例(120只眼)正常人角膜分为3组。A组：5～14岁, 20例(40只眼); B组：15～45岁，22例(44只眼)；C组：46～70岁，18例(36只眼) 。共焦显微镜检查的各层角膜图像均被记录，并对各层组织细胞形态、细胞密度及面积的结果进行分析。结果 各层角膜细胞的面积和密度与性别和眼别无差异，B组和C组之间无差异。角膜表层上皮细胞和基底细胞的面积及密度3组间比较差异无显著性(P>0.05)。前弹力层处仅见上皮下神经丛。各年龄组内前基质细胞密度与后基质细胞密度比较差异有显著性(P<0.01)。A组前基质细胞密度与B、C组前基质细胞密度比较差异有显著性(P<0.05)。A组后基质细胞密度与B、C组后基质细胞密度比较差异有显著性(P<0.05)。内皮细胞的面积和密度A组与B、C组比较差异有显著性(P<0.01)。结论 共焦显微镜能观察到活体角膜各层细胞的形态及变化，提示角膜基质细胞、内皮细胞随年龄增大而密度下降，为临床提供有用的解剖学基础，对角膜病的研究和临床诊断方面将是十分有用的工具。
, 百拇医药
关键词：显微镜检查，共焦；角膜；活体解剖
传统的角膜组织学观察,是对角膜标本固定染色后所见的结果。而活体观察的结果知之甚少。如裂隙灯显微镜,因其低分辨率和低放大率而不能观察到角膜各层的细胞变化。活体角膜组织细胞学的变化,在角膜病的基础研究与临床诊断方面有重要作用。1990年Cavanagh等[1]首次将共焦显微镜应用于角膜病的检查和诊断,使对活体角膜组织细胞观察成为可能。现将我院对不同年龄受检者的角膜各层组织细胞形态及密度观察结果,报告如下。
资料和方法
1.临床资料:60例正常人,裂隙灯显微镜检查无眼部炎症,无外伤史及戴接触镜史,角膜透明，眼前节组织正常。按年龄分为3组：A组：5～14岁,20例(40只眼)；B组：15～45岁,22例(44只眼)；C组：46～70岁,18例(36只眼)。
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表1 各年龄组正常人角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞面积和密度均值分布(
±s)
年龄组
眼数
表层上皮细胞
上皮基底细胞
前基质细胞
后基质细胞
内皮细胞
平均面积
(μm2)
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平均密度
(个/mm2)
平均面积
(μm2)
平均密度
(个/mm2)
平均密度
(个/mm2)
平均密度
(个/mm2)
平均面积
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(μm2)
平均密度
(个/mm2)
A组( 5～14岁)
40
923±316
1 175±280
152±45
5 780±525
1 480±210
860±210
260±50
, 百拇医药
3 605±320
B组(15～45岁)
44
950±300
1 100±300
185±25
5 680±280
1 020±190
600±120
360±70
2 807±310
C组(46～70岁)
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36
913±306
1 223±360
177±21
5 650±420
1 100±200
625±115
425±80
2 700±200
2.共焦显微镜检查方法:受检眼用0.4%盐酸丁氧普鲁卡因液表麻，钢丝开睑器开睑。受检者下颌放在检查托上,前额与检查托的头带接触,以保持头位正。在共焦显微镜(日本Tomey公司)的水浸式锥状物镜(Achraplan,40/0.75W)表面涂上眼用胶(Vidisic-Gel),开启共焦显微镜的微机及录像系统后，调节镜头使其通过眼用胶与角膜接触，镜头与角膜上皮的距离为1.98 mm，并通过镜头调节器调整其前后左右运动。角膜各层的扫描图像可以通过电脑显示器同步显示，同时也被S-VHS 录像机记录。每个受检者，每次均行角膜中央区和周边区的两点检测。检查结束后选择有价值的较为清晰的图像存入电脑中，再转输入磁盘，经计算机多媒体系统处理后摄取照片。
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3.统计学方法：利用微机内的分析系统对细胞数、细胞面积及形态进行综合分析(方差分析和t检验)。结果
1.上皮细胞层：表层扁平上皮细胞的边缘发亮,细胞核清晰可见(图1),偶见黑区及少量的翼状细胞。表层上皮细胞的面积、细胞密度，3组之间比较差异无显著性(F1=1.613, F2=1.821, P>0.05)。上皮基底细胞也有一发亮的细胞边界,细胞大部分呈多边形,大小均等,细胞之间连接紧密,无黑区出现 (图2)。上皮基底细胞的面积、细胞密度，各年龄组之间差异无显著性(F3=2.496, F4=2.912, P>0.05)。各年龄组具体分布见表1。
2.Bowman膜：在共焦显微镜下无形态及结构,仅见上皮下的神经纤维丛(图3)。
3.基质细胞层：在图像的暗背景下被衬托出发亮的细胞核,核间有不定形的黑色背景分割。细胞核的形态为成骨细胞状、纺锤状及椭圆形,窥不清细胞胞浆、细胞边缘及板层胶原。基质细胞的密度以Bowman膜下的最高(图4)。由表1可见，A组与B、C组之间的前基质细胞密度差异有显著性(F5=3.641,qAB=4.51, qAC=2.49, P<0.05)，B、C组间前基质细胞密度差异无显著性(qBC=2.48, P>0.05)。近后弹力层的深基质密度降低(图5),由表1可见。A组与B、C组之间的后基质细胞密度差异有显著性(F6=4.12, qAB=3.81, qAC=5.12, P<0.05)，B、C组间后基质细胞密度差异无显著性(qBC=3.22, P>0.05)。各年龄组内前基质细胞与后基质细胞之间差异有显著性(tA=2.89, tB=3.135, tC=2.92, P<0.01)。另外，在前中基质层可见粗大的分支状的神经干。
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4.Descemet膜：共焦显微镜的焦距一半在后角膜基质细胞,另一半在内皮细胞层时,二者之间即为后弹力层,但此膜无细胞结构。
5.内皮细胞层：边缘显黑色,细胞体发亮的图像。与角膜内皮镜检查时的细胞形态相同，细胞密度越大者,六边形形态规则占的比例越大;反之,细胞六边形越少,不规则形细胞比例增大(图6)。由表1可见，A组与B、C组细胞密度之间差异有显著性(F7=8.19，P<0.01)。
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图1 角膜表层上皮细胞，细胞边缘发亮，细胞核清晰可见(箭头)共焦显微镜×40/0.75W 图2 角膜上皮基底细胞,细胞呈多边形,大小均等 共焦显微镜×40/0.75W 图3 前弹力层无细胞结构,大理上皮下神经纤维丛(箭头) 共焦显微镜×40/0.75W 图4 角膜前基质细胞,仅见细胞核,窥不清胞浆及周围细胞边界(箭头),细胞密度1450个mm2 共焦显微镜×40/0.75W 图5 角膜后基质细胞,细胞密度890个mm2 共焦显微镜×40/0.75W 图6 角膜内皮细胞,细胞边缘发黑,胞体较亮,细胞间连接紧密 共焦显微镜×40/0.75W
作者单位：谢立信(266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所)
史伟云(266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所)
郭萍(266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所)
, 百拇医药
袁风波(266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所)
李绍伟(266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所)
参考文献
1，Cavanagh HD, Jester JV, Essepian J, et al. Confocal microscopy of the living eye.CLAO J,1990,16:65-73.
2，Kauffmann T,Bodanowitz S,Hrle S. In vivo study of corneal basal cell density in healthy human eyes and after photorefractive keratectomy(PRK) using a confocal videomicroscope. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1996,37 ARVO Suppl:S61.
, 百拇医药
3，Petroll WM, Boettcher K, Barry P, et al. Quantitative assessment of anteroposterior keratocyte density in the normal rabbit cornea. Cornea, 1995,14:3-9.
4，Poole CA,Brookes NH, Clover GM. Keratocyte networks visualised in the living cornea using vital dyes. J Cell Sci,1993,106(Pt 2):685-691.
5，Moller-Pedersen T, Ehlers N.A three-dimensional study of the human corneal keratocyte density .Curr Eye Res,1995,14:459-464.
6，Masters BR, Thaer AA. Real-time scanning slit confocal microscopy of the in vivo human cornea. Appl Optics, 1994,33:695-701.
7，谢立信，袁南勇，李勤新. 正常人角膜内皮细胞的内皮显微镜观察. 中华眼科杂志，1985，21：354-357., 百拇医药
摘 要 目的 用共焦显微镜对正常人活体角膜各层组织结构进行观察和分析。方法 60例(120只眼)正常人角膜分为3组。A组：5～14岁, 20例(40只眼); B组：15～45岁，22例(44只眼)；C组：46～70岁，18例(36只眼) 。共焦显微镜检查的各层角膜图像均被记录，并对各层组织细胞形态、细胞密度及面积的结果进行分析。结果 各层角膜细胞的面积和密度与性别和眼别无差异，B组和C组之间无差异。角膜表层上皮细胞和基底细胞的面积及密度3组间比较差异无显著性(P>0.05)。前弹力层处仅见上皮下神经丛。各年龄组内前基质细胞密度与后基质细胞密度比较差异有显著性(P<0.01)。A组前基质细胞密度与B、C组前基质细胞密度比较差异有显著性(P<0.05)。A组后基质细胞密度与B、C组后基质细胞密度比较差异有显著性(P<0.05)。内皮细胞的面积和密度A组与B、C组比较差异有显著性(P<0.01)。结论 共焦显微镜能观察到活体角膜各层细胞的形态及变化，提示角膜基质细胞、内皮细胞随年龄增大而密度下降，为临床提供有用的解剖学基础，对角膜病的研究和临床诊断方面将是十分有用的工具。
, 百拇医药
关键词：显微镜检查，共焦；角膜；活体解剖
传统的角膜组织学观察,是对角膜标本固定染色后所见的结果。而活体观察的结果知之甚少。如裂隙灯显微镜,因其低分辨率和低放大率而不能观察到角膜各层的细胞变化。活体角膜组织细胞学的变化,在角膜病的基础研究与临床诊断方面有重要作用。1990年Cavanagh等[1]首次将共焦显微镜应用于角膜病的检查和诊断,使对活体角膜组织细胞观察成为可能。现将我院对不同年龄受检者的角膜各层组织细胞形态及密度观察结果,报告如下。
资料和方法
1.临床资料:60例正常人,裂隙灯显微镜检查无眼部炎症,无外伤史及戴接触镜史,角膜透明，眼前节组织正常。按年龄分为3组：A组：5～14岁,20例(40只眼)；B组：15～45岁,22例(44只眼)；C组：46～70岁,18例(36只眼)。
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表1 各年龄组正常人角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞面积和密度均值分布(
±s)年龄组
眼数
表层上皮细胞
上皮基底细胞
前基质细胞
后基质细胞
内皮细胞
平均面积
(μm2)
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平均密度
(个/mm2)
平均面积
(μm2)
平均密度
(个/mm2)
平均密度
(个/mm2)
平均密度
(个/mm2)
平均面积
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(μm2)
平均密度
(个/mm2)
A组( 5～14岁)
40
923±316
1 175±280
152±45
5 780±525
1 480±210
860±210
260±50
, 百拇医药
3 605±320
B组(15～45岁)
44
950±300
1 100±300
185±25
5 680±280
1 020±190
600±120
360±70
2 807±310
C组(46～70岁)
, http://www.100md.com
36
913±306
1 223±360
177±21
5 650±420
1 100±200
625±115
425±80
2 700±200
2.共焦显微镜检查方法:受检眼用0.4%盐酸丁氧普鲁卡因液表麻，钢丝开睑器开睑。受检者下颌放在检查托上,前额与检查托的头带接触,以保持头位正。在共焦显微镜(日本Tomey公司)的水浸式锥状物镜(Achraplan,40/0.75W)表面涂上眼用胶(Vidisic-Gel),开启共焦显微镜的微机及录像系统后，调节镜头使其通过眼用胶与角膜接触，镜头与角膜上皮的距离为1.98 mm，并通过镜头调节器调整其前后左右运动。角膜各层的扫描图像可以通过电脑显示器同步显示，同时也被S-VHS 录像机记录。每个受检者，每次均行角膜中央区和周边区的两点检测。检查结束后选择有价值的较为清晰的图像存入电脑中，再转输入磁盘，经计算机多媒体系统处理后摄取照片。
, http://www.100md.com
3.统计学方法：利用微机内的分析系统对细胞数、细胞面积及形态进行综合分析(方差分析和t检验)。结果
1.上皮细胞层：表层扁平上皮细胞的边缘发亮,细胞核清晰可见(图1),偶见黑区及少量的翼状细胞。表层上皮细胞的面积、细胞密度，3组之间比较差异无显著性(F1=1.613, F2=1.821, P>0.05)。上皮基底细胞也有一发亮的细胞边界,细胞大部分呈多边形,大小均等,细胞之间连接紧密,无黑区出现 (图2)。上皮基底细胞的面积、细胞密度，各年龄组之间差异无显著性(F3=2.496, F4=2.912, P>0.05)。各年龄组具体分布见表1。
2.Bowman膜：在共焦显微镜下无形态及结构,仅见上皮下的神经纤维丛(图3)。
3.基质细胞层：在图像的暗背景下被衬托出发亮的细胞核,核间有不定形的黑色背景分割。细胞核的形态为成骨细胞状、纺锤状及椭圆形,窥不清细胞胞浆、细胞边缘及板层胶原。基质细胞的密度以Bowman膜下的最高(图4)。由表1可见，A组与B、C组之间的前基质细胞密度差异有显著性(F5=3.641,qAB=4.51, qAC=2.49, P<0.05)，B、C组间前基质细胞密度差异无显著性(qBC=2.48, P>0.05)。近后弹力层的深基质密度降低(图5),由表1可见。A组与B、C组之间的后基质细胞密度差异有显著性(F6=4.12, qAB=3.81, qAC=5.12, P<0.05)，B、C组间后基质细胞密度差异无显著性(qBC=3.22, P>0.05)。各年龄组内前基质细胞与后基质细胞之间差异有显著性(tA=2.89, tB=3.135, tC=2.92, P<0.01)。另外，在前中基质层可见粗大的分支状的神经干。
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4.Descemet膜：共焦显微镜的焦距一半在后角膜基质细胞,另一半在内皮细胞层时,二者之间即为后弹力层,但此膜无细胞结构。
5.内皮细胞层：边缘显黑色,细胞体发亮的图像。与角膜内皮镜检查时的细胞形态相同，细胞密度越大者,六边形形态规则占的比例越大;反之,细胞六边形越少,不规则形细胞比例增大(图6)。由表1可见，A组与B、C组细胞密度之间差异有显著性(F7=8.19，P<0.01)。
, 百拇医药
图1 角膜表层上皮细胞，细胞边缘发亮，细胞核清晰可见(箭头)共焦显微镜×40/0.75W 图2 角膜上皮基底细胞,细胞呈多边形,大小均等 共焦显微镜×40/0.75W 图3 前弹力层无细胞结构,大理上皮下神经纤维丛(箭头) 共焦显微镜×40/0.75W 图4 角膜前基质细胞,仅见细胞核,窥不清胞浆及周围细胞边界(箭头),细胞密度1450个mm2 共焦显微镜×40/0.75W 图5 角膜后基质细胞,细胞密度890个mm2 共焦显微镜×40/0.75W 图6 角膜内皮细胞,细胞边缘发黑,胞体较亮,细胞间连接紧密 共焦显微镜×40/0.75W
作者单位：谢立信(266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所)
史伟云(266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所)
郭萍(266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所)
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袁风波(266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所)
李绍伟(266071 青岛，山东省医学科学院眼科研究所)
参考文献
1，Cavanagh HD, Jester JV, Essepian J, et al. Confocal microscopy of the living eye.CLAO J,1990,16:65-73.
2，Kauffmann T,Bodanowitz S,Hrle S. In vivo study of corneal basal cell density in healthy human eyes and after photorefractive keratectomy(PRK) using a confocal videomicroscope. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1996,37 ARVO Suppl:S61.
, 百拇医药
3，Petroll WM, Boettcher K, Barry P, et al. Quantitative assessment of anteroposterior keratocyte density in the normal rabbit cornea. Cornea, 1995,14:3-9.
4，Poole CA,Brookes NH, Clover GM. Keratocyte networks visualised in the living cornea using vital dyes. J Cell Sci,1993,106(Pt 2):685-691.
5，Moller-Pedersen T, Ehlers N.A three-dimensional study of the human corneal keratocyte density .Curr Eye Res,1995,14:459-464.
6，Masters BR, Thaer AA. Real-time scanning slit confocal microscopy of the in vivo human cornea. Appl Optics, 1994,33:695-701.
7，谢立信，袁南勇，李勤新. 正常人角膜内皮细胞的内皮显微镜观察. 中华眼科杂志，1985，21：354-357., 百拇医药