重度妊娠高血压综合征患者胎盘组织中细胞凋亡及其调控基因的研究
重度妊娠高血压综合征患者胎盘组织中细胞凋亡及其调控基因的研究
李翠兰 胡章和 曹来英 刘谦
摘 要 目的 研究细胞凋亡及其调控基因在重度妊娠高血压综合征(妊高征)发生、发展中的作用。方法 对40例正常晚孕妇女(对照组)和40例重度妊高征患者(观察组)的胎盘组织进行分析。用DNA缺口原位末端标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡；免疫组织化学方法检测促进和抑制凋亡基因(bax/bcl-2)的表达。结果 对照组胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞中凋亡指数分别为(1.1±0.9)%、(41.8±1.5)%；bax阳性率分别为(1.0±0.9)%、(28.9±9.7)%；bcl-2阳性率分别为(2.2±0.8)%、(22.9±0.7)%，总bax/bcl-2为0.7～1.7。 观察组胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞的凋亡指数分别为(4.3±1.2)%、(45.3±1.4)%；bax阳性率分别是(2.2±0.8)%、(42.5±11.7)%；bcl-2阳性率分别是(3.2±0.8)%、(23.3±7.8)%；总bax/bcl-2为1.0～3.2。即：对照组胎盘中有一定量的细胞凋亡、bax、bcl-2表达，bax/bcl-2表达间呈平衡趋势；观察组中细胞凋亡明显增高(P<0.01)，bax表达也明显增强(P<0.01)，bcl-2表达仅呈增高趋势，但差异无显著性(P>0.05)，bax/bcl-2比值明显增高(P<0.01)。结论 细胞凋亡及其调节基因的表达间具有一致性；细胞凋亡、bax/bcl-2表达间的平衡与紊乱影响着正常妊娠妇女与重度妊高征患者胎盘的结构与功能，进而影响妊娠的结局。
, http://www.100md.com
关键词：妊娠并发症，心血管；高血压；脱噬作用；原癌基因蛋白质c-bcl-2
一般轻、中度妊娠高血压综合征(妊高征)对患者的影响易控制，但重度妊高征、先兆子痫、子痫病情变化莫测，是导致孕产妇及围产儿发病率和死亡率升高的重要原因[1]。我们研究胎盘细胞凋亡及bax、bcl-2基因蛋白表达，旨在从细胞与分子水平，阐述各种原因导致的重度妊高征发生、发展的机理。
资料与方法
一、 资料来源
选1998年6月～1999年6月在我院住院分娩的重度妊高征患者40例(观察组)，其中子痫13例(产前7例、产时2例、产后4例)、先兆子痫18例，孕妇平均年龄(26.3±2.5)岁，平均孕周(36.7±3.6)周；选择同期正常晚孕妇女40例为对照组，平均年龄(27.2±4.0)岁，平均孕周(38.8±2.0)周。重度妊高征的诊断标准以乐杰主编的全国统编教材《妇产科学》(第四版)为准[2]。
, 百拇医药
二、 方法
1.取材：胎盘自然娩出后，迅速选取母面中央(避开钙化、机化灶)约1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm小块，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片3张，60℃烤箱过夜后置37℃温箱保存备用，分别行DNA缺口原位末端标记(TDT-mediated dUTP biotin nick ending labeling, TUNEL)染色检测细胞凋亡、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-perioxidase,SP)法染色，检测bax、bcl-2基因蛋白的表达。
2.细胞凋亡检测：采用Gavrieli等[3] 的TUNEL方法略加修改。切片脱蜡入水，微波修复抗原，3%过氧化氢(H2O2)阻断内源性过氧化物活性，1∶10配制反应液(管1：脱氧核苷酸末端转移酶，管2：荧光素连接的核苷酸混合缓冲液)，37℃孵育1 h，PBS冲洗，加酶标抗体(管3：辣根过氧化物酶连接的荧光素抗体，POD)，37℃孵育30 min，冲洗，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，中性树胶封片，镜下观察。
, 百拇医药
3.bax、bcl-2检测：采用SP法。
以上试剂均购自福州迈新试剂公司，即用型。
4.结果判断：细胞凋亡定位于细胞核内，bax、bcl-2定位于胞膜和胞浆内，棕黄色为阳性细胞。每例随机选取10个高倍视野，分别计数凋亡指数(apoptosis indexes, AI)、bax阳性率、bcl-2阳性率。以bax 阳性率与bcl-2阳性率的比值bax/bcl-2表示促进和抑制细胞凋亡间的平衡。
三、 统计学方法
采用SPSS 统计软件包进行。组内比较用方差分析，组间比较用独立样本的t检验。
结果
一、 细胞凋亡指数
, 百拇医药 对照组胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞凋亡指数分别为(1.1±0.9)%、(41.8±1.5)%，观察组分别为(4.3±1.2)%、(45.3±1.4)%，两组比较，差异有显著性(P<0.05)。
二、 基因蛋白表达
对照组胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞bax基因蛋白表达分别为(1.0±0.9)%、(28.9±9.7)%，观察组分别为(2.2±0.8)%、(42.5±11.7)%，两组比较，差异有极显著性(P<0.01)。对照组胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞bcl-2基因蛋白表达分别为(2.2±0.8)%、(22.9±0.7)%，观察组分别为(3.2±0.8)%、(23.3±7.8)%，两组比较，差异无显著性(P>0.05)。对照组与观察组bax/bcl-2在胎盘组织中的表达分别为0.7～1.7、1.0～3.2。
讨论
一、细胞凋亡与妊娠
, 百拇医药
细胞凋亡是在基因调控下，有新生蛋白质合成的主动过程，其特征性改变是钙、镁离子依赖性核酸内切酶被激活，导致核内DNA裂解成180～200碱基对及其整数倍的小片段，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈特征性的“DNA-梯带”改变[4]。正常情况下，细胞凋亡是生理性的正常组织生长、发育的一种重要生命现象，在维持机体正常形态及功能方面起重要作用。曾有学者作过早孕绒毛细胞凋亡情况的研究，发现有少量的细胞凋亡发生，且着色较淡，证实细胞凋亡与某些器官的细胞动力学过程中增殖、分化的某个方面有关[5，6]；而在病理情况下，细胞凋亡明显增多，可作为清除病理性受损组织的一个重要现象，也是病理性现象发生、发展的重要标志[7，8]。
本研究发现：正常晚孕与重度妊高征胎盘细胞滋养细胞和合体滋养细胞中都有一定量或较大量的细胞凋亡发生。说明细胞凋亡参与了正常妊娠胎盘的生长发育，且在重度妊高征等病理妊娠时，因缺血、缺氧、pH值改变等一系列致病因素的影响，最终表现为大量的细胞凋亡，且与病变出现的时间和严重程度有密切的关系。本研究中最早在孕24周出现重度妊高征伴重度腹水，其胎盘中出现大量的细胞凋亡，与国外学者的研究结果有一致性。
, 百拇医药
二、bax、bcl-2基因蛋白表达与妊娠的关系
1.bax基因蛋白的表达：bax基因编码由192个氨基酸组成，相对分子质量为21 000的bax蛋白，是bcl-2家族成员之一，与bcl-2蛋白有21%的同源性。在细胞内可与bcl-2形成异二聚体，bax/bcl-2比值对决定细胞接受致病信号刺激后存活与否起关键作用[9]，bax过度表达，bax/bcl-2升高，细胞凋亡；bcl-2过度表达，bax/bcl-2下降，细胞存活。即bax蛋白具有对抗bcl-2蛋白抑制凋亡的作用，是一种细胞凋亡促进因子。
本研究结果发现，正常晚孕妇女和重度妊高征患者胎盘中bax的表达均较强，而且重度妊高征患者胎盘中bax的表达明显高于对照组。bax的表达与细胞凋亡的增多呈正相关性。
2.bcl-2基因蛋白的表达：bcl-2基因位于第18号染色体上，但可异位到第14号染色体上，易位后的bcl-2基因所编码的蛋白质结构不变，但表达量可大大增加，是第一个被发现的凋亡抑制基因，其主要生物学功能是，增加细胞对多种凋亡刺激因素的抵抗力，不影响细胞增殖，只是减少细胞凋亡，延长细胞寿命[10]。
, 百拇医药
3.bax/bcl-2平衡维持或紊乱对细胞凋亡及生理、病理妊娠的影响：已有研究表明，其他一切促进或抑制凋亡基因对细胞凋亡的影响都可最终归结为bax/bcl-2比值的改变，从而起促进或抑制细胞凋亡的作用，所以用bax/bcl-2比值来反应促进或抑制细胞凋亡间的平衡是可行的。本实验结果显示，bax/bcl-2在正常晚孕妇女胎盘中的表达为0.7～1.7，呈平衡趋势；在重度妊高征患者胎盘中的表达为1.0～3.2，此比值明显增高，可能因为bax表达绝对增强，而bcl-2表达相对降低或不变，其共同作用表现为抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，细胞凋亡及其调节机制间具有正相关性，体现了细胞水平与分子生物学水平上的一致性。有研究表明，bax/bcl-2表达变化是在凋亡核小体DNA片段出现之前，继而发生细胞凋亡，最终影响组织器官的结构和功能，我们将继续从基因水平进一步论证此观点。
作者单位：李翠兰(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)
胡章和(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)
, 百拇医药
曹来英(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)
刘谦(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)
参考文献
1，林其德. 妊高征病因学研究的进展. 中华妇产科杂志，1997，32:3-5.
2，乐杰，主编.妇产科学.第4版.北京:人民卫生出版社, 1980. 153-157.
3，Gavrieli Y,Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation .J Cell Biol, 1992,119:493-501.
, http://www.100md.com
4，赵卫红，寿好长，韩字研，主编. 细胞凋亡. 第1版. 郑州：河南医科大学出版社，1997.1-48.
5，Smith CS, Baker NP, Symond ME. Placental apoptosis in normal human pregnancy. Am J Obstet Gynecol, 1997,177:57-65.
6，李翠兰,胡章和,曹来英. 正常妊娠绒毛蜕膜中细胞增殖、细胞凋亡情况的研究. 中国实用妇科与产科杂志，2000,16: 239-240.
7，Kokawa K, Shikone T, Nakano R. Apoptosis in human chorionic villi and decidua during normal embryonic development and spontaneous abortion in the first trimester. Placenta, 1998,19:21-26.
, 百拇医药
8，Smith CS, Baker NP, Symond ME. Increased placental apoptosis in intrauterine growth restriction. Am J Obstet Gynecol, 1997,177:1395-401.
9，Amato D, Zwain I, Reed J, et al. Expression of bcl-2 and bax in human placenta. J Soc Gynecol Invest, 1996, 3 Suppl:226.
10，Kim CJ, Choe YJ, Yoon BH, et al. Patterns of bcl-2 expression in placenta. Pathol Res Pract, 1995, 191: 1239-1244., 百拇医药
李翠兰 胡章和 曹来英 刘谦
摘 要 目的 研究细胞凋亡及其调控基因在重度妊娠高血压综合征(妊高征)发生、发展中的作用。方法 对40例正常晚孕妇女(对照组)和40例重度妊高征患者(观察组)的胎盘组织进行分析。用DNA缺口原位末端标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡；免疫组织化学方法检测促进和抑制凋亡基因(bax/bcl-2)的表达。结果 对照组胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞中凋亡指数分别为(1.1±0.9)%、(41.8±1.5)%；bax阳性率分别为(1.0±0.9)%、(28.9±9.7)%；bcl-2阳性率分别为(2.2±0.8)%、(22.9±0.7)%，总bax/bcl-2为0.7～1.7。 观察组胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞的凋亡指数分别为(4.3±1.2)%、(45.3±1.4)%；bax阳性率分别是(2.2±0.8)%、(42.5±11.7)%；bcl-2阳性率分别是(3.2±0.8)%、(23.3±7.8)%；总bax/bcl-2为1.0～3.2。即：对照组胎盘中有一定量的细胞凋亡、bax、bcl-2表达，bax/bcl-2表达间呈平衡趋势；观察组中细胞凋亡明显增高(P<0.01)，bax表达也明显增强(P<0.01)，bcl-2表达仅呈增高趋势，但差异无显著性(P>0.05)，bax/bcl-2比值明显增高(P<0.01)。结论 细胞凋亡及其调节基因的表达间具有一致性；细胞凋亡、bax/bcl-2表达间的平衡与紊乱影响着正常妊娠妇女与重度妊高征患者胎盘的结构与功能，进而影响妊娠的结局。
, http://www.100md.com
关键词：妊娠并发症，心血管；高血压；脱噬作用；原癌基因蛋白质c-bcl-2
一般轻、中度妊娠高血压综合征(妊高征)对患者的影响易控制，但重度妊高征、先兆子痫、子痫病情变化莫测，是导致孕产妇及围产儿发病率和死亡率升高的重要原因[1]。我们研究胎盘细胞凋亡及bax、bcl-2基因蛋白表达，旨在从细胞与分子水平，阐述各种原因导致的重度妊高征发生、发展的机理。
资料与方法
一、 资料来源
选1998年6月～1999年6月在我院住院分娩的重度妊高征患者40例(观察组)，其中子痫13例(产前7例、产时2例、产后4例)、先兆子痫18例，孕妇平均年龄(26.3±2.5)岁，平均孕周(36.7±3.6)周；选择同期正常晚孕妇女40例为对照组，平均年龄(27.2±4.0)岁，平均孕周(38.8±2.0)周。重度妊高征的诊断标准以乐杰主编的全国统编教材《妇产科学》(第四版)为准[2]。
, 百拇医药
二、 方法
1.取材：胎盘自然娩出后，迅速选取母面中央(避开钙化、机化灶)约1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm小块，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片3张，60℃烤箱过夜后置37℃温箱保存备用，分别行DNA缺口原位末端标记(TDT-mediated dUTP biotin nick ending labeling, TUNEL)染色检测细胞凋亡、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-perioxidase,SP)法染色，检测bax、bcl-2基因蛋白的表达。
2.细胞凋亡检测：采用Gavrieli等[3] 的TUNEL方法略加修改。切片脱蜡入水，微波修复抗原，3%过氧化氢(H2O2)阻断内源性过氧化物活性，1∶10配制反应液(管1：脱氧核苷酸末端转移酶，管2：荧光素连接的核苷酸混合缓冲液)，37℃孵育1 h，PBS冲洗，加酶标抗体(管3：辣根过氧化物酶连接的荧光素抗体，POD)，37℃孵育30 min，冲洗，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，中性树胶封片，镜下观察。
, 百拇医药
3.bax、bcl-2检测：采用SP法。
以上试剂均购自福州迈新试剂公司，即用型。
4.结果判断：细胞凋亡定位于细胞核内，bax、bcl-2定位于胞膜和胞浆内，棕黄色为阳性细胞。每例随机选取10个高倍视野，分别计数凋亡指数(apoptosis indexes, AI)、bax阳性率、bcl-2阳性率。以bax 阳性率与bcl-2阳性率的比值bax/bcl-2表示促进和抑制细胞凋亡间的平衡。
三、 统计学方法
采用SPSS 统计软件包进行。组内比较用方差分析，组间比较用独立样本的t检验。
结果
一、 细胞凋亡指数
, 百拇医药 对照组胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞凋亡指数分别为(1.1±0.9)%、(41.8±1.5)%，观察组分别为(4.3±1.2)%、(45.3±1.4)%，两组比较，差异有显著性(P<0.05)。
二、 基因蛋白表达
对照组胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞bax基因蛋白表达分别为(1.0±0.9)%、(28.9±9.7)%，观察组分别为(2.2±0.8)%、(42.5±11.7)%，两组比较，差异有极显著性(P<0.01)。对照组胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞bcl-2基因蛋白表达分别为(2.2±0.8)%、(22.9±0.7)%，观察组分别为(3.2±0.8)%、(23.3±7.8)%，两组比较，差异无显著性(P>0.05)。对照组与观察组bax/bcl-2在胎盘组织中的表达分别为0.7～1.7、1.0～3.2。
讨论
一、细胞凋亡与妊娠
, 百拇医药
细胞凋亡是在基因调控下，有新生蛋白质合成的主动过程，其特征性改变是钙、镁离子依赖性核酸内切酶被激活，导致核内DNA裂解成180～200碱基对及其整数倍的小片段，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈特征性的“DNA-梯带”改变[4]。正常情况下，细胞凋亡是生理性的正常组织生长、发育的一种重要生命现象，在维持机体正常形态及功能方面起重要作用。曾有学者作过早孕绒毛细胞凋亡情况的研究，发现有少量的细胞凋亡发生，且着色较淡，证实细胞凋亡与某些器官的细胞动力学过程中增殖、分化的某个方面有关[5，6]；而在病理情况下，细胞凋亡明显增多，可作为清除病理性受损组织的一个重要现象，也是病理性现象发生、发展的重要标志[7，8]。
本研究发现：正常晚孕与重度妊高征胎盘细胞滋养细胞和合体滋养细胞中都有一定量或较大量的细胞凋亡发生。说明细胞凋亡参与了正常妊娠胎盘的生长发育，且在重度妊高征等病理妊娠时，因缺血、缺氧、pH值改变等一系列致病因素的影响，最终表现为大量的细胞凋亡，且与病变出现的时间和严重程度有密切的关系。本研究中最早在孕24周出现重度妊高征伴重度腹水，其胎盘中出现大量的细胞凋亡，与国外学者的研究结果有一致性。
, 百拇医药
二、bax、bcl-2基因蛋白表达与妊娠的关系
1.bax基因蛋白的表达：bax基因编码由192个氨基酸组成，相对分子质量为21 000的bax蛋白，是bcl-2家族成员之一，与bcl-2蛋白有21%的同源性。在细胞内可与bcl-2形成异二聚体，bax/bcl-2比值对决定细胞接受致病信号刺激后存活与否起关键作用[9]，bax过度表达，bax/bcl-2升高，细胞凋亡；bcl-2过度表达，bax/bcl-2下降，细胞存活。即bax蛋白具有对抗bcl-2蛋白抑制凋亡的作用，是一种细胞凋亡促进因子。
本研究结果发现，正常晚孕妇女和重度妊高征患者胎盘中bax的表达均较强，而且重度妊高征患者胎盘中bax的表达明显高于对照组。bax的表达与细胞凋亡的增多呈正相关性。
2.bcl-2基因蛋白的表达：bcl-2基因位于第18号染色体上，但可异位到第14号染色体上，易位后的bcl-2基因所编码的蛋白质结构不变，但表达量可大大增加，是第一个被发现的凋亡抑制基因，其主要生物学功能是，增加细胞对多种凋亡刺激因素的抵抗力，不影响细胞增殖，只是减少细胞凋亡，延长细胞寿命[10]。
, 百拇医药
3.bax/bcl-2平衡维持或紊乱对细胞凋亡及生理、病理妊娠的影响：已有研究表明，其他一切促进或抑制凋亡基因对细胞凋亡的影响都可最终归结为bax/bcl-2比值的改变，从而起促进或抑制细胞凋亡的作用，所以用bax/bcl-2比值来反应促进或抑制细胞凋亡间的平衡是可行的。本实验结果显示，bax/bcl-2在正常晚孕妇女胎盘中的表达为0.7～1.7，呈平衡趋势；在重度妊高征患者胎盘中的表达为1.0～3.2，此比值明显增高，可能因为bax表达绝对增强，而bcl-2表达相对降低或不变，其共同作用表现为抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，细胞凋亡及其调节机制间具有正相关性，体现了细胞水平与分子生物学水平上的一致性。有研究表明，bax/bcl-2表达变化是在凋亡核小体DNA片段出现之前，继而发生细胞凋亡，最终影响组织器官的结构和功能，我们将继续从基因水平进一步论证此观点。
作者单位：李翠兰(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)
胡章和(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)
, 百拇医药
曹来英(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)
刘谦(430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院妇产科)
参考文献
1，林其德. 妊高征病因学研究的进展. 中华妇产科杂志，1997，32:3-5.
2，乐杰，主编.妇产科学.第4版.北京:人民卫生出版社, 1980. 153-157.
3，Gavrieli Y,Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation .J Cell Biol, 1992,119:493-501.
, http://www.100md.com
4，赵卫红，寿好长，韩字研，主编. 细胞凋亡. 第1版. 郑州：河南医科大学出版社，1997.1-48.
5，Smith CS, Baker NP, Symond ME. Placental apoptosis in normal human pregnancy. Am J Obstet Gynecol, 1997,177:57-65.
6，李翠兰,胡章和,曹来英. 正常妊娠绒毛蜕膜中细胞增殖、细胞凋亡情况的研究. 中国实用妇科与产科杂志，2000,16: 239-240.
7，Kokawa K, Shikone T, Nakano R. Apoptosis in human chorionic villi and decidua during normal embryonic development and spontaneous abortion in the first trimester. Placenta, 1998,19:21-26.
, 百拇医药
8，Smith CS, Baker NP, Symond ME. Increased placental apoptosis in intrauterine growth restriction. Am J Obstet Gynecol, 1997,177:1395-401.
9，Amato D, Zwain I, Reed J, et al. Expression of bcl-2 and bax in human placenta. J Soc Gynecol Invest, 1996, 3 Suppl:226.
10，Kim CJ, Choe YJ, Yoon BH, et al. Patterns of bcl-2 expression in placenta. Pathol Res Pract, 1995, 191: 1239-1244., 百拇医药