P16蛋白和视网膜母细胞瘤蛋白在106例患者肺癌组织中的表达
P16蛋白和视网膜母细胞瘤蛋白在106例患者肺癌组织中的表达
秦建文 陈光瑾 王新允
摘 要 目的 探讨P16和视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白表达与肺癌细胞增殖的关系及其临床意义。方法 应用免疫组化技术检测了66例非小细胞肺癌(NSCLC)和40例小细胞肺癌(SCLC)患者肺癌组织中P16蛋白和Rb蛋白表达。结果 NSCLC中P16蛋白与Rb蛋白的表达呈显著负相关(χ2=10.52，P<0.01)。P16蛋白或Rb蛋白的表达与肺癌分期、分化程度、病理分型、淋巴结转移无明显相关(P>0.05)。SCLC中Rb蛋白表达的缺失率(78%)与NSCLC(21%)比较，差异有显著性(χ2 =32.3，P<0.01)。结论 Rb蛋白在SCLC中的高缺失率使之可能成为SCLC诊断的重要参考指标。 在NSCLC中P16蛋白与Rb蛋白的表达呈负相关，进一步证实了在G1期调节过程中P16与Rb之间存在着负反馈环路。
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关键词：肺癌；P16；视网膜母细胞瘤
近年来研究[1，2]表明，P16和视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白在多种肿瘤中均存在不同程度的缺失，在肺癌中的表达缺失亦有报道[3]。但对二者在调节肿瘤细胞增殖过程中的相互关系尚未有统一认识，尤其在小细胞肺癌(SCLC)中的表达报道甚少[4]。我们应用免疫组化技术检测106例原发性支气管肺癌患者组织中P16和Rb蛋白的表达，并结合临床病理多项指标进行综合分析，探讨P16和Rb在肺癌发生发展中的作用及其临床意义，从而为今后的肺癌基因治疗提供理论依据。
材料与方法
一、材料
106例原发性支气管肺癌标本取自天津医科大学总医院1988～1997年门诊和住院患者。活组织检查(活检)标本30例，手术标本76例。患者中男68例，女38例，年龄(57±11)岁。其中非小细胞肺癌(NSCLC)66例(鳞癌32例，腺癌34例；活检20例，手术标本46例)，小细胞肺癌40例。临床分期根据1997年第八届国际肺癌大会公布的TNM分类标准[5]，仅统计手术切除病例并结合术前和术后资料进行综合分析，NSCLC Ⅰ期14例，Ⅱ期18例，Ⅲ期14例。淋巴结转移情况仅统计NSCLC手术切除标本有明确病理诊断的病例，淋巴结转移阳性22例，阴性18例。术前均未经放、化疗。10例正常肺组织取自1998年4～11月天津胸科医院手术切除的肺组织，均经组织病理学检查证实。
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链霉卵白素-过氧化酶(SP)试剂盒购于北京中山生物技术公司。其包括封闭用山羊血清，生物素标记二抗，辣根酶标记链霉卵白素，一抗P16抗体为兔抗人多克隆抗体，克隆号M-156，使用浓度为1∶150。Rb抗体为兔抗人多克隆抗体，克隆号C-15，使用浓度为1∶150。均为美国Santa Cruz公司产品。
二 、方法
1.标本制备：标本于术后即经10%中性甲醛液固定，56 ℃石蜡包埋，每例石蜡标本作连续切片，制成4 μm厚备染。每例标本均选出一张进行苏木素染色，经病理医师在未知先前诊断的情况下进行复诊核实。
2.免疫组化链菌素亲生物蛋白过氧化酶连接法(SP法)：标本经过脱蜡至水，热平台抗原修复加热至92～98 ℃，保持10 min，1∶20正常羊血清封闭湿盒内，室温30 min，加一抗湿盒4 ℃过夜，次日恢复室温40 min，滴加二抗(1∶200)，室温1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素(1∶100)，室温1 h，二氨基联苯胺显色，以阳性片显色强度进行染色时间控制，苏木素复染，脱水透明，封片。
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3.实验对照：以正常血清取代第一抗体作替代对照，以生理盐水替代一抗作空白对照，以已知有P16 、Rb蛋白表达的宫颈粘膜切片作为阳性对照。
4.染色结果判定：P16阳性染色为胞质或胞核棕黄色颗粒沉着，Rb染色阳性为胞核棕黄色颗粒沉着，阴性切片无阳性物质出现。
5.统计学处理：应用χ2 检验和确切概率法。
结果
10例正常肺组织P16、Rb蛋白表达均未见缺失。
一、NSCLC组织中P16、Rb蛋白的表达及其与NSCLC临床病理特征的关系
NSCLC中P16蛋白表达的缺失率为45%(30/66)，Rb蛋白表达的缺失率为21%(14/66)，两种蛋白的表达与肺癌病理分型、分化程度、分期及淋巴结转移均无相关性(表1，图1，2)。
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二、P16、Rb蛋白表达在NSCLC与SCLC中的比较
Rb蛋白的表达在NSCLC与SCLC中差异有显著性(χ2=32.3，P<0.01)，即SCLC组Rb蛋白的表达缺失率显著高于NSCLC组。P16蛋白在NSCLC中的表达缺失率略高于SCLC组，但统计学上差异无显著性(χ2=2.486，P>0.05，表2)。
表1 NSCLC临床病理特征与P16、Rb蛋白表达的关系
类别
例数
P16蛋白表达
Rb蛋白表达
阴性例数
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缺失率(%)
阴性例数
缺失率(%)
病理类型
鳞癌
32
15
47
8
25
腺癌
34
15
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44
6
18
分化程度
高分化
12
6
50
3
25
中分化
27
14
52
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3
11
低分化
27
10
37
8
30
分期
Ⅰ期
14
8
57
3
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21
Ⅱ～Ⅲ期
32
16
50
6
19
淋巴结转移
阳性
22
11
50
4
22
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阴性
18
12
67
2
9
注：经χ2检验或确切概率法检验，P均>0.05表2 P16、Rb蛋白表达在NSCLC与SCLC中的比较
肺癌类型
例数
P16蛋白表达
Rb蛋白表达
阴性例数
, 百拇医药
缺失率(%)
阴性例数
缺失率(%)
NSCLC
66
30
45
14
21
SCLC
40
12
30
, 百拇医药
31
78
三、NSCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性
NSCLC组织中P16、Rb蛋白表达具有明显负相关(χ2=10.25，P<0.01，表3)。表3 NSCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性(例数)
Rb蛋白
P16蛋白
合计
阳性
阴性
阳性
23
, 百拇医药
29
52
阴性
13
1
14
合计
36
30
66
四、SCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性
SCLC组织中P16、Rb蛋白表达无明显相关性(χ2=1.154，P>0.05，表4)。表4 SCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性(例数)
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Rb蛋白
P16蛋白
合计
阳性
阴性
阳性
5
4
9
阴性
23
8
31
合计
, 百拇医药
28
12
40
讨论
随着分子生物学和分子遗传学对肿瘤研究的进一步深入，人们越来越注意到细胞增殖周期失调在肿瘤发生发展中的作用。细胞周期G1→S→G2→M期的进展需要一些“起始”和“终止”信号实施调控。真核细胞周期的控制有赖于细胞周期素依赖性激酶(CDK)的顺序活化以调节周期中各时相的转换。在细胞周期中，从G1～S期的转变关系到整个细胞周期的启动，目前发现G1期的调节因子与癌变关系最为密切，因此，对G1期启动点的研究已成为当今热点。在G1期启动点的调节过程中，正调控因子目前已知有CyclinD1，CDK4等，负调控因子有P16、P53、P21等[1]。在正常细胞周期G1期，CyclinD1与CDK4结合使CDK4被激活，作用于Rb基因产物使其磷酸化，去除了其阻碍细胞周期的作用，使与Rb基因产物结合的转录因子E2F释放出来，细胞即由G1期过渡到S期[2]。P16蛋白可竞争性结合CDK4，使其保持失活状态，从而抑制Rb蛋白的磷酸化 ，阻止细胞周期的进行。 Tam 等[6]研究发现，磷酸化的Rb蛋白通过释放E2F不仅能促进细胞由G1期进入S期，还促进P16的转录，进而抑制CDK4的活性。因此推断P16、Rb与CyclinD1-CDK4之间存在负反馈环路，对细胞由G1期进入S期起调控作用。
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本组研究发现，NSCLC组织中P16蛋白表达缺失率为45%，Rb蛋白表达缺失率为21%，与国外文献报道一致[3]，P16与Rb的表达呈显著负相关，进一步证实了p16、Rb两种基因通过同一路径起作用，它们之间存在负反馈调节机制。Rb蛋白的失活导致P16蛋白表达的增加，与Shapiro等[4]的研究结果一致。他对9例Rb蛋白阳性的NSCLC细胞株进行检测，发现6例P16蛋白缺失，另3例显示了较低水平。但是，p16基因失活为什么仅发生在Rb蛋白阳性的肿瘤中，目前机制尚不清楚，还需进一步研究。
在观察P16蛋白表达与肺癌临床病理特征时发现，P16蛋白的表达与肺癌病理分型、分期、分化程度、淋巴结转移无关。这一点与有些作者的研究结果不一致。Okamoto等[7]报道，检测25例原发性NSCLC和22例转移性NSCLC，发现只有6例转移性NSCLC p16基因突变，提示p16基因失活在NSCLC中属于迟发事件。本组研究与Sakaguchi等[8]的研究结果一致。推测这种基因与蛋白研究结果的分歧可能与DNA甲基化等有关，即在发生p16基因改变之前即可有转录以上水平的失活存在。
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另外Shapiro等[4]对5例Rb蛋白阴性的SCLC细胞株进行检测，均发现p16基因的高水平表达，5例SCLC原发肿瘤中检测到4例存在p16基因的高水平表达。
本组结果发现，P16蛋白在SCLC组织中的缺失率为30%， Rb蛋白缺失率为78%，略低于Shimizu等[9]报道的Rb缺失率(88%)。Rb蛋白缺失率在SCLC中明显高于NSCLC。SCLC中P16蛋白缺失率低于NSCLC，但统计学差异无显著性。可见Rb在SCLC与NSCLC中所起的作用可能不同。SCLC中未发现P16与Rb蛋白表达的相关性，在Rb蛋白表达阴性的31例SCLC中，23例P16蛋白表达阳性，8例P16蛋白表达阴性。但这并不否认其基因水平的负反馈调节环路存在的可能。
综上所述Rb蛋白的检测有可能成为SCLC诊断的重要参考指标。我们推测在p16或Rb基因转录以上水平存在某些调节机制，导致p16或Rb的失活。因此，在SCLC中我们还有大量的研究工作要进行，从不同水平揭示其与SCLC发生、发展的关系，为今后基因治疗的发展打下良好理论基础。
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图1 低分化腺癌中免疫组化P16染色胞浆呈棕黄色 SP ×200
图2 高分化腺癌中免疫组化Rb
染色胞核呈棕黄色 SP ×200
作者单位：秦建文(300051 天津胸科医院胸内科)
陈光谨(天津总医院呼吸科)
王新允(天津医科大学病理教研室)
参考文献
1.Matthias P, Ira H. Joining the complex: cyclin-dependent kinase inhibitory protein and the cell cycle . Cell,1994,79 : 181-184.
, 百拇医药
2.Benassi MS, Molendini L, Gamber G,et al. Altered G1 phase regulation in osteosarcoma. Int J Cancer,1997,74:518-522.
3.Kratzke RA, Greatens TM, Rubins JB,et al .Rb and p16INK4A expression in resected non-small cell lung tumor .Cancer Res ,1996,56:3415-3420.
4.Shapiro GI, Edwands CD, Kobzik L,et al .Resiprocal Rb inactivation and p16INK4 expression in primary lung cancers and cell line. Cancer Res, 1995,55:505-509.
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5.吴一龙.非小细胞肺癌国际分期的修订和现代治疗策略.国外医学肿瘤学分册,1998,25:353-356.
6.Tam SW, Shay JW, Pagano M,et al.Differential expression and cell cycle regulation of the cyclin-dependent kinase 4 inhibitor p16INK4. Cancer Res , 1994, 54 : 5816-5820.
7.Okamoto A, Hussain SP, Hagiwara K,et al.Mutation in the p16INKN2 /MTS1/CDKN2. p15INK4B /MTS2 and p18 genes in primary and metastatic lung cancer. Cancer Res, 1995,55: 1448-1451.
, 百拇医药
8.Sakaguchi M,Fujii Y, Airabayashi H,et al.Inversely correlated expression of P16 and Rb protein in non-small cell lung cancers :an immunohistochemical study.In J Cancer,1996,65:442-445.
9.Shimizu E ,Coxon A,Otterson GA,et al. Rb protein status and clinical correlation from 171 cell lines representing lung cancer ,extrapulmonary small cell carcinoma and mesothlioma.Oncogene,1994,9:2441-2448., http://www.100md.com
秦建文 陈光瑾 王新允
摘 要 目的 探讨P16和视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白表达与肺癌细胞增殖的关系及其临床意义。方法 应用免疫组化技术检测了66例非小细胞肺癌(NSCLC)和40例小细胞肺癌(SCLC)患者肺癌组织中P16蛋白和Rb蛋白表达。结果 NSCLC中P16蛋白与Rb蛋白的表达呈显著负相关(χ2=10.52，P<0.01)。P16蛋白或Rb蛋白的表达与肺癌分期、分化程度、病理分型、淋巴结转移无明显相关(P>0.05)。SCLC中Rb蛋白表达的缺失率(78%)与NSCLC(21%)比较，差异有显著性(χ2 =32.3，P<0.01)。结论 Rb蛋白在SCLC中的高缺失率使之可能成为SCLC诊断的重要参考指标。 在NSCLC中P16蛋白与Rb蛋白的表达呈负相关，进一步证实了在G1期调节过程中P16与Rb之间存在着负反馈环路。
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关键词：肺癌；P16；视网膜母细胞瘤
近年来研究[1，2]表明，P16和视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白在多种肿瘤中均存在不同程度的缺失，在肺癌中的表达缺失亦有报道[3]。但对二者在调节肿瘤细胞增殖过程中的相互关系尚未有统一认识，尤其在小细胞肺癌(SCLC)中的表达报道甚少[4]。我们应用免疫组化技术检测106例原发性支气管肺癌患者组织中P16和Rb蛋白的表达，并结合临床病理多项指标进行综合分析，探讨P16和Rb在肺癌发生发展中的作用及其临床意义，从而为今后的肺癌基因治疗提供理论依据。
材料与方法
一、材料
106例原发性支气管肺癌标本取自天津医科大学总医院1988～1997年门诊和住院患者。活组织检查(活检)标本30例，手术标本76例。患者中男68例，女38例，年龄(57±11)岁。其中非小细胞肺癌(NSCLC)66例(鳞癌32例，腺癌34例；活检20例，手术标本46例)，小细胞肺癌40例。临床分期根据1997年第八届国际肺癌大会公布的TNM分类标准[5]，仅统计手术切除病例并结合术前和术后资料进行综合分析，NSCLC Ⅰ期14例，Ⅱ期18例，Ⅲ期14例。淋巴结转移情况仅统计NSCLC手术切除标本有明确病理诊断的病例，淋巴结转移阳性22例，阴性18例。术前均未经放、化疗。10例正常肺组织取自1998年4～11月天津胸科医院手术切除的肺组织，均经组织病理学检查证实。
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链霉卵白素-过氧化酶(SP)试剂盒购于北京中山生物技术公司。其包括封闭用山羊血清，生物素标记二抗，辣根酶标记链霉卵白素，一抗P16抗体为兔抗人多克隆抗体，克隆号M-156，使用浓度为1∶150。Rb抗体为兔抗人多克隆抗体，克隆号C-15，使用浓度为1∶150。均为美国Santa Cruz公司产品。
二 、方法
1.标本制备：标本于术后即经10%中性甲醛液固定，56 ℃石蜡包埋，每例石蜡标本作连续切片，制成4 μm厚备染。每例标本均选出一张进行苏木素染色，经病理医师在未知先前诊断的情况下进行复诊核实。
2.免疫组化链菌素亲生物蛋白过氧化酶连接法(SP法)：标本经过脱蜡至水，热平台抗原修复加热至92～98 ℃，保持10 min，1∶20正常羊血清封闭湿盒内，室温30 min，加一抗湿盒4 ℃过夜，次日恢复室温40 min，滴加二抗(1∶200)，室温1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素(1∶100)，室温1 h，二氨基联苯胺显色，以阳性片显色强度进行染色时间控制，苏木素复染，脱水透明，封片。
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3.实验对照：以正常血清取代第一抗体作替代对照，以生理盐水替代一抗作空白对照，以已知有P16 、Rb蛋白表达的宫颈粘膜切片作为阳性对照。
4.染色结果判定：P16阳性染色为胞质或胞核棕黄色颗粒沉着，Rb染色阳性为胞核棕黄色颗粒沉着，阴性切片无阳性物质出现。
5.统计学处理：应用χ2 检验和确切概率法。
结果
10例正常肺组织P16、Rb蛋白表达均未见缺失。
一、NSCLC组织中P16、Rb蛋白的表达及其与NSCLC临床病理特征的关系
NSCLC中P16蛋白表达的缺失率为45%(30/66)，Rb蛋白表达的缺失率为21%(14/66)，两种蛋白的表达与肺癌病理分型、分化程度、分期及淋巴结转移均无相关性(表1，图1，2)。
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二、P16、Rb蛋白表达在NSCLC与SCLC中的比较
Rb蛋白的表达在NSCLC与SCLC中差异有显著性(χ2=32.3，P<0.01)，即SCLC组Rb蛋白的表达缺失率显著高于NSCLC组。P16蛋白在NSCLC中的表达缺失率略高于SCLC组，但统计学上差异无显著性(χ2=2.486，P>0.05，表2)。
表1 NSCLC临床病理特征与P16、Rb蛋白表达的关系
类别
例数
P16蛋白表达
Rb蛋白表达
阴性例数
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缺失率(%)
阴性例数
缺失率(%)
病理类型
鳞癌
32
15
47
8
25
腺癌
34
15
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44
6
18
分化程度
高分化
12
6
50
3
25
中分化
27
14
52
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3
11
低分化
27
10
37
8
30
分期
Ⅰ期
14
8
57
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21
Ⅱ～Ⅲ期
32
16
50
6
19
淋巴结转移
阳性
22
11
50
4
22
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阴性
18
12
67
2
9
注：经χ2检验或确切概率法检验，P均>0.05表2 P16、Rb蛋白表达在NSCLC与SCLC中的比较
肺癌类型
例数
P16蛋白表达
Rb蛋白表达
阴性例数
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缺失率(%)
阴性例数
缺失率(%)
NSCLC
66
30
45
14
21
SCLC
40
12
30
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31
78
三、NSCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性
NSCLC组织中P16、Rb蛋白表达具有明显负相关(χ2=10.25，P<0.01，表3)。表3 NSCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性(例数)
Rb蛋白
P16蛋白
合计
阳性
阴性
阳性
23
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29
52
阴性
13
1
14
合计
36
30
66
四、SCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性
SCLC组织中P16、Rb蛋白表达无明显相关性(χ2=1.154，P>0.05，表4)。表4 SCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性(例数)
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Rb蛋白
P16蛋白
合计
阳性
阴性
阳性
5
4
9
阴性
23
8
31
合计
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28
12
40
讨论
随着分子生物学和分子遗传学对肿瘤研究的进一步深入，人们越来越注意到细胞增殖周期失调在肿瘤发生发展中的作用。细胞周期G1→S→G2→M期的进展需要一些“起始”和“终止”信号实施调控。真核细胞周期的控制有赖于细胞周期素依赖性激酶(CDK)的顺序活化以调节周期中各时相的转换。在细胞周期中，从G1～S期的转变关系到整个细胞周期的启动，目前发现G1期的调节因子与癌变关系最为密切，因此，对G1期启动点的研究已成为当今热点。在G1期启动点的调节过程中，正调控因子目前已知有CyclinD1，CDK4等，负调控因子有P16、P53、P21等[1]。在正常细胞周期G1期，CyclinD1与CDK4结合使CDK4被激活，作用于Rb基因产物使其磷酸化，去除了其阻碍细胞周期的作用，使与Rb基因产物结合的转录因子E2F释放出来，细胞即由G1期过渡到S期[2]。P16蛋白可竞争性结合CDK4，使其保持失活状态，从而抑制Rb蛋白的磷酸化 ，阻止细胞周期的进行。 Tam 等[6]研究发现，磷酸化的Rb蛋白通过释放E2F不仅能促进细胞由G1期进入S期，还促进P16的转录，进而抑制CDK4的活性。因此推断P16、Rb与CyclinD1-CDK4之间存在负反馈环路，对细胞由G1期进入S期起调控作用。
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本组研究发现，NSCLC组织中P16蛋白表达缺失率为45%，Rb蛋白表达缺失率为21%，与国外文献报道一致[3]，P16与Rb的表达呈显著负相关，进一步证实了p16、Rb两种基因通过同一路径起作用，它们之间存在负反馈调节机制。Rb蛋白的失活导致P16蛋白表达的增加，与Shapiro等[4]的研究结果一致。他对9例Rb蛋白阳性的NSCLC细胞株进行检测，发现6例P16蛋白缺失，另3例显示了较低水平。但是，p16基因失活为什么仅发生在Rb蛋白阳性的肿瘤中，目前机制尚不清楚，还需进一步研究。
在观察P16蛋白表达与肺癌临床病理特征时发现，P16蛋白的表达与肺癌病理分型、分期、分化程度、淋巴结转移无关。这一点与有些作者的研究结果不一致。Okamoto等[7]报道，检测25例原发性NSCLC和22例转移性NSCLC，发现只有6例转移性NSCLC p16基因突变，提示p16基因失活在NSCLC中属于迟发事件。本组研究与Sakaguchi等[8]的研究结果一致。推测这种基因与蛋白研究结果的分歧可能与DNA甲基化等有关，即在发生p16基因改变之前即可有转录以上水平的失活存在。
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另外Shapiro等[4]对5例Rb蛋白阴性的SCLC细胞株进行检测，均发现p16基因的高水平表达，5例SCLC原发肿瘤中检测到4例存在p16基因的高水平表达。
本组结果发现，P16蛋白在SCLC组织中的缺失率为30%， Rb蛋白缺失率为78%，略低于Shimizu等[9]报道的Rb缺失率(88%)。Rb蛋白缺失率在SCLC中明显高于NSCLC。SCLC中P16蛋白缺失率低于NSCLC，但统计学差异无显著性。可见Rb在SCLC与NSCLC中所起的作用可能不同。SCLC中未发现P16与Rb蛋白表达的相关性，在Rb蛋白表达阴性的31例SCLC中，23例P16蛋白表达阳性，8例P16蛋白表达阴性。但这并不否认其基因水平的负反馈调节环路存在的可能。
综上所述Rb蛋白的检测有可能成为SCLC诊断的重要参考指标。我们推测在p16或Rb基因转录以上水平存在某些调节机制，导致p16或Rb的失活。因此，在SCLC中我们还有大量的研究工作要进行，从不同水平揭示其与SCLC发生、发展的关系，为今后基因治疗的发展打下良好理论基础。
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图1 低分化腺癌中免疫组化P16染色胞浆呈棕黄色 SP ×200
图2 高分化腺癌中免疫组化Rb
染色胞核呈棕黄色 SP ×200
作者单位：秦建文(300051 天津胸科医院胸内科)
陈光谨(天津总医院呼吸科)
王新允(天津医科大学病理教研室)
参考文献
1.Matthias P, Ira H. Joining the complex: cyclin-dependent kinase inhibitory protein and the cell cycle . Cell,1994,79 : 181-184.
, 百拇医药
2.Benassi MS, Molendini L, Gamber G,et al. Altered G1 phase regulation in osteosarcoma. Int J Cancer,1997,74:518-522.
3.Kratzke RA, Greatens TM, Rubins JB,et al .Rb and p16INK4A expression in resected non-small cell lung tumor .Cancer Res ,1996,56:3415-3420.
4.Shapiro GI, Edwands CD, Kobzik L,et al .Resiprocal Rb inactivation and p16INK4 expression in primary lung cancers and cell line. Cancer Res, 1995,55:505-509.
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6.Tam SW, Shay JW, Pagano M,et al.Differential expression and cell cycle regulation of the cyclin-dependent kinase 4 inhibitor p16INK4. Cancer Res , 1994, 54 : 5816-5820.
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