甲真菌病组织切片及溶甲涂片中真菌的凝集素结合形式
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中华皮肤科杂志 2000年第33卷第5期
甲真菌病组织切片及溶甲涂片中真菌的凝集素结合形式
杨国玲 崔春华 林熙然 郭伟
摘 要 目的 探讨甲真菌病组织切片、溶甲涂片中真菌的凝集素结合形式，并检测其与培养中相应真菌凝集素结合形式是否等同。方法 对已分离鉴定致病菌的72例甲真菌病的病甲组织切片、溶甲涂片，用ABC法对12种凝集素进行组化染色，并与已知培养中的相应菌种进行比较。结果 44例甲组织切片、28例溶甲涂片内7个种、属的真菌与其培养中的相应真菌呈现相同的凝集素结合形式，仅铁锈色小孢子菌豌豆凝集素的结合形式与培养中不同，从而表明真菌表面的糖蛋白作为凝集素受体的结构颇为稳定，在经过标本制备处理后仍保持种、属的特点。溶甲涂片方法还具有阳性率高和省时的优点。结论 甲组织切片、溶甲涂片内真菌的凝集素结合形式与培养中相应真菌具有相同的凝集素结合形式，有助于甲真菌病病原菌的鉴定。
, http://www.100md.com
关键词：真菌病；组织学；真菌；凝集素染色
凝集素具有识别特异糖蛋白并与之结合的能力，而真菌细胞表面结合糖的成分因菌种而有所差异，故特定的凝集素结合形式可能成为菌种鉴定的指标之一。林俊萍等[1]和郭伟等[2]曾分别报道了培养中的14种皮肤癣菌和13种常见条件致病菌与14种凝集素的结合形式，显示凝集素与真菌的结合形式在一定程度上具有属，乃至种的特点。本研究在此基础上，对已经分离鉴定出致病菌的甲真菌病组织切片及溶甲涂片中的真菌进行凝集素组化染色，考察其结合形式与培养中相应真菌的凝集素结合形式是否等同，以探讨是否有助于甲真菌病的病原学诊断。
材料与方法
(一)对象：为72例具有典型临床表现、KOH直
接镜检阳性，真菌培养已鉴定出病原菌的甲真菌病。
, 百拇医药
(二)材料：
1.试剂及来源：生物素标记凝集素和链霉亲和素(s-a)为美国Vector公司产品。其中12种凝集素包括：刀豆凝集素(ConA)、扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、麦胚凝集素(WGA)、花生凝集素(PNA)、蓖麻凝集素(RCA)、双花藕豆凝集素(DBA)、槐凝集素(SJA)、西非单叶豆凝集素(BSA-1)、荆豆凝集素(UEA-1)、菜豆凝集素E及L(PHA-E及PHA-L)。二氨基联苯胺(DAB)为美国Sigma公司产品D5637。
2.已分离鉴定出菌种的44例甲组织切片及28例溶甲涂片包括：红色毛癣菌23例，铁锈色小孢子菌4例，絮状表皮癣菌2例，念珠菌属16例，曲霉属11例，青霉属3例，镰刀菌属3例，念珠菌属+曲霉属3例，念珠菌属+红色毛癣菌4例，曲霉属+红色毛癣菌2例，念珠菌属+青霉属1例。
表144例甲组织内及28例溶甲涂片真菌的凝集素结合形式
, 百拇医药
红色毛癣菌(n=23)
铁锈色小孢子菌(n=4)
絮状表皮癣菌(n=2)
念珠菌属(n=16)
曲霉属(n=11)
青霉属(n=3)
镰刀菌属(n=3)
念珠菌属+曲霉菌属(n=3)
念珠菌属+红色毛癣菌(n=4)
曲霉属+红色毛癣菌(n=2)
念珠菌属+青霉属(n=1)
, 百拇医药
ConA
, 百拇医药
WGA
-
, 百拇医药
LCA
+
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, http://www.100md.com PSA
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+*
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BSA-1
, http://www.100md.com
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PHA-E
, 百拇医药
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PNA
, http://www.100md.com -
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RCA
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, 百拇医药
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DBA
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, 百拇医药
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SJA
-
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, 百拇医药 -
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UEA-1
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, 百拇医药 -
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-
PHA-L
-
, 百拇医药
+
-
+
-
+
-
+
注：*表示与培养中真菌具有不同的凝集素结合形式
, 百拇医药
(三)方法：
1.甲组织切片的制作：将取下的甲组织修成3mm×3mm×3mm大小，置3.33mol/L(10%)福尔马林液固定12～24h，经3.17mol/L(20%)硝酸脱钙3d，饱和碳酸锂过夜，水洗5～6h，常规脱水包埋，制成5μm厚切片，进行组化染色。
2.溶甲涂片的制作：将靶甲先以无菌蒸馏水及16.29mol/L(75%)酒精各刷洗2次，无菌取下病甲组织，置5.0mol/L(20%)NaOH溶液37℃软化2h，无菌蒸馏水水洗，离心(3000r/min)5min，3次,倾去上清液，取管底沉淀物涂片，烤干，待染色。
3.凝集素染色：按本教研室常规ABC方法进行12种凝集素染色，每种凝集素及空白对照试验均重复1次，并以正常人皮肤做阳性对照证明本方法的可重复性。在光学显微镜下观察结果。与正常空白对照相比呈深棕色为强阳性()，呈棕黄色为阳性(+)，无明显差异为阴性(-)。
, 百拇医药
结果
44例甲组织切片和28例溶甲涂片中真菌的凝集素结合形式见表1。同一种真菌在组织内与溶甲涂片中凝集素结合形式完全相同。红色毛癣菌、铁锈色小孢子菌、絮状表皮癣菌、念珠菌属、曲霉属、青霉属及镰刀菌属的7个种属ConA、PSA均呈阳性反应，其余10种凝集素的结合形式则各不相同，显示这些真菌在甲组织切片和溶甲涂片中与凝集素结合形式具有属间特点及部分种间特点(见图1～4)。10例分离出混合种属者，其凝集素结合形式呈现叠加的特点。
讨论
结果表明，每一菌种甲真菌病组织切片和溶甲涂片的凝集素结合形式均与培养的相应菌种相同。只有铁锈色小孢子菌PSA的结合特点不同，但不影响其种、属的特点。可见真菌细胞表面的结合糖作为凝集素受体的结构颇为稳定，经过处理后仍保持其属乃至种的特点。据此推测，对临床病甲标本进行凝集素染色，将其结合形式与培养的标准(保存)菌种的结合形式比较，可能在直接检出甲内真菌成分而确认其病原性的同时，鉴定其菌属乃至部分菌种。
, 百拇医药
根据临床检验的记录，KOH直接镜检阳性率为50%～75%，真菌培养的阳性率为25%～80%，溶甲涂片的阳性率为95%～98%，溶甲涂片法不但阳性率高，而且可在9h内判定菌属乃至部分菌种，对及时决定治疗药物的选择有帮助。本研究72例7个菌属占大连地区甲真菌病病原菌分布的95.1%[3]。尽管具有相当大的菌种覆盖面，但尚未包括所有菌种，因此，有待于进一步的补充和完善，以得出更成熟的结论。
图1甲组织切片红色毛癣菌凝集素染色ABC法WGA()×400
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图2溶甲涂片红色毛癣菌凝集素染色ABC法ConA()×400
图3甲组织切片念珠菌属凝集素染色ABC法ConA()×400
, 百拇医药
图4溶甲涂片念珠菌属凝集素染色ABC法ConA()×400
辽宁省自然科学基金和中华医学会皮肤科分会资助课题
作者单位：杨国玲(116011大连医科大学附属第一医院皮肤病学教研室)
崔春华(116011大连医科大学附属第一医院皮肤病学教研室)
林熙然(116011大连医科大学附属第一医院皮肤病学教研室)
郭伟(116011大连医科大学附属第一医院皮肤病学教研室)
参考文献
[1]林俊萍，白兆震，王雅坤，等.某些皮肤癣菌凝集素结合形式.中华皮肤科杂志，1997，30:334-335.
[2]郭伟，孙亦新，林熙然，等.常见条件致病性真菌凝集素结合形式.中华皮肤科杂志，1994，27:35-36.
[3]杨国玲，林熙然，戴文英.197例甲真菌病真菌分离培养.中华皮肤科杂志,1998，31:315., 百拇医药
杨国玲 崔春华 林熙然 郭伟
摘 要 目的 探讨甲真菌病组织切片、溶甲涂片中真菌的凝集素结合形式，并检测其与培养中相应真菌凝集素结合形式是否等同。方法 对已分离鉴定致病菌的72例甲真菌病的病甲组织切片、溶甲涂片，用ABC法对12种凝集素进行组化染色，并与已知培养中的相应菌种进行比较。结果 44例甲组织切片、28例溶甲涂片内7个种、属的真菌与其培养中的相应真菌呈现相同的凝集素结合形式，仅铁锈色小孢子菌豌豆凝集素的结合形式与培养中不同，从而表明真菌表面的糖蛋白作为凝集素受体的结构颇为稳定，在经过标本制备处理后仍保持种、属的特点。溶甲涂片方法还具有阳性率高和省时的优点。结论 甲组织切片、溶甲涂片内真菌的凝集素结合形式与培养中相应真菌具有相同的凝集素结合形式，有助于甲真菌病病原菌的鉴定。
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关键词：真菌病；组织学；真菌；凝集素染色
凝集素具有识别特异糖蛋白并与之结合的能力，而真菌细胞表面结合糖的成分因菌种而有所差异，故特定的凝集素结合形式可能成为菌种鉴定的指标之一。林俊萍等[1]和郭伟等[2]曾分别报道了培养中的14种皮肤癣菌和13种常见条件致病菌与14种凝集素的结合形式，显示凝集素与真菌的结合形式在一定程度上具有属，乃至种的特点。本研究在此基础上，对已经分离鉴定出致病菌的甲真菌病组织切片及溶甲涂片中的真菌进行凝集素组化染色，考察其结合形式与培养中相应真菌的凝集素结合形式是否等同，以探讨是否有助于甲真菌病的病原学诊断。
材料与方法
(一)对象：为72例具有典型临床表现、KOH直
接镜检阳性，真菌培养已鉴定出病原菌的甲真菌病。
, 百拇医药
(二)材料：
1.试剂及来源：生物素标记凝集素和链霉亲和素(s-a)为美国Vector公司产品。其中12种凝集素包括：刀豆凝集素(ConA)、扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、麦胚凝集素(WGA)、花生凝集素(PNA)、蓖麻凝集素(RCA)、双花藕豆凝集素(DBA)、槐凝集素(SJA)、西非单叶豆凝集素(BSA-1)、荆豆凝集素(UEA-1)、菜豆凝集素E及L(PHA-E及PHA-L)。二氨基联苯胺(DAB)为美国Sigma公司产品D5637。
2.已分离鉴定出菌种的44例甲组织切片及28例溶甲涂片包括：红色毛癣菌23例，铁锈色小孢子菌4例，絮状表皮癣菌2例，念珠菌属16例，曲霉属11例，青霉属3例，镰刀菌属3例，念珠菌属+曲霉属3例，念珠菌属+红色毛癣菌4例，曲霉属+红色毛癣菌2例，念珠菌属+青霉属1例。
表144例甲组织内及28例溶甲涂片真菌的凝集素结合形式
, 百拇医药
红色毛癣菌(n=23)
铁锈色小孢子菌(n=4)
絮状表皮癣菌(n=2)
念珠菌属(n=16)
曲霉属(n=11)
青霉属(n=3)
镰刀菌属(n=3)
念珠菌属+曲霉菌属(n=3)
念珠菌属+红色毛癣菌(n=4)
曲霉属+红色毛癣菌(n=2)
念珠菌属+青霉属(n=1)
, 百拇医药
ConA
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注：*表示与培养中真菌具有不同的凝集素结合形式
, 百拇医药
(三)方法：
1.甲组织切片的制作：将取下的甲组织修成3mm×3mm×3mm大小，置3.33mol/L(10%)福尔马林液固定12～24h，经3.17mol/L(20%)硝酸脱钙3d，饱和碳酸锂过夜，水洗5～6h，常规脱水包埋，制成5μm厚切片，进行组化染色。
2.溶甲涂片的制作：将靶甲先以无菌蒸馏水及16.29mol/L(75%)酒精各刷洗2次，无菌取下病甲组织，置5.0mol/L(20%)NaOH溶液37℃软化2h，无菌蒸馏水水洗，离心(3000r/min)5min，3次,倾去上清液，取管底沉淀物涂片，烤干，待染色。
3.凝集素染色：按本教研室常规ABC方法进行12种凝集素染色，每种凝集素及空白对照试验均重复1次，并以正常人皮肤做阳性对照证明本方法的可重复性。在光学显微镜下观察结果。与正常空白对照相比呈深棕色为强阳性(
)，呈棕黄色为阳性(+)，无明显差异为阴性(-)。, 百拇医药
结果
44例甲组织切片和28例溶甲涂片中真菌的凝集素结合形式见表1。同一种真菌在组织内与溶甲涂片中凝集素结合形式完全相同。红色毛癣菌、铁锈色小孢子菌、絮状表皮癣菌、念珠菌属、曲霉属、青霉属及镰刀菌属的7个种属ConA、PSA均呈阳性反应，其余10种凝集素的结合形式则各不相同，显示这些真菌在甲组织切片和溶甲涂片中与凝集素结合形式具有属间特点及部分种间特点(见图1～4)。10例分离出混合种属者，其凝集素结合形式呈现叠加的特点。
讨论
结果表明，每一菌种甲真菌病组织切片和溶甲涂片的凝集素结合形式均与培养的相应菌种相同。只有铁锈色小孢子菌PSA的结合特点不同，但不影响其种、属的特点。可见真菌细胞表面的结合糖作为凝集素受体的结构颇为稳定，经过处理后仍保持其属乃至种的特点。据此推测，对临床病甲标本进行凝集素染色，将其结合形式与培养的标准(保存)菌种的结合形式比较，可能在直接检出甲内真菌成分而确认其病原性的同时，鉴定其菌属乃至部分菌种。
, 百拇医药
根据临床检验的记录，KOH直接镜检阳性率为50%～75%，真菌培养的阳性率为25%～80%，溶甲涂片的阳性率为95%～98%，溶甲涂片法不但阳性率高，而且可在9h内判定菌属乃至部分菌种，对及时决定治疗药物的选择有帮助。本研究72例7个菌属占大连地区甲真菌病病原菌分布的95.1%[3]。尽管具有相当大的菌种覆盖面，但尚未包括所有菌种，因此，有待于进一步的补充和完善，以得出更成熟的结论。
图1甲组织切片红色毛癣菌凝集素染色ABC法WGA(
)×400, http://www.100md.com
图2溶甲涂片红色毛癣菌凝集素染色ABC法ConA(
)×400图3甲组织切片念珠菌属凝集素染色ABC法ConA(
)×400, 百拇医药
图4溶甲涂片念珠菌属凝集素染色ABC法ConA(
)×400辽宁省自然科学基金和中华医学会皮肤科分会资助课题
作者单位：杨国玲(116011大连医科大学附属第一医院皮肤病学教研室)
崔春华(116011大连医科大学附属第一医院皮肤病学教研室)
林熙然(116011大连医科大学附属第一医院皮肤病学教研室)
郭伟(116011大连医科大学附属第一医院皮肤病学教研室)
参考文献
[1]林俊萍，白兆震，王雅坤，等.某些皮肤癣菌凝集素结合形式.中华皮肤科杂志，1997，30:334-335.
[2]郭伟，孙亦新，林熙然，等.常见条件致病性真菌凝集素结合形式.中华皮肤科杂志，1994，27:35-36.
[3]杨国玲，林熙然，戴文英.197例甲真菌病真菌分离培养.中华皮肤科杂志,1998，31:315., 百拇医药