脐血中树突状细胞的体外诱导和抗肿瘤效应的实验研究
脐血中树突状细胞的体外诱导和抗肿瘤效应的实验研究
刘艳 朱美琪 张弘
摘 要 目的 探讨脐血来源的树突状细胞(DC)的体外诱导及其在抗肿瘤免疫中的作用。方法 无菌条件下常规采集脐血， 采用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，去除悬浮细胞后获得单核细胞。将获得的单核细胞分为两组，实验组1在含有细胞因子白介素4(IL-4)、粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的合成培养液DMEM中培养，对照组1培养液中未加上述细胞因子，第10天收集部分细胞进行细胞表型分析，并与人浆液性囊腺癌细胞株HO9810冻融抗原共同培养48 h后获得DC。将获得的DC与用 E-花环分离脐血单个核细胞得到的T淋巴细胞共同培养3 d，然后分为两组，实验组2继续与不同比例的HO9810细胞共同培养3 d后获得细胞毒T淋巴细胞(CTL)，对照组2除加入HO9810外，还加入了无关细胞(COS细胞)，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测其对HO9810细胞的抑制作用。结果 (1)IL-4、GM-CSF和TNF-α可诱导脐血来源的单核细胞(即DC前体细胞)分化为成熟的DC，10 d后实验组1分别高表达DC特异性抗原CD1a(37.90±6.60)%、CD40(46.80±3.40)%、CD80(73.50±6.20)%、CD83(50.20±5.40)%和人白细胞二类抗原[HLA-DR，(78.50±15.40)%]，分别与对照组1比较，差异均有显著性(P<0.05)。(2)DC可负载肿瘤抗原，并可诱导肿瘤特异性CTL的产生，当实验组2中 DC与肿瘤细胞的比例达到100∶1时，与对照组2比较，肿瘤细胞明显受到抑制(P<0.05)。结论 脐血中的DC前体细胞可在体外诱导成为功能性(即成熟)DC；并可诱导肿瘤特异性CTL的产生，是一种临床应用前景良好的、方便有效的肿瘤免疫治疗方法。
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关键词：血；树突细胞；囊腺癌，浆液；肿瘤细胞，培养的；免疫疗法
近来在抗肿瘤免疫的研究中发现，树突状细胞(DC)在抗原的递呈及激活淋巴细胞使其成为肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)方面有重要作用，因而有广泛的应用价值。目前的研究已证明，DC可由造血干细胞及外周血单核细胞等多种细胞诱导而来[1,2]。我们将分离脐血得到的单核细胞在白介素4(IL-4)、粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子( TNF-α)作用下于体外诱导DC的生成和向成熟分化，并观察其对卵巢癌抗原递呈、激活淋巴细胞产生CTL以及CTL在体外对卵巢癌细胞的杀伤作用。现报道如下。
材料与方法
一、材料来源
正常足月分娩产妇在胎儿娩出后，于无菌条件下取脐血约30～50 ml，肝素抗凝，共收集4份。合成培养液(DMEM及RPMI-1640)为美国Gibco公司产品；IL-4、GM-CSF和TNF-α购自美国Immunogenex公司；培养瓶和培养板购自美国Coring公司；单克隆抗体购自法国Immunotech公司；人浆液性囊腺癌细胞株HO9810购自上海细胞所；无关细胞(COS细胞，是一种用于转基因的包装细胞)为苏州医学院免疫室赠送；淋巴细胞分离液为上海生物化学试剂二厂生产；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品；荧光显微镜为日本Olympus公司生产的BX40型。
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二、 实验方法
1. 脐血单个核细胞的分离和DC的诱导： 脐血经Hank液按1∶4稀释后，采用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，计数后取部分细胞用E-花环分离得到T淋巴细胞，备用；其余细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度为2×105/ml，培养2 h后，去除悬浮细胞，获得单核细胞。DC的诱导方法[3]简述如下：将上述分离所得的单核细胞分两组接种于24孔板中，每孔1 ml，实验组1每孔中加入细胞因子IL-4(50 ng)、GM-CSF (100 ng)和TNF-α(1～2 ng)，置于含5% 二氧化碳、饱和湿度、37℃培养箱中培养，每3天半量换液1次，并在诱导DC的第10天，在其培养基中加入HO9810冻融抗原(每孔100 μl)，致敏48 h，获得DC；对照组1除未加上述细胞因子外，其余条件均相同。
2.细胞冻融抗原的制备：HO9810细胞置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养5 d后，取对数生长期肿瘤细胞，置于液氮中10 min，再迅速放在37℃水浴中，反复3次，取上清液经微孔滤膜过滤作为肿瘤抗原，4℃保存。
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3.细胞表型的测定：应用间接免疫荧光法检测分离脐血得到的单核细胞培养前、后细胞表型的变化，选用的单克隆抗体为 CD1a、CD14、CD16、CD19、CD40、CD56、CD80、CD83及人白细胞二类抗原(HLA-DR，法国Immunotech公司产品)。具体方法为：取培养前、后的脐血单核细胞，每孔1×105～2×105个，分别加入上述单抗，作用30 min，用磷酸缓冲液洗涤2次，再加异硫氰酸荧光二抗，30 min后，磷酸缓冲液洗涤 3次，荧光显微镜检测各细胞表型。
4.CTL诱导及抑制肿瘤的实验：将上述得到的DC与T淋巴细胞按1∶20比例，每孔1×106个细胞，分为两组分别加入24孔板中，37℃、5%二氧化碳培养72 h。实验组2把经DC激发、诱导的脐血T淋巴细胞(效应细胞)，与对数生长期的 HO9810细胞(靶细胞，每孔5×103个)，按效靶比分别为1∶1、10∶1、100∶1，共同培养72 h后获得CTL；对照组2除加入HO9810外，还加入了COS细胞。取体外诱导的CTL与肿瘤细胞HO9810，按1∶20比例混合，接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，分别培养24、48、72、96和120 h，并于培养的最后4 h中加入20 μl MTT溶液(50 mg/ml)，去除上清液，加入100 μl酸化异丙醇(含0.04 mol/L盐酸)彻底溶解蓝色的甲颗粒，用酶标仪在波长为570 nm时测定其吸光度(A)值。肿瘤细胞抑制率=[(对照组2 A值-实验组2 A值)/对照组2 A值]×100%。
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三、统计学方法
组间比较采用t′检验和秩和检验，数据用X±s表示。
结果
一、 DC的形态学改变和细胞表型分析
1. DC的形态学改变：实验组1细胞在培养12 h后，可见脐血单核细胞中贴壁细胞呈圆形，培养3 d后观察到细胞体出现树突状突起；第4天后，大多数细胞开始时呈悬浮生长，表现为树突状细胞外形，贴壁细胞呈集落样生长；培养7 d后，细胞均匀分散在培养基中。而对照组1则未见类似改变，细胞随着培养时间延长，细胞内开始出现颗粒，部分细胞开始裂解。
2. 细胞表型分析：采用间接荧光法对培养10 d后所获的细胞进行表型分析，结果表明，在体外经过细胞因子诱导后，高表达DC相关分化抗原CD1a、CD40、CD80、CD83和 HLA-DR，分别与对照组1比较，差异均有显著性(P<0.05)；仅有少部分细胞表达B淋巴细胞分化抗原CD19及自然杀伤细胞(NK)分化抗原CD16和CD56，与对照组1比较，差异均无显著性(P>0.05)。见表1。
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表1 两组胎儿脐血单核细胞细胞表型分析(%)
组别
CD1a
CD16
CD19
CD40
CD56
CD80
CD83
HLA-DR
实验组1
培养前
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5.60±2.40
11.20±5.45
16.20±0.30
5.00±5.40
10.00±1.70
4.00±1.90
4.00±1.90
23.54± 7.90
培养后
37.90±6.60
9.50±4.50
23.80±2.50
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46.80±3.40
13.00±2.80
73.50±6.20
50.20±5.40
78.50±15.40
对照组1
6.20±3.40
17.60±4.40
12.60±4.54
5.50±3.40
14.60±5.40
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2.86±2.45
7.50±2.00
27.60± 5.40
二、DC负载肿瘤抗原激发T淋巴细胞特异性的杀伤作用
实验组2 DC经HO9810细胞冻融抗原负载后，活化的CTL与HO9810细胞比(即效靶比)为10∶1时，可使肿瘤细胞生长受到抑制，并最终导致其死亡，显示负载了HO9810抗原的DC可以激发T淋巴细胞中肿瘤特异性CTL增殖，而对COS细胞的生长无抑制作用，这些CTL对肿瘤的杀伤作用具有抗原特异性；而对照组2 HO9810细胞生长良好，72 h达到高峰。见图1。进一步提高效靶比到100∶1时，CTL则对 HO9810细胞生长具有明显抑制作用，并使HO9810细胞死亡，与对照组2比较，差异有显著性(P<0.05)。
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图1 CTL对H09810肿瘤细胞的抑制作用
讨论
一、 DC的体外诱导及其意义
DC作为一种最重要的抗原递呈细胞早就被人们所重视，由于其在外周血中含量极少，仅占单核细胞总数的0.1%～1.0%，且分离纯化困难，故临床应用受到极大限制。近几年来,由于免疫学基础理论的深入研究和基因工程生产重组细胞因子获得成功，DC在许多恶性肿瘤的试验性治疗中取得了令人鼓舞的疗效[4]。DC作为载体负载肿瘤抗原后，可以激发机体有效的抗肿瘤免疫应答或在体外激发CTL细胞能有效杀伤肿瘤细胞，DC对于CTL识别和杀伤肿瘤细胞以及正常机体免疫监视功能的维持也有十分重要的意义。越来越多的研究表明，在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能缺陷，特别是DC的数量、功能和形态学的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展[5]。为获得足够治疗量的DC，多数实验室都通过分离 CD34+的造血干细胞，并联合应用多种细胞因子的培养体系，获得功能性(即成熟)DC。脐血来源丰富，其中CD34+细胞含量远较外周血为高，已有利用脐血诱导DC成功的报道[6]。本研究利用脐血分离DC前体细胞(即单核细胞)，并选用GM-CSF、IL-4和 TNF-α体外诱导DC，获得了较好的结果，体外连续观察发现，DC前体细胞在细胞因子的联合作用下，逐渐表现为典型的DC，培养第10天的细胞表型分析提示，该类细胞表达了CD1a、CD40、CD80及CD83等成熟DC的表型，说明所诱导生成的细胞是DC，而未加细胞因子的培养液中，DC前体细胞均没有表现为成熟DC的表型，且随着培养时间的延长，细胞内出现颗粒或细胞裂解等细胞凋亡的表现。我们的实验还表明，本研究所采用的细胞因子的组合不会导致其他具有粘附作用的细胞(如B淋巴细胞)增殖，从而保证了所得DC细胞的纯度，可以满足实验研究的需要。
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二、 DC负载肿瘤抗原的意义
如何使成熟的DC负载肿瘤抗原，是目前研究的热点，也是是否能诱导肿瘤特异性CTL产生的关健所在。现已有多种肿瘤抗原负载方法，其中包括直接用肿瘤抗原蛋白或其多肽片段与DC共同培养[7-12]，用病毒载体将编码肿瘤抗原的基因导入DC，甚至用编码肿瘤抗原的裸DNA或RNA直接对DC进行负载[9,11]。但现有方案主要是直接用肿瘤抗原或其多肽片段负载，这些抗原负载于成熟的DC中，可以在体外诱导T淋巴细胞产生肿瘤特异性CTL。Brossart等[12]和Mackey等[13]的研究发现，如在诱导DC的同时加入抗CD40单克隆抗体，则明显提高DC的活性，能在CD4+ 淋巴细胞不参与的情况下，诱导产生肿瘤特异性CTL并可产生持续有效的抗肿瘤作用。本研究使用冻融细胞的方法使DC负载肿瘤抗原，并成功地诱导了具有肿瘤特异性的CTL，与HO9810肿瘤细胞共同培养后显示明显的抗肿瘤效应。现有报道认为，利用CD34+细胞在体外经干细胞生长因子、白介素等作用后可显著增加DC的数量[14]。本研究结果提示，利用脐血中DC前体细胞在体外经 IL-4、 GM-CSF和TNF-α作用可成功诱导DC，并可负载肿瘤抗原。实验初步证实，通过我们所建立的方法在体外可有效抑制肿瘤细胞的生长，是一种方便、有效的肿瘤免疫治疗方法，尤其是在消灭手术后的残留肿瘤细胞方面有良好的临床应用前景。
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作者单位：刘艳(215004 苏州医学院第二附属医院妇产科)
朱美琪(215004 苏州医学院第二附属医院妇产科)
张弘(215004 苏州医学院第二附属医院妇产科)
参考文献
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12，Brossart P, Grunebach F, Stuhler G, et al. Generation of functional human dendritic cells from adherent peripheral blood monocytes by CD40 ligation in the absence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood, 1998,92:4238-4247.
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刘艳 朱美琪 张弘
摘 要 目的 探讨脐血来源的树突状细胞(DC)的体外诱导及其在抗肿瘤免疫中的作用。方法 无菌条件下常规采集脐血， 采用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，去除悬浮细胞后获得单核细胞。将获得的单核细胞分为两组，实验组1在含有细胞因子白介素4(IL-4)、粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的合成培养液DMEM中培养，对照组1培养液中未加上述细胞因子，第10天收集部分细胞进行细胞表型分析，并与人浆液性囊腺癌细胞株HO9810冻融抗原共同培养48 h后获得DC。将获得的DC与用 E-花环分离脐血单个核细胞得到的T淋巴细胞共同培养3 d，然后分为两组，实验组2继续与不同比例的HO9810细胞共同培养3 d后获得细胞毒T淋巴细胞(CTL)，对照组2除加入HO9810外，还加入了无关细胞(COS细胞)，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测其对HO9810细胞的抑制作用。结果 (1)IL-4、GM-CSF和TNF-α可诱导脐血来源的单核细胞(即DC前体细胞)分化为成熟的DC，10 d后实验组1分别高表达DC特异性抗原CD1a(37.90±6.60)%、CD40(46.80±3.40)%、CD80(73.50±6.20)%、CD83(50.20±5.40)%和人白细胞二类抗原[HLA-DR，(78.50±15.40)%]，分别与对照组1比较，差异均有显著性(P<0.05)。(2)DC可负载肿瘤抗原，并可诱导肿瘤特异性CTL的产生，当实验组2中 DC与肿瘤细胞的比例达到100∶1时，与对照组2比较，肿瘤细胞明显受到抑制(P<0.05)。结论 脐血中的DC前体细胞可在体外诱导成为功能性(即成熟)DC；并可诱导肿瘤特异性CTL的产生，是一种临床应用前景良好的、方便有效的肿瘤免疫治疗方法。
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关键词：血；树突细胞；囊腺癌，浆液；肿瘤细胞，培养的；免疫疗法
近来在抗肿瘤免疫的研究中发现，树突状细胞(DC)在抗原的递呈及激活淋巴细胞使其成为肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)方面有重要作用，因而有广泛的应用价值。目前的研究已证明，DC可由造血干细胞及外周血单核细胞等多种细胞诱导而来[1,2]。我们将分离脐血得到的单核细胞在白介素4(IL-4)、粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子( TNF-α)作用下于体外诱导DC的生成和向成熟分化，并观察其对卵巢癌抗原递呈、激活淋巴细胞产生CTL以及CTL在体外对卵巢癌细胞的杀伤作用。现报道如下。
材料与方法
一、材料来源
正常足月分娩产妇在胎儿娩出后，于无菌条件下取脐血约30～50 ml，肝素抗凝，共收集4份。合成培养液(DMEM及RPMI-1640)为美国Gibco公司产品；IL-4、GM-CSF和TNF-α购自美国Immunogenex公司；培养瓶和培养板购自美国Coring公司；单克隆抗体购自法国Immunotech公司；人浆液性囊腺癌细胞株HO9810购自上海细胞所；无关细胞(COS细胞，是一种用于转基因的包装细胞)为苏州医学院免疫室赠送；淋巴细胞分离液为上海生物化学试剂二厂生产；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品；荧光显微镜为日本Olympus公司生产的BX40型。
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二、 实验方法
1. 脐血单个核细胞的分离和DC的诱导： 脐血经Hank液按1∶4稀释后，采用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，计数后取部分细胞用E-花环分离得到T淋巴细胞，备用；其余细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度为2×105/ml，培养2 h后，去除悬浮细胞，获得单核细胞。DC的诱导方法[3]简述如下：将上述分离所得的单核细胞分两组接种于24孔板中，每孔1 ml，实验组1每孔中加入细胞因子IL-4(50 ng)、GM-CSF (100 ng)和TNF-α(1～2 ng)，置于含5% 二氧化碳、饱和湿度、37℃培养箱中培养，每3天半量换液1次，并在诱导DC的第10天，在其培养基中加入HO9810冻融抗原(每孔100 μl)，致敏48 h，获得DC；对照组1除未加上述细胞因子外，其余条件均相同。
2.细胞冻融抗原的制备：HO9810细胞置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养5 d后，取对数生长期肿瘤细胞，置于液氮中10 min，再迅速放在37℃水浴中，反复3次，取上清液经微孔滤膜过滤作为肿瘤抗原，4℃保存。
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3.细胞表型的测定：应用间接免疫荧光法检测分离脐血得到的单核细胞培养前、后细胞表型的变化，选用的单克隆抗体为 CD1a、CD14、CD16、CD19、CD40、CD56、CD80、CD83及人白细胞二类抗原(HLA-DR，法国Immunotech公司产品)。具体方法为：取培养前、后的脐血单核细胞，每孔1×105～2×105个，分别加入上述单抗，作用30 min，用磷酸缓冲液洗涤2次，再加异硫氰酸荧光二抗，30 min后，磷酸缓冲液洗涤 3次，荧光显微镜检测各细胞表型。
4.CTL诱导及抑制肿瘤的实验：将上述得到的DC与T淋巴细胞按1∶20比例，每孔1×106个细胞，分为两组分别加入24孔板中，37℃、5%二氧化碳培养72 h。实验组2把经DC激发、诱导的脐血T淋巴细胞(效应细胞)，与对数生长期的 HO9810细胞(靶细胞，每孔5×103个)，按效靶比分别为1∶1、10∶1、100∶1，共同培养72 h后获得CTL；对照组2除加入HO9810外，还加入了COS细胞。取体外诱导的CTL与肿瘤细胞HO9810，按1∶20比例混合，接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，分别培养24、48、72、96和120 h，并于培养的最后4 h中加入20 μl MTT溶液(50 mg/ml)，去除上清液，加入100 μl酸化异丙醇(含0.04 mol/L盐酸)彻底溶解蓝色的甲颗粒，用酶标仪在波长为570 nm时测定其吸光度(A)值。肿瘤细胞抑制率=[(对照组2 A值-实验组2 A值)/对照组2 A值]×100%。
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三、统计学方法
组间比较采用t′检验和秩和检验，数据用X±s表示。
结果
一、 DC的形态学改变和细胞表型分析
1. DC的形态学改变：实验组1细胞在培养12 h后，可见脐血单核细胞中贴壁细胞呈圆形，培养3 d后观察到细胞体出现树突状突起；第4天后，大多数细胞开始时呈悬浮生长，表现为树突状细胞外形，贴壁细胞呈集落样生长；培养7 d后，细胞均匀分散在培养基中。而对照组1则未见类似改变，细胞随着培养时间延长，细胞内开始出现颗粒，部分细胞开始裂解。
2. 细胞表型分析：采用间接荧光法对培养10 d后所获的细胞进行表型分析，结果表明，在体外经过细胞因子诱导后，高表达DC相关分化抗原CD1a、CD40、CD80、CD83和 HLA-DR，分别与对照组1比较，差异均有显著性(P<0.05)；仅有少部分细胞表达B淋巴细胞分化抗原CD19及自然杀伤细胞(NK)分化抗原CD16和CD56，与对照组1比较，差异均无显著性(P>0.05)。见表1。
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表1 两组胎儿脐血单核细胞细胞表型分析(%)
组别
CD1a
CD16
CD19
CD40
CD56
CD80
CD83
HLA-DR
实验组1
培养前
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5.60±2.40
11.20±5.45
16.20±0.30
5.00±5.40
10.00±1.70
4.00±1.90
4.00±1.90
23.54± 7.90
培养后
37.90±6.60
9.50±4.50
23.80±2.50
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46.80±3.40
13.00±2.80
73.50±6.20
50.20±5.40
78.50±15.40
对照组1
6.20±3.40
17.60±4.40
12.60±4.54
5.50±3.40
14.60±5.40
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2.86±2.45
7.50±2.00
27.60± 5.40
二、DC负载肿瘤抗原激发T淋巴细胞特异性的杀伤作用
实验组2 DC经HO9810细胞冻融抗原负载后，活化的CTL与HO9810细胞比(即效靶比)为10∶1时，可使肿瘤细胞生长受到抑制，并最终导致其死亡，显示负载了HO9810抗原的DC可以激发T淋巴细胞中肿瘤特异性CTL增殖，而对COS细胞的生长无抑制作用，这些CTL对肿瘤的杀伤作用具有抗原特异性；而对照组2 HO9810细胞生长良好，72 h达到高峰。见图1。进一步提高效靶比到100∶1时，CTL则对 HO9810细胞生长具有明显抑制作用，并使HO9810细胞死亡，与对照组2比较，差异有显著性(P<0.05)。
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图1 CTL对H09810肿瘤细胞的抑制作用
讨论
一、 DC的体外诱导及其意义
DC作为一种最重要的抗原递呈细胞早就被人们所重视，由于其在外周血中含量极少，仅占单核细胞总数的0.1%～1.0%，且分离纯化困难，故临床应用受到极大限制。近几年来,由于免疫学基础理论的深入研究和基因工程生产重组细胞因子获得成功，DC在许多恶性肿瘤的试验性治疗中取得了令人鼓舞的疗效[4]。DC作为载体负载肿瘤抗原后，可以激发机体有效的抗肿瘤免疫应答或在体外激发CTL细胞能有效杀伤肿瘤细胞，DC对于CTL识别和杀伤肿瘤细胞以及正常机体免疫监视功能的维持也有十分重要的意义。越来越多的研究表明，在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能缺陷，特别是DC的数量、功能和形态学的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展[5]。为获得足够治疗量的DC，多数实验室都通过分离 CD34+的造血干细胞，并联合应用多种细胞因子的培养体系，获得功能性(即成熟)DC。脐血来源丰富，其中CD34+细胞含量远较外周血为高，已有利用脐血诱导DC成功的报道[6]。本研究利用脐血分离DC前体细胞(即单核细胞)，并选用GM-CSF、IL-4和 TNF-α体外诱导DC，获得了较好的结果，体外连续观察发现，DC前体细胞在细胞因子的联合作用下，逐渐表现为典型的DC，培养第10天的细胞表型分析提示，该类细胞表达了CD1a、CD40、CD80及CD83等成熟DC的表型，说明所诱导生成的细胞是DC，而未加细胞因子的培养液中，DC前体细胞均没有表现为成熟DC的表型，且随着培养时间的延长，细胞内出现颗粒或细胞裂解等细胞凋亡的表现。我们的实验还表明，本研究所采用的细胞因子的组合不会导致其他具有粘附作用的细胞(如B淋巴细胞)增殖，从而保证了所得DC细胞的纯度，可以满足实验研究的需要。
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二、 DC负载肿瘤抗原的意义
如何使成熟的DC负载肿瘤抗原，是目前研究的热点，也是是否能诱导肿瘤特异性CTL产生的关健所在。现已有多种肿瘤抗原负载方法，其中包括直接用肿瘤抗原蛋白或其多肽片段与DC共同培养[7-12]，用病毒载体将编码肿瘤抗原的基因导入DC，甚至用编码肿瘤抗原的裸DNA或RNA直接对DC进行负载[9,11]。但现有方案主要是直接用肿瘤抗原或其多肽片段负载，这些抗原负载于成熟的DC中，可以在体外诱导T淋巴细胞产生肿瘤特异性CTL。Brossart等[12]和Mackey等[13]的研究发现，如在诱导DC的同时加入抗CD40单克隆抗体，则明显提高DC的活性，能在CD4+ 淋巴细胞不参与的情况下，诱导产生肿瘤特异性CTL并可产生持续有效的抗肿瘤作用。本研究使用冻融细胞的方法使DC负载肿瘤抗原，并成功地诱导了具有肿瘤特异性的CTL，与HO9810肿瘤细胞共同培养后显示明显的抗肿瘤效应。现有报道认为，利用CD34+细胞在体外经干细胞生长因子、白介素等作用后可显著增加DC的数量[14]。本研究结果提示，利用脐血中DC前体细胞在体外经 IL-4、 GM-CSF和TNF-α作用可成功诱导DC，并可负载肿瘤抗原。实验初步证实，通过我们所建立的方法在体外可有效抑制肿瘤细胞的生长，是一种方便、有效的肿瘤免疫治疗方法，尤其是在消灭手术后的残留肿瘤细胞方面有良好的临床应用前景。
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作者单位：刘艳(215004 苏州医学院第二附属医院妇产科)
朱美琪(215004 苏州医学院第二附属医院妇产科)
张弘(215004 苏州医学院第二附属医院妇产科)
参考文献
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