马拉色菌属的分类及其在几种皮肤病的分布情况
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中华皮肤科杂志 2000年第33卷第5期
马拉色菌属的分类及其在几种皮肤病的分布情况
熊琳 冉玉平 周光平 代亚林
摘 要 目的 研究马拉色菌属的分类及其在一些皮肤病的分布情况。方法 以标准株作对照，用生理生化学及形态学方法将150株来源于花斑癣(29株)、马拉色菌毛囊炎(16株)、脂溢性皮炎(49株)、甲真菌病(33株)及正常人皮肤(23株)的马拉色菌进行分类及描述，并分析了各菌种在一些皮肤病的分布情况。结果 共分离出4个菌种：合轴马拉色菌65株、糠秕马拉色菌13株、钝形马拉色菌1株、球形马拉色菌71株。其中合轴马拉色菌和球形马拉色菌各占43.3%和47.3%；马拉色菌毛囊炎中全部为球形马拉色菌。结论 此分类系统为经济、简便及可应用的马拉色菌属分类鉴定系统；球形马拉色菌与马拉色菌毛囊炎密切相关。
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关键词：马拉色霉菌属；分类法；皮肤疾病
马拉色菌属(Malassezia)是人类及温血动物皮肤的常驻菌群，与花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特应性皮炎及某些银屑病有关。近年来还有引起甲感染[1]和系统感染[2]的报道。该菌属的多形性已为人所知。我们以标准株作对照，用生理生化学及形态学方法对150株临床分离的马拉色菌进行分类和描述，并分析了各菌种在不同皮肤病的分布情况。
材料和方法
一、菌株
1.临床分离株：从本科真菌实验室选择马拉色菌150株，其来源分别为：花斑癣29株、马拉色菌毛囊炎16株、脂溢性皮炎49株、甲真菌病33株及正常人23株。
2.标准株：合轴马拉色菌(M.sympodialis CBS 7222)、糠秕马拉色菌(M.furfur CBS 1878、M.furfur CBS 7019)、斯洛菲马拉色菌(M.slooffiae CBS 7956)、钝形马拉色菌(M.obtusa CBS 7876)、球形马拉色菌(M.globosa CBS 7966)、限制性马拉色菌(M.restricta CBS 7877)由法国巴斯德研究所Gueho教授惠赠。
, 百拇医药
二、培养基
1.Leeming和Notman培养基[3]：质量分数为1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.1%酵母浸膏、0.4%牛胆盐、0.1%甘油、0.05%单硬脂酸甘油脂、0.05%吐温60、1%全脂牛奶、2%橄榄油、1.2%琼脂、0.5%放线菌酮、0.05%氯霉素。
2.七叶苷(Esculin)琼脂培养基：上述培养基加入0.2%枸橼酸铁、0.1%七叶苷。
3.沙堡培养基：质量分数为1%蛋白胨、4%葡萄糖、1.2%琼脂、0.5%放线菌酮、0.025%氯霉素。
图1马拉色菌属各菌种在Leeming和Notman培养基，32℃培养10d后的菌落形态
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图2马拉色菌属各菌种细胞形态(50%派克墨水染色，×1000)
三、菌种分离、培养
用刮屑法或胶带法在患者典型皮损或正常人面部取材，接种于Leeming和Notman培养基平板中，32℃培养7～14d。将经50%派克墨水染色后确定为马拉色菌的第一代培养物在同种培养基平板上画线培养分离单菌落，取单菌落增菌保存。
四、菌种鉴定
待鉴定菌株与标准菌株同时实验。鉴定前48h活化菌种。鉴定方法如下：
1.将菌种接种于沙堡培养基上32℃培养7～14d，能在沙堡培养基上生长者为厚皮马拉色菌。
2.过氧化氢酶试验：用无菌棉签挑一块菌落置于无菌载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液，产生气泡为阳性。可鉴定出限制性马拉色菌。
, 百拇医药
3.吐温试验及PEG-35蓖麻油(CremophorEL)试验：取一环菌种与5mL生理盐水充分混合后，取2mL菌悬液与16mL沙堡培养基(温度降至40～45℃)混合制成含菌平板。用直径3mm打孔器在平板上无菌打孔5个，分别加入100%吐温20、100%吐温40、100%吐温60、100%吐温80及100%PEG-35蓖麻油，32℃培养7～14d。在以上5种脂源周围都能生长的为糠秕马拉色菌；高浓度吐温20和PEG-35蓖麻油周围无生长者为合轴马拉色菌；吐温80周围生长的面积明显小于其他吐温，同时PEG-35蓖麻油周围无生长者为斯洛菲马拉色菌。吐温20、吐温80周围无生长者为钝形、球形和限制性马拉色菌。
4.七叶苷分解试验：取一环菌种接种于七叶苷琼脂培养基上32℃培养2～3d。能使培养基变黑至少1/3的为合轴马拉色菌和钝形马拉色菌，只能使培养基顶端变黑的为糠秕马拉色菌，可疑阳性可为厚皮马拉色菌和糠秕马拉色菌，阴性可为糠秕马拉色菌、斯洛菲马拉色菌、球形马拉色菌和限制性马拉色菌。
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5.形态学鉴定：主要用于区分钝形马拉色菌和球形马拉色菌。孢子为球形者鉴定为球形马拉色菌，孢子为筒形者鉴定为钝形马拉色菌。
6.形态学观察：将所得各种马拉色菌在Leeming和Notman培养基平板上画线分离出单菌落，32℃培养10d，观察菌落形态；用无菌接种针挑取单菌落涂片，用50%派克墨水染色后观察孢子形态并照相；用2.5%戊二醛固定，按常规方法处理标本后在扫描电镜(AMRAY1000-B型)和透射电镜(JEM-100SX型)下观察并照相。
结果
一、150株马拉色菌的鉴定结果
经生理生化学及形态学方法鉴定出合轴马拉色菌65株、糠秕马拉色菌13株、钝形马拉色菌1株、球形马拉色菌71株，未发现厚皮马拉色菌、斯洛菲马拉色菌和限制性马拉色菌。马拉色菌属各菌种吐温试验和PEG-35蓖麻油试验沙堡培养基上32℃培养10d，合轴马拉色菌在高浓度吐温20和PEG-35篦麻油周围无生长，其余吐温周围生长良好；糠秕马拉色菌在所有脂源周围生长均良好；钝形马拉色菌仅在吐温60周围生长，其余脂源周围无生长；球形马拉色菌在所有脂源周围均无生长。马拉色菌属各菌种七叶苷分解试验：七叶苷琼脂培养基上32℃培养72h，合轴马拉色菌和钝形马拉色菌使培养基完全变黑，糠秕马拉色菌使培养基轻微变黑；球形马拉色菌使培养基不变色。
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二、各菌种形态学特征观察
图3马拉色菌属各菌种细胞形态(扫描电镜，×10000)3a：合轴马拉色菌，卵形孢子，可见合轴出芽方式3b：钝形马拉色菌，筒形的孢子
3c：糠秕马拉色菌，卵形孢子3d：球形马拉色菌，球形孢子
图4马拉色菌属各菌种细胞形态(透射电镜，×10000)各菌种均有典型的内壁锯齿状结构4a：合轴马拉色菌4b：糠秕马拉色菌4c：钝形马拉色菌4d：球形马拉色菌
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马拉色菌各菌种菌落形态见图1，镜下各菌种孢子形态见图2，扫描电镜图象见图3，透射电镜图象见图4。
三、各菌种在几种皮肤病的分布
来源于花斑癣的29株中，合轴马拉色菌14株(48.3%)、糠秕马拉色菌2株(6.9%)、球形马拉色菌13株(44.8%)；来源于马拉色菌毛囊炎中的16株全部为球形马拉色菌；来源于脂溢性皮炎的49株中，合轴马拉色菌14株(28.6%)、糠秕马拉色菌4株(8.2%)、钝形马拉色菌1株(2.0%)、球形马拉色菌30株(61.2%)；来源于甲真菌病的33株中，合轴马拉色菌22株(66.6%)、糠秕马拉色菌5株(15.2%)、球形马拉色菌6株(18.2%)；来源于正常人的23株中，合轴马拉色菌15株(65.2%)、糠秕马拉色菌2株(8.7%)、球形马拉色菌6株(26.1%)。
讨论
自1846年花斑癣的病原体被认识后，其命名及分类一直比较混乱。通过对各菌种形态学和生理生化学特性的研究以及随机扩增多态性DNA分析等的应用，该菌迄今被分为7个种[4]。本文应用Guillot等[4-6]的方法，以标准株为对照，对马拉色菌进行生理生化学及形态学分类，得到4个种：合轴马拉色菌、糠秕马拉色菌、钝形马拉色菌及球形马拉色菌，所占比例分别为43.3%、8.7%、0.7%和47.3%。由此发现从本实验室分离的菌种主要为合轴马拉色菌和球形马拉色菌。从形态学观察来看，各菌种菌落形态不同，特别是钝形马拉色菌和球形马拉色菌菌落形态特征明显，可作为鉴定指标之一；各菌种生长10d后，其孢子形态具有特征性，容易鉴别。扫描电镜观察显示形态上的差异与光学显微镜下基本相同，特别是球形马拉色菌的形态与冉玉平等[7]的报道完全相同。
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马拉色菌各菌种在皮肤病中的分布：甲真菌病及正常人中2/3为合轴马拉色菌；花斑癣中主要为合轴马拉色菌和球形马拉色菌；脂溢性皮炎中3/5为球形马拉色菌；马拉色菌毛囊炎中全部为球形马拉色菌。提示球形马拉色菌与马拉色菌毛囊炎密切相关。
志谢法国巴斯德研究所Gueho教授为本研究提供标准菌株并指导；我科李薇医师、法医系彭雪梅老师和病理科张杰老师对本文的支持
四川省学术和技术带头人培养基金资助
作者单位：熊琳(610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科)
冉玉平(610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科)
周光平(610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科)
, 百拇医药 代亚林(610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科)
参考文献
[1]冉玉平，周光平，李薇，等.从一例甲真菌病患者病甲中分离出糠秕孢子菌临床和实验研究报告.中华皮肤科杂志，1998，31：276-279.
[2]李薇综述.糠秕马拉色菌的系统感染.国外医学皮肤性病学分册，1997，23：263-265.
[3]van Belkum A, Boekhout T, Bosboom R.Monitoring spread of Malassezia infections in a neonatal intensive care unit by PCR- mediated genetic typing. J Clin Microbiol, 1994， 32:2528- 2532.
, http://www.100md.com
[4]Gueho E, Midgley G, Guillot J. The genus Malassezia with description of four new species. Antonie Van Leeuwenhoek, 1996， 69:337- 355.
[5]Guillot J, Gueho E, Lesourd M, et al. Identification of Malassezia species: a practical approach. J Mycol Med, 1996， 6:103- 110.
[6]Mayser P, Haze P, Papavassilis C, et al. Differentiation of Malassezia spp.- Selectivity of Cremophor EL, castor oil and ricinoleic acid for M.furfur. Br J Dermatol, 1997， 137:208- 213.
[7]冉玉平，罗汉超，李志玉.圆型和卵形糠秕孢子菌的扫描电镜观察报告.临床皮肤科杂志，1987，16：2-3., http://www.100md.com
熊琳 冉玉平 周光平 代亚林
摘 要 目的 研究马拉色菌属的分类及其在一些皮肤病的分布情况。方法 以标准株作对照，用生理生化学及形态学方法将150株来源于花斑癣(29株)、马拉色菌毛囊炎(16株)、脂溢性皮炎(49株)、甲真菌病(33株)及正常人皮肤(23株)的马拉色菌进行分类及描述，并分析了各菌种在一些皮肤病的分布情况。结果 共分离出4个菌种：合轴马拉色菌65株、糠秕马拉色菌13株、钝形马拉色菌1株、球形马拉色菌71株。其中合轴马拉色菌和球形马拉色菌各占43.3%和47.3%；马拉色菌毛囊炎中全部为球形马拉色菌。结论 此分类系统为经济、简便及可应用的马拉色菌属分类鉴定系统；球形马拉色菌与马拉色菌毛囊炎密切相关。
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关键词：马拉色霉菌属；分类法；皮肤疾病
马拉色菌属(Malassezia)是人类及温血动物皮肤的常驻菌群，与花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特应性皮炎及某些银屑病有关。近年来还有引起甲感染[1]和系统感染[2]的报道。该菌属的多形性已为人所知。我们以标准株作对照，用生理生化学及形态学方法对150株临床分离的马拉色菌进行分类和描述，并分析了各菌种在不同皮肤病的分布情况。
材料和方法
一、菌株
1.临床分离株：从本科真菌实验室选择马拉色菌150株，其来源分别为：花斑癣29株、马拉色菌毛囊炎16株、脂溢性皮炎49株、甲真菌病33株及正常人23株。
2.标准株：合轴马拉色菌(M.sympodialis CBS 7222)、糠秕马拉色菌(M.furfur CBS 1878、M.furfur CBS 7019)、斯洛菲马拉色菌(M.slooffiae CBS 7956)、钝形马拉色菌(M.obtusa CBS 7876)、球形马拉色菌(M.globosa CBS 7966)、限制性马拉色菌(M.restricta CBS 7877)由法国巴斯德研究所Gueho教授惠赠。
, 百拇医药
二、培养基
1.Leeming和Notman培养基[3]：质量分数为1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.1%酵母浸膏、0.4%牛胆盐、0.1%甘油、0.05%单硬脂酸甘油脂、0.05%吐温60、1%全脂牛奶、2%橄榄油、1.2%琼脂、0.5%放线菌酮、0.05%氯霉素。
2.七叶苷(Esculin)琼脂培养基：上述培养基加入0.2%枸橼酸铁、0.1%七叶苷。
3.沙堡培养基：质量分数为1%蛋白胨、4%葡萄糖、1.2%琼脂、0.5%放线菌酮、0.025%氯霉素。
图1马拉色菌属各菌种在Leeming和Notman培养基，32℃培养10d后的菌落形态
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图2马拉色菌属各菌种细胞形态(50%派克墨水染色，×1000)
三、菌种分离、培养
用刮屑法或胶带法在患者典型皮损或正常人面部取材，接种于Leeming和Notman培养基平板中，32℃培养7～14d。将经50%派克墨水染色后确定为马拉色菌的第一代培养物在同种培养基平板上画线培养分离单菌落，取单菌落增菌保存。
四、菌种鉴定
待鉴定菌株与标准菌株同时实验。鉴定前48h活化菌种。鉴定方法如下：
1.将菌种接种于沙堡培养基上32℃培养7～14d，能在沙堡培养基上生长者为厚皮马拉色菌。
2.过氧化氢酶试验：用无菌棉签挑一块菌落置于无菌载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液，产生气泡为阳性。可鉴定出限制性马拉色菌。
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3.吐温试验及PEG-35蓖麻油(CremophorEL)试验：取一环菌种与5mL生理盐水充分混合后，取2mL菌悬液与16mL沙堡培养基(温度降至40～45℃)混合制成含菌平板。用直径3mm打孔器在平板上无菌打孔5个，分别加入100%吐温20、100%吐温40、100%吐温60、100%吐温80及100%PEG-35蓖麻油，32℃培养7～14d。在以上5种脂源周围都能生长的为糠秕马拉色菌；高浓度吐温20和PEG-35蓖麻油周围无生长者为合轴马拉色菌；吐温80周围生长的面积明显小于其他吐温，同时PEG-35蓖麻油周围无生长者为斯洛菲马拉色菌。吐温20、吐温80周围无生长者为钝形、球形和限制性马拉色菌。
4.七叶苷分解试验：取一环菌种接种于七叶苷琼脂培养基上32℃培养2～3d。能使培养基变黑至少1/3的为合轴马拉色菌和钝形马拉色菌，只能使培养基顶端变黑的为糠秕马拉色菌，可疑阳性可为厚皮马拉色菌和糠秕马拉色菌，阴性可为糠秕马拉色菌、斯洛菲马拉色菌、球形马拉色菌和限制性马拉色菌。
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5.形态学鉴定：主要用于区分钝形马拉色菌和球形马拉色菌。孢子为球形者鉴定为球形马拉色菌，孢子为筒形者鉴定为钝形马拉色菌。
6.形态学观察：将所得各种马拉色菌在Leeming和Notman培养基平板上画线分离出单菌落，32℃培养10d，观察菌落形态；用无菌接种针挑取单菌落涂片，用50%派克墨水染色后观察孢子形态并照相；用2.5%戊二醛固定，按常规方法处理标本后在扫描电镜(AMRAY1000-B型)和透射电镜(JEM-100SX型)下观察并照相。
结果
一、150株马拉色菌的鉴定结果
经生理生化学及形态学方法鉴定出合轴马拉色菌65株、糠秕马拉色菌13株、钝形马拉色菌1株、球形马拉色菌71株，未发现厚皮马拉色菌、斯洛菲马拉色菌和限制性马拉色菌。马拉色菌属各菌种吐温试验和PEG-35蓖麻油试验沙堡培养基上32℃培养10d，合轴马拉色菌在高浓度吐温20和PEG-35篦麻油周围无生长，其余吐温周围生长良好；糠秕马拉色菌在所有脂源周围生长均良好；钝形马拉色菌仅在吐温60周围生长，其余脂源周围无生长；球形马拉色菌在所有脂源周围均无生长。马拉色菌属各菌种七叶苷分解试验：七叶苷琼脂培养基上32℃培养72h，合轴马拉色菌和钝形马拉色菌使培养基完全变黑，糠秕马拉色菌使培养基轻微变黑；球形马拉色菌使培养基不变色。
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二、各菌种形态学特征观察
图3马拉色菌属各菌种细胞形态(扫描电镜，×10000)3a：合轴马拉色菌，卵形孢子，可见合轴出芽方式3b：钝形马拉色菌，筒形的孢子
3c：糠秕马拉色菌，卵形孢子3d：球形马拉色菌，球形孢子
图4马拉色菌属各菌种细胞形态(透射电镜，×10000)各菌种均有典型的内壁锯齿状结构4a：合轴马拉色菌4b：糠秕马拉色菌4c：钝形马拉色菌4d：球形马拉色菌
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马拉色菌各菌种菌落形态见图1，镜下各菌种孢子形态见图2，扫描电镜图象见图3，透射电镜图象见图4。
三、各菌种在几种皮肤病的分布
来源于花斑癣的29株中，合轴马拉色菌14株(48.3%)、糠秕马拉色菌2株(6.9%)、球形马拉色菌13株(44.8%)；来源于马拉色菌毛囊炎中的16株全部为球形马拉色菌；来源于脂溢性皮炎的49株中，合轴马拉色菌14株(28.6%)、糠秕马拉色菌4株(8.2%)、钝形马拉色菌1株(2.0%)、球形马拉色菌30株(61.2%)；来源于甲真菌病的33株中，合轴马拉色菌22株(66.6%)、糠秕马拉色菌5株(15.2%)、球形马拉色菌6株(18.2%)；来源于正常人的23株中，合轴马拉色菌15株(65.2%)、糠秕马拉色菌2株(8.7%)、球形马拉色菌6株(26.1%)。
讨论
自1846年花斑癣的病原体被认识后，其命名及分类一直比较混乱。通过对各菌种形态学和生理生化学特性的研究以及随机扩增多态性DNA分析等的应用，该菌迄今被分为7个种[4]。本文应用Guillot等[4-6]的方法，以标准株为对照，对马拉色菌进行生理生化学及形态学分类，得到4个种：合轴马拉色菌、糠秕马拉色菌、钝形马拉色菌及球形马拉色菌，所占比例分别为43.3%、8.7%、0.7%和47.3%。由此发现从本实验室分离的菌种主要为合轴马拉色菌和球形马拉色菌。从形态学观察来看，各菌种菌落形态不同，特别是钝形马拉色菌和球形马拉色菌菌落形态特征明显，可作为鉴定指标之一；各菌种生长10d后，其孢子形态具有特征性，容易鉴别。扫描电镜观察显示形态上的差异与光学显微镜下基本相同，特别是球形马拉色菌的形态与冉玉平等[7]的报道完全相同。
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马拉色菌各菌种在皮肤病中的分布：甲真菌病及正常人中2/3为合轴马拉色菌；花斑癣中主要为合轴马拉色菌和球形马拉色菌；脂溢性皮炎中3/5为球形马拉色菌；马拉色菌毛囊炎中全部为球形马拉色菌。提示球形马拉色菌与马拉色菌毛囊炎密切相关。
志谢法国巴斯德研究所Gueho教授为本研究提供标准菌株并指导；我科李薇医师、法医系彭雪梅老师和病理科张杰老师对本文的支持
四川省学术和技术带头人培养基金资助
作者单位：熊琳(610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科)
冉玉平(610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科)
周光平(610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科)
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参考文献
[1]冉玉平，周光平，李薇，等.从一例甲真菌病患者病甲中分离出糠秕孢子菌临床和实验研究报告.中华皮肤科杂志，1998，31：276-279.
[2]李薇综述.糠秕马拉色菌的系统感染.国外医学皮肤性病学分册，1997，23：263-265.
[3]van Belkum A, Boekhout T, Bosboom R.Monitoring spread of Malassezia infections in a neonatal intensive care unit by PCR- mediated genetic typing. J Clin Microbiol, 1994， 32:2528- 2532.
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[4]Gueho E, Midgley G, Guillot J. The genus Malassezia with description of four new species. Antonie Van Leeuwenhoek, 1996， 69:337- 355.
[5]Guillot J, Gueho E, Lesourd M, et al. Identification of Malassezia species: a practical approach. J Mycol Med, 1996， 6:103- 110.
[6]Mayser P, Haze P, Papavassilis C, et al. Differentiation of Malassezia spp.- Selectivity of Cremophor EL, castor oil and ricinoleic acid for M.furfur. Br J Dermatol, 1997， 137:208- 213.
[7]冉玉平，罗汉超，李志玉.圆型和卵形糠秕孢子菌的扫描电镜观察报告.临床皮肤科杂志，1987，16：2-3., http://www.100md.com