妊娠高血压综合征患者血浆对体外培养的内皮细胞合成血管活性物质的影响
妊娠高血压综合征患者血浆对体外培养的内皮细胞合成血管活性物质的影响
周玲 杨梦庚 李东红
摘 要 目的 探讨妊娠高血压综合征(妊高征)患者的血浆对体外培养的内皮细胞合成血管活性物质的影响，和妊高征患者血浆中是否存在某些引起内皮细胞损伤的物质。方法 应用放射免疫法测定20例先兆子痫患者(先兆子痫组)及15例正常晚期妊娠妇女(正常晚孕组)产前血浆前列环素(PGI2)代谢产物6-keto-PGF1α、血栓素(TXA2)代谢产物TXB2的水平。在体外培养的牛肺动脉内皮细胞中分别加入先兆子痫患者和正常晚期妊娠妇女的血浆，测定24 h后内皮细胞释放的6-keto-PGF1α和TXB2水平。结果 (1) 先兆子痫组血浆6-keto-PGF1α水平为(94.49±25.23) ng/L，TXB2水平为(104.61±13.12) ng/L，TXB2/6-keto-PGF1α比值为1.11±0.03。正常晚孕组血浆6-keto-PGF1α水平为(248.81±51.99) ng/L，TXB2水平为(66.26±38.80) ng/L，TXB2 /6-keto-PGF1α比值为0.28±0.02。与正常晚孕组比较，先兆子痫组血浆6-keto-PGF1α水平显著降低(P<0.01)，TXB2水平显著升高(P<0.01)；两组的TXB2 /6-keto-PGF1α比值比较，差异有极显著性(P<0.01)。(2)加入先兆子痫患者血浆的内皮细胞释放的6-keto-PGF1α为(1 363.00±99.16) ng/L，加入正常晚期妊娠妇女血浆的内皮细胞释放的6-keto-PGF1α为(819.49±96.62) ng/L，两者比较，差异有极显著性(P<0.01)。结论 (1)妊高征患者的血浆中存在某些能刺激体外培养的内皮细胞合成PGI2。(2)TXA2和PGI2平衡失调是妊高征病因之一。
, 百拇医药
关键词：妊娠并发症，心血管；高血压；先兆子痫；依前列醇；血栓烷类；内皮
妊娠高血压综合征(妊高征)是常见的严重危害母婴健康的妊娠并发症，它的病理生理学特征是血管反应性增加，凝血机理激活，这些都与内皮细胞功能有关。妊高征内皮细胞损伤是胎盘产生的物质释放入孕妇血循环引起的。这一说法可通过研究妊高征患者的血清或血浆对体外培养的内皮细胞的影响来证实。本研究是在体外培养的牛肺动脉内皮细胞中加入先兆子痫患者或正常晚期妊娠妇女的血浆，共同孵育24 h后，测定内皮细胞释放的前列环素(PGI2)和血栓素(TXA2)的水平，判断先兆子痫患者血浆中是否存在某些影响内皮细胞合成血管活性物质的因子。
资料与方法
一、研究对象
选择1998年9月～1999年3月在第四军医大学唐都医院产科住院患者，其中先兆子痫患者(先兆子痫组)20例，妊高征的诊断标准参照全国统编教材《妇产科学》第4版。正常晚期妊娠妇女(正常晚孕组)15例， 为同期住院健康孕妇。两组既往均无高血压、心脏病、糖尿病及肝肾病史。先兆子痫组平均年龄为(26.95±9.63)岁， 平均孕周为(37.25±2.72)周；正常晚孕组平均年龄为(26.67±8.09)岁，平均孕周为(37.93±3.07)周，两组孕妇年龄、 孕周比较，差异均无显著性(P>0.05)
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二、实验方法
1.标本采集:两组孕妇均于入院后抽取肘静脉血3 ml于硅化抗凝管中，与消炎痛-依地酸-Na 2充分混匀后立即进行分离，4℃下离心(3 500 r/min) 15 min，分离血浆，置-20℃冻存。先兆子痫组于药物治疗前采血。
2.内皮细胞培养: 原代牛肺动脉内皮细胞由第四军医大学口腔医院细胞培养实验室提供。按Davidge等[1]的方法进行传代培养，传代后的第3、4代细胞用于实验研究。
3.实验步骤: 在加入血浆前使细胞在无血清的培养液中培养24 h，目的是去除细胞分泌的基础PGI2对实验结果的影响。将细胞用0.05%胰蛋白酶及0.53 mmol/L依地酸消化分散后，置于24孔板中(每孔含细胞数约为1×105个)生长为单层后，加入肝素化的血浆(培养液中的血浆浓度为2%)共同孵育24 h后，收集培养液待测。
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4.测定方法:由于TXA2和PGI2的不稳定性，故以测定TXA2的代谢产物TXB2和PGI2的代谢产物6-keto-PGF1α作为判断其水平的指标。放射免疫药盒购自解放军总医院东亚免疫技术研究所。操作严格按说明书进行。
三、统计学处理
本研究数据以X±s表示，采用t检验进行统计学分析。
结果
一、两组孕妇TXB2、6-keto-PGF1α水平比较
先兆子痫组的血浆TXB2水平显著高于正常晚孕组(P<0.01)，6-keto-PGF1α水平显著低于正常晚孕组(P<0.01)，TXB2/6-keto-PGFIα的比值也存在极显著性差异(P<0.01)。见表1。
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表1 两组孕妇血浆TXB2、6-keto-PGF1α检测结果
比较(ng/L，X±s)
组别
例数
TXB2
6-keto-
PGF1α
TXB2/6-keto-
PGF1α比值
先兆子痫组
20
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104.61±13.12*
94.49±25.23*
1.11±0.03*
正常晚孕组
15
66.26±38.80
248.81±51.99
0.28±0.02
* 与正常晚孕组比较，P<0.01 二、加入两组孕妇血浆的内皮细胞培养液中6-keto-PGF1α水平比较
于体外培养的内皮细胞中分别加入两组孕妇的血浆后培养24 h，测定内皮细胞释放的6-keto-PGF1α水平， 先兆子痫组为(1 363.00±99.16) ng/L,正常晚孕组为(819.49±96.62) ng/L,两组比较，差异有极显著性(P<0.01)。
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讨论
一、血管活性物质PGI2、TXA2与妊高征发病的关系
PGI2是由血管内皮细胞合成的，TXA2主要是由血小板微粒体合成的，两者的合成底物为花生四烯酸(AA)，AA在环加氧酶的催化作用下生成前列腺素过氧化物， 后者分别在前列腺素合成酶(在动脉壁内层)和血栓素合成酶(在血小板中)的催化作用下生成PGI2和TXA2。PGI2经一系列分解代谢之后，生成多种终末产物，最后经肾脏排出体外。PGI2是一种抗血小板聚集和舒张血管的生物活性物质，其降解产物为6-keto-PGF1α。TXA2主要是一种具有强烈促血管收缩和血小板聚集的生物活性物质，其降解产物为TXB2。
在正常生理状态下，血浆或组织中TXA2和PGI2的比值处于相对平衡，以保持机体的内环境稳定，由于病理因素引起TXA2和PGI2平衡失调是造成血小板聚集、血管痉挛和血栓形成的原因之一。正常妊娠妇女PGI2水平增高，有利于维持正常血压，增加子宫胎盘血流，阻止循环血栓形成，维持正常孕妇的生理状态。本研究表明，先兆子痫患者血浆中PGI2水平明显低于正常孕妇，而TXA2水平明显高于正常孕妇，两者的比值也存在显著性差异，提示妊高征患者存在TXA2和PGI2平衡失调。PGI2与TXA2平衡失调导致患者发生广泛的小血管痉挛及血小板聚集倾向，引起各主要器官的缺血及纤维素沉积，血流减少，特别是肾脏，子宫和胎盘灌流不足，临床表现为血压升高、蛋白尿以及胎盘功能减退、胎儿宫内生长迟缓等。先兆子痫患者PGI2合成减少的原因，可能与前列腺素合成酶的缺乏或合成前体缺乏有关，也可能与血液中抑制前列腺素合成物质的活性增加有关。
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二、妊高征患者血浆对体外培养的内皮细胞合成PGI2的影响
本研究证实，先兆子痫患者血中PGI2水平低于正常妊娠妇女，而用同组先兆子痫患者的血浆却能够刺激内皮细胞产生更多的PGI2。我们的研究与Groot等[2]的结果相同，这种体外实验结果与体内生理状态的不一致，可能原因是:(1) 反馈调节,妊高征患者的血浆中PGI2减少通过正反馈机理，促进内皮细胞合成PGI2，其血浆中可能存在某些因子对血浆PGI2减少产生应答，这些因子可能是在局部或远处产生反馈调节因子。本研究中，先兆子痫患者的血浆在24 h内能引起体外培养的牛肺动脉内皮细胞合成PGI2增加，可能与反馈调节有关。(2)先兆子痫患者血浆中脂蛋白、脂质过氧化物能激活环氧化酶，使PGI2合成增多。(3)有研究证实,妊高征患者血中磷脂酶A2水平升高[3]，而催化细胞膜磷脂释放AA的酶正是磷脂酶，其水平升高必然引起AA的增多，底物增加，PGI2合成随之增加。内皮细胞通过增加PGI2的产生来对凝血酶及其他重要的生理刺激进行应答。(4)孵育时间太短。Winn等[4]的实验表明，在体外培养的内皮细胞中加入先兆子痫患者的血浆共同孵育24 h后，会引起PGI2合成增加，而随着孵育时间延长，PGI2合成逐渐减少。Lorentzen等[5]发现，妊高征患者的血浆能使培养的内皮细胞PGI2释放减少， 先兆子痫直到妊娠晚期才出现明显的临床特征，而内皮细胞损伤在妊娠早期就已出现，所以将内皮细胞暴露于患者的血液中的时间可能几天、几星期甚至几个月功能才开始减退。(5)垂直切应力(SS)对实验结果的影响。Baker的研究显示无SS时， 先兆子痫患者血浆培养的内皮细胞合成释放PGI2的水平高于正常孕妇，加入SS后，两组孕妇的PGI2释放量无显著性差异[6]。 机体内皮细胞是受SS的作用，而体外实验无SS，这可能是导致体内、体外不一致的原因之一。Wellings等[7]的研究表明，使用不同的内皮细胞所得实验结果也不尽相同。 本实验使用牛肺动脉内皮细胞，是因为这种细胞的内皮合成系统对SS不敏感[6]，这样可使体外环境和体内环境SS 对内皮细胞影响的差别减至最小。但是使用人的血管内皮细胞似乎能更好地反应人体内环境中内皮细胞的改变。究竟用何种内皮细胞还需进一步探讨。
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作者单位：周玲(710038 西安，第四军医大学唐都医院妇产科)
杨梦庚(710038 西安，第四军医大学唐都医院妇产科)
李东红(710038 西安，第四军医大学唐都医院妇产科)
参考文献
1，Davidge ST, Signorella AP, Hubel CA, et al. Distinct factors in plasma of preeclamptic women increase endothelial nitric oxide or prostacyclin.Hypertension,1996,28:758-764.
2，Groot CJ, Murai JT, Vigen JL,et al.Eicosanoid secretion by human endothelial cells exposed to normal pregnancy and preeclampsia plasma in vitro.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids,1998,58:91-97.
, http://www.100md.com
3，Lim KH,Rice GE, Groot CJ. Plasma type Ⅱ phospholipase A2 levels are elevated in severe preeclampsia.Am J Obstet Gynecol,1995,172: 998-1002.
4，Winn HN,Todd HM,Amon E, et al. Effects of serum from preeclamptic women on prostacyclin production by human endothelial cells.J Matern Fetal Med,1997,6:249-253.
5，Lorentzen B,Endresen MJ, Hovig T, et al. Sera from preeclamptic women increase the content of triglycerides and reduce the release of prostacyclin in cultured endothelial cells.Thromb Res,1991,63:363-372.
, 百拇医药
6，Baker PN, Stranko CP, Davidge ST, et al. Mechanical stress eliminates the effects of plasma from patients with preeclampsia on endothelial cells.Am J Obstet Gynecol,1996,174:730-736.
7，Wellings RP, Brockelsby JC, Baker PN.Activation of endothelial cells by plasma from women with preeclampsia:diffrential effects on four endothelial cell types. J Soc Gynecol Invest,1998,5:31-37., 百拇医药
周玲 杨梦庚 李东红
摘 要 目的 探讨妊娠高血压综合征(妊高征)患者的血浆对体外培养的内皮细胞合成血管活性物质的影响，和妊高征患者血浆中是否存在某些引起内皮细胞损伤的物质。方法 应用放射免疫法测定20例先兆子痫患者(先兆子痫组)及15例正常晚期妊娠妇女(正常晚孕组)产前血浆前列环素(PGI2)代谢产物6-keto-PGF1α、血栓素(TXA2)代谢产物TXB2的水平。在体外培养的牛肺动脉内皮细胞中分别加入先兆子痫患者和正常晚期妊娠妇女的血浆，测定24 h后内皮细胞释放的6-keto-PGF1α和TXB2水平。结果 (1) 先兆子痫组血浆6-keto-PGF1α水平为(94.49±25.23) ng/L，TXB2水平为(104.61±13.12) ng/L，TXB2/6-keto-PGF1α比值为1.11±0.03。正常晚孕组血浆6-keto-PGF1α水平为(248.81±51.99) ng/L，TXB2水平为(66.26±38.80) ng/L，TXB2 /6-keto-PGF1α比值为0.28±0.02。与正常晚孕组比较，先兆子痫组血浆6-keto-PGF1α水平显著降低(P<0.01)，TXB2水平显著升高(P<0.01)；两组的TXB2 /6-keto-PGF1α比值比较，差异有极显著性(P<0.01)。(2)加入先兆子痫患者血浆的内皮细胞释放的6-keto-PGF1α为(1 363.00±99.16) ng/L，加入正常晚期妊娠妇女血浆的内皮细胞释放的6-keto-PGF1α为(819.49±96.62) ng/L，两者比较，差异有极显著性(P<0.01)。结论 (1)妊高征患者的血浆中存在某些能刺激体外培养的内皮细胞合成PGI2。(2)TXA2和PGI2平衡失调是妊高征病因之一。
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关键词：妊娠并发症，心血管；高血压；先兆子痫；依前列醇；血栓烷类；内皮
妊娠高血压综合征(妊高征)是常见的严重危害母婴健康的妊娠并发症，它的病理生理学特征是血管反应性增加，凝血机理激活，这些都与内皮细胞功能有关。妊高征内皮细胞损伤是胎盘产生的物质释放入孕妇血循环引起的。这一说法可通过研究妊高征患者的血清或血浆对体外培养的内皮细胞的影响来证实。本研究是在体外培养的牛肺动脉内皮细胞中加入先兆子痫患者或正常晚期妊娠妇女的血浆，共同孵育24 h后，测定内皮细胞释放的前列环素(PGI2)和血栓素(TXA2)的水平，判断先兆子痫患者血浆中是否存在某些影响内皮细胞合成血管活性物质的因子。
资料与方法
一、研究对象
选择1998年9月～1999年3月在第四军医大学唐都医院产科住院患者，其中先兆子痫患者(先兆子痫组)20例，妊高征的诊断标准参照全国统编教材《妇产科学》第4版。正常晚期妊娠妇女(正常晚孕组)15例， 为同期住院健康孕妇。两组既往均无高血压、心脏病、糖尿病及肝肾病史。先兆子痫组平均年龄为(26.95±9.63)岁， 平均孕周为(37.25±2.72)周；正常晚孕组平均年龄为(26.67±8.09)岁，平均孕周为(37.93±3.07)周，两组孕妇年龄、 孕周比较，差异均无显著性(P>0.05)
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二、实验方法
1.标本采集:两组孕妇均于入院后抽取肘静脉血3 ml于硅化抗凝管中，与消炎痛-依地酸-Na 2充分混匀后立即进行分离，4℃下离心(3 500 r/min) 15 min，分离血浆，置-20℃冻存。先兆子痫组于药物治疗前采血。
2.内皮细胞培养: 原代牛肺动脉内皮细胞由第四军医大学口腔医院细胞培养实验室提供。按Davidge等[1]的方法进行传代培养，传代后的第3、4代细胞用于实验研究。
3.实验步骤: 在加入血浆前使细胞在无血清的培养液中培养24 h，目的是去除细胞分泌的基础PGI2对实验结果的影响。将细胞用0.05%胰蛋白酶及0.53 mmol/L依地酸消化分散后，置于24孔板中(每孔含细胞数约为1×105个)生长为单层后，加入肝素化的血浆(培养液中的血浆浓度为2%)共同孵育24 h后，收集培养液待测。
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4.测定方法:由于TXA2和PGI2的不稳定性，故以测定TXA2的代谢产物TXB2和PGI2的代谢产物6-keto-PGF1α作为判断其水平的指标。放射免疫药盒购自解放军总医院东亚免疫技术研究所。操作严格按说明书进行。
三、统计学处理
本研究数据以X±s表示，采用t检验进行统计学分析。
结果
一、两组孕妇TXB2、6-keto-PGF1α水平比较
先兆子痫组的血浆TXB2水平显著高于正常晚孕组(P<0.01)，6-keto-PGF1α水平显著低于正常晚孕组(P<0.01)，TXB2/6-keto-PGFIα的比值也存在极显著性差异(P<0.01)。见表1。
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表1 两组孕妇血浆TXB2、6-keto-PGF1α检测结果
比较(ng/L，X±s)
组别
例数
TXB2
6-keto-
PGF1α
TXB2/6-keto-
PGF1α比值
先兆子痫组
20
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104.61±13.12*
94.49±25.23*
1.11±0.03*
正常晚孕组
15
66.26±38.80
248.81±51.99
0.28±0.02
* 与正常晚孕组比较，P<0.01 二、加入两组孕妇血浆的内皮细胞培养液中6-keto-PGF1α水平比较
于体外培养的内皮细胞中分别加入两组孕妇的血浆后培养24 h，测定内皮细胞释放的6-keto-PGF1α水平， 先兆子痫组为(1 363.00±99.16) ng/L,正常晚孕组为(819.49±96.62) ng/L,两组比较，差异有极显著性(P<0.01)。
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讨论
一、血管活性物质PGI2、TXA2与妊高征发病的关系
PGI2是由血管内皮细胞合成的，TXA2主要是由血小板微粒体合成的，两者的合成底物为花生四烯酸(AA)，AA在环加氧酶的催化作用下生成前列腺素过氧化物， 后者分别在前列腺素合成酶(在动脉壁内层)和血栓素合成酶(在血小板中)的催化作用下生成PGI2和TXA2。PGI2经一系列分解代谢之后，生成多种终末产物，最后经肾脏排出体外。PGI2是一种抗血小板聚集和舒张血管的生物活性物质，其降解产物为6-keto-PGF1α。TXA2主要是一种具有强烈促血管收缩和血小板聚集的生物活性物质，其降解产物为TXB2。
在正常生理状态下，血浆或组织中TXA2和PGI2的比值处于相对平衡，以保持机体的内环境稳定，由于病理因素引起TXA2和PGI2平衡失调是造成血小板聚集、血管痉挛和血栓形成的原因之一。正常妊娠妇女PGI2水平增高，有利于维持正常血压，增加子宫胎盘血流，阻止循环血栓形成，维持正常孕妇的生理状态。本研究表明，先兆子痫患者血浆中PGI2水平明显低于正常孕妇，而TXA2水平明显高于正常孕妇，两者的比值也存在显著性差异，提示妊高征患者存在TXA2和PGI2平衡失调。PGI2与TXA2平衡失调导致患者发生广泛的小血管痉挛及血小板聚集倾向，引起各主要器官的缺血及纤维素沉积，血流减少，特别是肾脏，子宫和胎盘灌流不足，临床表现为血压升高、蛋白尿以及胎盘功能减退、胎儿宫内生长迟缓等。先兆子痫患者PGI2合成减少的原因，可能与前列腺素合成酶的缺乏或合成前体缺乏有关，也可能与血液中抑制前列腺素合成物质的活性增加有关。
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二、妊高征患者血浆对体外培养的内皮细胞合成PGI2的影响
本研究证实，先兆子痫患者血中PGI2水平低于正常妊娠妇女，而用同组先兆子痫患者的血浆却能够刺激内皮细胞产生更多的PGI2。我们的研究与Groot等[2]的结果相同，这种体外实验结果与体内生理状态的不一致，可能原因是:(1) 反馈调节,妊高征患者的血浆中PGI2减少通过正反馈机理，促进内皮细胞合成PGI2，其血浆中可能存在某些因子对血浆PGI2减少产生应答，这些因子可能是在局部或远处产生反馈调节因子。本研究中，先兆子痫患者的血浆在24 h内能引起体外培养的牛肺动脉内皮细胞合成PGI2增加，可能与反馈调节有关。(2)先兆子痫患者血浆中脂蛋白、脂质过氧化物能激活环氧化酶，使PGI2合成增多。(3)有研究证实,妊高征患者血中磷脂酶A2水平升高[3]，而催化细胞膜磷脂释放AA的酶正是磷脂酶，其水平升高必然引起AA的增多，底物增加，PGI2合成随之增加。内皮细胞通过增加PGI2的产生来对凝血酶及其他重要的生理刺激进行应答。(4)孵育时间太短。Winn等[4]的实验表明，在体外培养的内皮细胞中加入先兆子痫患者的血浆共同孵育24 h后，会引起PGI2合成增加，而随着孵育时间延长，PGI2合成逐渐减少。Lorentzen等[5]发现，妊高征患者的血浆能使培养的内皮细胞PGI2释放减少， 先兆子痫直到妊娠晚期才出现明显的临床特征，而内皮细胞损伤在妊娠早期就已出现，所以将内皮细胞暴露于患者的血液中的时间可能几天、几星期甚至几个月功能才开始减退。(5)垂直切应力(SS)对实验结果的影响。Baker的研究显示无SS时， 先兆子痫患者血浆培养的内皮细胞合成释放PGI2的水平高于正常孕妇，加入SS后，两组孕妇的PGI2释放量无显著性差异[6]。 机体内皮细胞是受SS的作用，而体外实验无SS，这可能是导致体内、体外不一致的原因之一。Wellings等[7]的研究表明，使用不同的内皮细胞所得实验结果也不尽相同。 本实验使用牛肺动脉内皮细胞，是因为这种细胞的内皮合成系统对SS不敏感[6]，这样可使体外环境和体内环境SS 对内皮细胞影响的差别减至最小。但是使用人的血管内皮细胞似乎能更好地反应人体内环境中内皮细胞的改变。究竟用何种内皮细胞还需进一步探讨。
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作者单位：周玲(710038 西安，第四军医大学唐都医院妇产科)
杨梦庚(710038 西安，第四军医大学唐都医院妇产科)
李东红(710038 西安，第四军医大学唐都医院妇产科)
参考文献
1，Davidge ST, Signorella AP, Hubel CA, et al. Distinct factors in plasma of preeclamptic women increase endothelial nitric oxide or prostacyclin.Hypertension,1996,28:758-764.
2，Groot CJ, Murai JT, Vigen JL,et al.Eicosanoid secretion by human endothelial cells exposed to normal pregnancy and preeclampsia plasma in vitro.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids,1998,58:91-97.
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3，Lim KH,Rice GE, Groot CJ. Plasma type Ⅱ phospholipase A2 levels are elevated in severe preeclampsia.Am J Obstet Gynecol,1995,172: 998-1002.
4，Winn HN,Todd HM,Amon E, et al. Effects of serum from preeclamptic women on prostacyclin production by human endothelial cells.J Matern Fetal Med,1997,6:249-253.
5，Lorentzen B,Endresen MJ, Hovig T, et al. Sera from preeclamptic women increase the content of triglycerides and reduce the release of prostacyclin in cultured endothelial cells.Thromb Res,1991,63:363-372.
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6，Baker PN, Stranko CP, Davidge ST, et al. Mechanical stress eliminates the effects of plasma from patients with preeclampsia on endothelial cells.Am J Obstet Gynecol,1996,174:730-736.
7，Wellings RP, Brockelsby JC, Baker PN.Activation of endothelial cells by plasma from women with preeclampsia:diffrential effects on four endothelial cell types. J Soc Gynecol Invest,1998,5:31-37., 百拇医药