线虫死亡基因同源物在子宫内膜腺癌中的表达
线虫死亡基因同源物在子宫内膜腺癌中的表达
何畏 魏丽惠 王建六 富琪 虞幸
关键词：线虫死亡基因Ced-3同源物；子宫内膜腺癌 肿瘤的发生与机体内细胞凋亡功能障碍密不可分。作为线虫死亡基因Ced-3同源物的人类半胱天冬氨酸蛋白酶家族成员的白介素1转换酶(ICE)和半胱氨酸蛋白酶(CPP32)在细胞凋亡中所起的重要作用，近来受到广泛重视，但其在子宫内膜腺癌中表达的研究国内外尚未见报道。为探讨线虫死亡基因同源物与子宫内膜腺癌发生、发展及预后的关系，本研究应用免疫组织化学法检测了ICE 和CPP32在子宫内膜腺癌中的表达。现报道如下。
一、资料与方法
1. 研究对象：选择北京医科大学人民医院1991年至1998年收治的子宫内膜腺癌患者41例(实验组)。所有病例按1989年国际妇产科联盟的手术病理分期标准重新核对，其中Ⅰ期18例、Ⅱ期9例(Ⅰ、Ⅱ期 为早期)、Ⅲ期10例、Ⅳ期4例(Ⅲ、Ⅳ期为晚期)；病理分级G1 级18例、G2级 14例、G3级9例。41例中38例行子宫切除术(其中子宫肌层浸润深度≥1/2者13例，<1/2者25例；淋巴结有转移者4例；附件有转移者4例)；3例行诊断性刮宫术。随访时间为6～84个月，其中60个月以上者21例。另取良性妇科肿瘤患者20例(子宫肌瘤和卵巢囊肿各10例，为对照组)，其中子宫内膜增殖期10例、分泌期5例、绝经期5例。
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2. 方法：(1)试剂：ICE多克隆抗体、CPP32单克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司，p53单克隆抗体购于美国Oncogene公司。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)试剂盒为DAKO公司产品。(2)实验方法：采用免疫组织化学SP法，操作步骤按SP试剂盒说明书进行。(3)结果判断：ICE、CPP32的判定标准为，5%以上细胞胞浆内出现棕黄色颗粒或团块者为阳性，5%以下或无染色者为阴性[1]。p53的判定标准为，以细胞核内出现棕黄色颗粒或团块者为阳性，无染色者为阴性[2]。实验同时设阳性、阴性及空白对照。
3. 统计学方法：利用SAS统计软件包行配对计数资料的χ2检验和率检验。
二、结果
1.两组患者ICE的表达情况：对照组子宫内膜的ICE阳性率为55.0%，其中绝经期内膜的阳性率最高(4/5)，其次为分泌期(3/5)、增殖期(10%)；实验组ICE阳性率为19.5%，明显低于对照组(P<0.01)。子宫内膜腺癌的ICE阳性率与患者年龄、手术病理分期、病理分级、子宫肌层浸润深度及有无淋巴结和附件转移无关(P>0.05)。见表1。
, 百拇医药
表1 两组患者ICE、CPP32、p53阳性的表达情况
组别
总
例
数
ICE阳性
CPP32阳性
p53阳性
例数
百分率
(%)
例数
百分率
, http://www.100md.com
(%)
例数
百分率
(%)
对照组
20
11
55.0
12
60.0
0
0.0
实验组
, 百拇医药 41
8
19.5
13
31.7
14
34.1
年龄
<50
23
6
26.1
6
26.1
, http://www.100md.com
9
39.1
≥50
18
2
11.1
7
38.9
5
27.8
手术病理分期
早期
28
, http://www.100md.com 6
21.4
11
39.3
11
39.3
晚期
13
2
15.4
2
15.4
6
46.2
, 百拇医药
病理分级
G1级
18
5
27.8
9
50.0
3
16.7
G2、G3级
23
3
13.0
, http://www.100md.com
4
17.4
11
47.8
子宫肌层浸润深度
<1/2
25
6
24.0
11
44.0
7
28.0
, 百拇医药
≥1/2
13
2
15.4
2
15.4
7
53.8
淋巴结转移
有
4
0
0/4*
, http://www.100md.com
0
0/4*
2
2/4*
无
34
8
23.5
13
38.2
12
35.3
附件转移
, 百拇医药
有
4
1
1/4*
1
1/4*
2
2/4*
无
34
7
20.6
12
, 百拇医药
35.3
12
35.3
*例数少于10，不计百分率 2.两组患者CPP32的表达情况：对照组子宫内膜的CPP32阳性率为60.0%，明显高于实验组的31.7%(P<0.05)。子宫内膜腺癌CPP32的阳性率，G2和G3级为17.4%，明显低于G1级的50.0%(P<0.05)；但与患者年龄、手术病理分期、子宫肌层浸润深度及有无淋巴结和附件转移无关(P>0.05)。见表1。
3.两组患者p53的表达情况：对照组子宫内膜p53阳性率为0.0%，明显高于实验组的34.1%(P<0.01)。子宫内膜腺癌的p53阳性率，G2和G3级为47.8%，明显高于G1级的16.7%(P<0.05)，但与患者年龄、手术病理分期、子宫肌层浸润深度及有无淋巴结和附件转移无关(P>0.05)。见表1。 14例p53表达阳性的子宫内膜腺癌患者中，ICE阳性1例，CPP32阳性2例；27例p53表达阴性的子宫内膜腺癌患者中，ICE阳性7例，CPP32阳性11例。三、讨论
, 百拇医药
人类半胱天冬氨酸蛋白酶家族为线虫死亡基因Ced-3的蛋白同源物。该家族成员均以无活性前体形式存在，受细胞内外凋亡信号激发后，在自身或其他因子作用下于特定的天冬氨酸处被剪切为p10、p20两个亚单位，从而活化并对细胞内多种物质进行水解，最终导致典型的凋亡形态学改变。ICE能将相对分子质量为31 000的白介素1前体剪切成相对分子质量为17 000的成熟白介素1[3]。有学者认为，CPP32是哺乳动物ced-3的对应物[4]。缺乏ICE或CPP32的细胞均出现凋亡障碍，与肿瘤形成有关，同时也是肿瘤对放射治疗、化学治疗不敏感的原因之一[5]。
本研究所用的ICE抗体为抗ICE的p20亚单位C端氨基酸序列抗体，可识别人类ICE的p20亚单位；CPP32抗体可识别人类CPP32的p20亚单位。本研究结果表明，在正常子宫内膜中，ICE和CPP32阳性率均较高。提示，ICE、CPP32为子宫内膜重要的凋亡基因产物，在子宫内膜细胞的周期性增殖和凋亡中具有重要作用。高凋亡率有利于预防肿瘤的形成，这是机体抗肿瘤的重要基础。在子宫内膜癌组织中，ICE、CPP32的表达明显降低，提示细胞凋亡受到抑制，机体抗肿瘤防御机理受到严重破坏，这可能是肿瘤发生的原因之一，或是肿瘤发生的重要表现。CPP32的表达还与肿瘤病理分级有关，提示，在病理分级高的肿瘤中细胞凋亡存在更严重的缺陷。实验同时检测了p53蛋白表达情况，以探讨ICE、CPP32在子宫内膜癌中表达降低的原因。发现p53基因突变与ICE和CPP32无明显负相关。p53是否如其他作者报道的可能位于ICE、CPP32的上游，有一定的调节作用，尚有待进一步研究。
, 百拇医药
作者单位：魏丽惠(100044 北京医科大学人民医院妇科)
王建六(100044 北京医科大学人民医院妇科)
富琪(100044 北京医科大学人民医院妇科)
虞幸(100044 北京医科大学人民医院妇科)
何畏(100044 北京医科大学人民医院妇科)
何畏(重庆医科大学第一临床学院妇科)
参考文献
1，Krajewski S,Gascoyne RD,Zapata JM，et al.Immunolocalization of the ICE/Ced-3-family protease,CPP32 (Caspase-3),in non-Hodgkin′s lymphomas,chronic lymphocytic leukemias, and reactive lymph nodes.Blood,1997,89:3817-3825.
, 百拇医药
2，Inoue M, Okayama H, Fujita M， et al.Clinicopathological Characteristics of p53 overexpression in endometrial cancer. Int J Cancer，1994,58:14-19.
3，Patel T,Gores GJ, Kanfmann SH.The role of proteases during apoptosis.FASEB,1996,10:587-597.
4，Fernandes-Alnermri T, Litwack G, Alnemri ES.CPP32,a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin -1beta-converting enzyme.J Biol Chem,1994,269:30761-30764.
5，Krajewska M,Hong-Gang W,Krajewski S, et al. Immunohistochemical analysis of in vivo patters of expression of CPP32(Caspase-3),a cee death protease.Cancer，1997,57:1605-1616., 百拇医药
何畏 魏丽惠 王建六 富琪 虞幸
关键词：线虫死亡基因Ced-3同源物；子宫内膜腺癌 肿瘤的发生与机体内细胞凋亡功能障碍密不可分。作为线虫死亡基因Ced-3同源物的人类半胱天冬氨酸蛋白酶家族成员的白介素1转换酶(ICE)和半胱氨酸蛋白酶(CPP32)在细胞凋亡中所起的重要作用，近来受到广泛重视，但其在子宫内膜腺癌中表达的研究国内外尚未见报道。为探讨线虫死亡基因同源物与子宫内膜腺癌发生、发展及预后的关系，本研究应用免疫组织化学法检测了ICE 和CPP32在子宫内膜腺癌中的表达。现报道如下。
一、资料与方法
1. 研究对象：选择北京医科大学人民医院1991年至1998年收治的子宫内膜腺癌患者41例(实验组)。所有病例按1989年国际妇产科联盟的手术病理分期标准重新核对，其中Ⅰ期18例、Ⅱ期9例(Ⅰ、Ⅱ期 为早期)、Ⅲ期10例、Ⅳ期4例(Ⅲ、Ⅳ期为晚期)；病理分级G1 级18例、G2级 14例、G3级9例。41例中38例行子宫切除术(其中子宫肌层浸润深度≥1/2者13例，<1/2者25例；淋巴结有转移者4例；附件有转移者4例)；3例行诊断性刮宫术。随访时间为6～84个月，其中60个月以上者21例。另取良性妇科肿瘤患者20例(子宫肌瘤和卵巢囊肿各10例，为对照组)，其中子宫内膜增殖期10例、分泌期5例、绝经期5例。
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2. 方法：(1)试剂：ICE多克隆抗体、CPP32单克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司，p53单克隆抗体购于美国Oncogene公司。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)试剂盒为DAKO公司产品。(2)实验方法：采用免疫组织化学SP法，操作步骤按SP试剂盒说明书进行。(3)结果判断：ICE、CPP32的判定标准为，5%以上细胞胞浆内出现棕黄色颗粒或团块者为阳性，5%以下或无染色者为阴性[1]。p53的判定标准为，以细胞核内出现棕黄色颗粒或团块者为阳性，无染色者为阴性[2]。实验同时设阳性、阴性及空白对照。
3. 统计学方法：利用SAS统计软件包行配对计数资料的χ2检验和率检验。
二、结果
1.两组患者ICE的表达情况：对照组子宫内膜的ICE阳性率为55.0%，其中绝经期内膜的阳性率最高(4/5)，其次为分泌期(3/5)、增殖期(10%)；实验组ICE阳性率为19.5%，明显低于对照组(P<0.01)。子宫内膜腺癌的ICE阳性率与患者年龄、手术病理分期、病理分级、子宫肌层浸润深度及有无淋巴结和附件转移无关(P>0.05)。见表1。
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表1 两组患者ICE、CPP32、p53阳性的表达情况
组别
总
例
数
ICE阳性
CPP32阳性
p53阳性
例数
百分率
(%)
例数
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例数
百分率
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对照组
20
11
55.0
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60.0
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实验组
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19.5
13
31.7
14
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年龄
<50
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6
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≥50
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11.1
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27.8
手术病理分期
早期
28
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21.4
11
39.3
11
39.3
晚期
13
2
15.4
2
15.4
6
46.2
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病理分级
G1级
18
5
27.8
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50.0
3
16.7
G2、G3级
23
3
13.0
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4
17.4
11
47.8
子宫肌层浸润深度
<1/2
25
6
24.0
11
44.0
7
28.0
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≥1/2
13
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15.4
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15.4
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53.8
淋巴结转移
有
4
0
0/4*
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0
0/4*
2
2/4*
无
34
8
23.5
13
38.2
12
35.3
附件转移
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有
4
1
1/4*
1
1/4*
2
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无
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7
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*例数少于10，不计百分率 2.两组患者CPP32的表达情况：对照组子宫内膜的CPP32阳性率为60.0%，明显高于实验组的31.7%(P<0.05)。子宫内膜腺癌CPP32的阳性率，G2和G3级为17.4%，明显低于G1级的50.0%(P<0.05)；但与患者年龄、手术病理分期、子宫肌层浸润深度及有无淋巴结和附件转移无关(P>0.05)。见表1。
3.两组患者p53的表达情况：对照组子宫内膜p53阳性率为0.0%，明显高于实验组的34.1%(P<0.01)。子宫内膜腺癌的p53阳性率，G2和G3级为47.8%，明显高于G1级的16.7%(P<0.05)，但与患者年龄、手术病理分期、子宫肌层浸润深度及有无淋巴结和附件转移无关(P>0.05)。见表1。 14例p53表达阳性的子宫内膜腺癌患者中，ICE阳性1例，CPP32阳性2例；27例p53表达阴性的子宫内膜腺癌患者中，ICE阳性7例，CPP32阳性11例。三、讨论
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人类半胱天冬氨酸蛋白酶家族为线虫死亡基因Ced-3的蛋白同源物。该家族成员均以无活性前体形式存在，受细胞内外凋亡信号激发后，在自身或其他因子作用下于特定的天冬氨酸处被剪切为p10、p20两个亚单位，从而活化并对细胞内多种物质进行水解，最终导致典型的凋亡形态学改变。ICE能将相对分子质量为31 000的白介素1前体剪切成相对分子质量为17 000的成熟白介素1[3]。有学者认为，CPP32是哺乳动物ced-3的对应物[4]。缺乏ICE或CPP32的细胞均出现凋亡障碍，与肿瘤形成有关，同时也是肿瘤对放射治疗、化学治疗不敏感的原因之一[5]。
本研究所用的ICE抗体为抗ICE的p20亚单位C端氨基酸序列抗体，可识别人类ICE的p20亚单位；CPP32抗体可识别人类CPP32的p20亚单位。本研究结果表明，在正常子宫内膜中，ICE和CPP32阳性率均较高。提示，ICE、CPP32为子宫内膜重要的凋亡基因产物，在子宫内膜细胞的周期性增殖和凋亡中具有重要作用。高凋亡率有利于预防肿瘤的形成，这是机体抗肿瘤的重要基础。在子宫内膜癌组织中，ICE、CPP32的表达明显降低，提示细胞凋亡受到抑制，机体抗肿瘤防御机理受到严重破坏，这可能是肿瘤发生的原因之一，或是肿瘤发生的重要表现。CPP32的表达还与肿瘤病理分级有关，提示，在病理分级高的肿瘤中细胞凋亡存在更严重的缺陷。实验同时检测了p53蛋白表达情况，以探讨ICE、CPP32在子宫内膜癌中表达降低的原因。发现p53基因突变与ICE和CPP32无明显负相关。p53是否如其他作者报道的可能位于ICE、CPP32的上游，有一定的调节作用，尚有待进一步研究。
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作者单位：魏丽惠(100044 北京医科大学人民医院妇科)
王建六(100044 北京医科大学人民医院妇科)
富琪(100044 北京医科大学人民医院妇科)
虞幸(100044 北京医科大学人民医院妇科)
何畏(100044 北京医科大学人民医院妇科)
何畏(重庆医科大学第一临床学院妇科)
参考文献
1，Krajewski S,Gascoyne RD,Zapata JM，et al.Immunolocalization of the ICE/Ced-3-family protease,CPP32 (Caspase-3),in non-Hodgkin′s lymphomas,chronic lymphocytic leukemias, and reactive lymph nodes.Blood,1997,89:3817-3825.
, 百拇医药
2，Inoue M, Okayama H, Fujita M， et al.Clinicopathological Characteristics of p53 overexpression in endometrial cancer. Int J Cancer，1994,58:14-19.
3，Patel T,Gores GJ, Kanfmann SH.The role of proteases during apoptosis.FASEB,1996,10:587-597.
4，Fernandes-Alnermri T, Litwack G, Alnemri ES.CPP32,a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin -1beta-converting enzyme.J Biol Chem,1994,269:30761-30764.
5，Krajewska M,Hong-Gang W,Krajewski S, et al. Immunohistochemical analysis of in vivo patters of expression of CPP32(Caspase-3),a cee death protease.Cancer，1997,57:1605-1616., 百拇医药