小檗碱抗皮肤癣菌作用的研究
http://www.100md.com
中华皮肤科杂志 2000年第33卷第5期
小檗碱抗皮肤癣菌作用的研究
徐薇 赵俊英 曹仁烈
关键词；小檗碱；皮肤癣菌
我们自1997年6月至1999年2月采用试管内液基稀释法测定了小檗碱对部分致病性真菌的最小抑菌浓度(MIC)，通过电镜观察药物作用后真菌的超微结构改变。并对小檗碱溶液治疗浅部真菌病的作用进行了实验动物观察。
一、材料与方法
(一)小檗碱对部分致病性真菌最小抑菌浓度的测定：
1.药物与菌种：小檗碱由北京制药六厂提供。皮肤癣菌56株中红色毛癣菌36株，须癣毛癣菌6株，絮状表皮癣菌8株，羊毛状小孢子菌6株；念珠菌属10株。
, 百拇医药
2.抑菌实验：将小檗碱用2.5%二甲基亚砜(DMSO)溶解后，倍比稀释成以下不同浓度的药液培养基，每毫升含药量依次为400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56μg，另设二组对照管，依次为含2.5%DMSO管和空白对照管。待测真菌用0.9%灭菌盐水制成菌液，最终含菌量控制在1×105～5×105cfu/mL。将制备好的各株菌的菌悬液加入药液培养基后，置温箱培养6d后观察结果。
3.结果判定：按0、+、、和5个等级记录，0级表示真菌未生长，培养液清晰；+级表示真菌略有生长，培养液微混；级表示真菌约有50%的生长；级表示真菌生长后的浊度比无药对照管稍有减少；级表示浊度与对照管相同，真菌完全生长。终点判定为80%的真菌被抑制(0～+)时的第1个药物浓度即定为其MIC值。1周后完全按上述方法和程序重复1次。
(二)电镜观察：在含有200μg/mL的小檗碱沙堡斜面上接种米粒大小菌块(须————————
, 百拇医药
癣毛癣菌)，25℃孵育7d，采取小块菌落，常规制备扫描电镜和透射电镜标本观察。
(三)动物试验：
1.受试动物Wistar大鼠20只，为国家标准动物，鼠龄3个月左右，体重400g左右，均为雄性。
2.受试药物：治疗组，小檗碱由北京制药六厂提供，以DMSO溶解后，配成质量浓度为200μg/mL的溶液。对照组，5%DMSO。空白对照组，0.9%灭菌生理盐水，以观察真菌感染的自然消长。
3.方法：将大鼠适应性饲喂1周后，以受试大鼠背面的左侧、中侧和右侧为感染区，常规感染须癣毛癣菌，并经真菌镜检、真菌培养和组织病理证实后，在上述三处分别外用小檗碱溶液、5%DMSO溶液和0.9%灭菌生理盐水。每感染处涂药2次/d，连续8周，每3d进行一次真菌镜检和皮损观察。
, 百拇医药 4.疗效判断：痊愈为皮损完全消退，真菌学检查阴性；显效为皮损消退>60%，真菌学检查阴性；好转为皮损消退20%～60%，真菌学检查阴性或阳性；无效为皮损消退<20%，真菌学检查阳性；复发为临床痊愈后，在原处出现皮损，真菌学检查阳性。
二、结果
(一)小檗碱对部分致病性真菌最小抑菌浓度的测定：溶媒对照与生长对照均见菌落生长，可见2.5%DMSO无抑制真菌作用。小檗碱对红色毛癣菌、须癣毛癣菌和絮状表皮癣菌的MIC值均为200
μg/mL，对羊毛状小孢子菌的MIC值为100μg/mL，对念珠菌属无明显抑菌作用。在含有200μg/mL小檗碱的沙堡斜面上，接种须癣毛癣菌，并与含2%DMSO的沙堡固基做对比，可见含小檗碱的沙堡斜面上的菌落明显<2%DMSO组，而2%DMSO组与0.9%生理盐水组菌落大小相近。取小块菌落观察，发现经小檗碱处理后，透射电镜下细胞壁不完整，边缘模糊，细胞膜皱缩，与胞膜分离，细胞浆空泡增大，细胞破坏明显，可见大量电子薄区，细胞核结构破坏。扫描电镜下菌丝皱缩、断裂、变形、紊乱，孢子粗糙，形状不等。
, 百拇医药
(二)动物实验：背部接种须癣毛癣菌的大鼠至第6天感染形成，经真菌镜检和真菌培养证实，并做病理经PAS染色，在角质层中可见到菌丝和孢子。确定真菌感染形成后，开始外用药治疗。治疗组涂药后7d痊愈4只，10d痊愈12只，14d痊愈2只，20d痊愈2只，治疗20d左右，局部感染处开始生长毛发，至40d左右基本恢复，PAS染色未见菌丝和孢子。对照组涂药后35d痊愈2只，42d痊愈4只，45d痊愈12只，49d痊愈2只，毛发恢复时间长达50d。空白对照组，即真菌的自然消长在感染后60d。
三、讨论
小檗碱是从植物黄连、黄柏等药用植物中提取出来的有效成分，我们测定了小檗碱对部分致病性皮肤癣菌的最小抑菌浓度，并用扫描和透射电镜观察到，小檗碱作用后细胞壁、细胞膜和细胞浆均发生明显变形、破坏。根据此结果，我们又做了动物试验，本次动物试验采用自身对照试验，结果发现治疗组痊愈天数平均为10.8d；而对照组痊愈天数平均为43.8d，明显高于治疗组。上述研究表明小檗碱对皮肤癣菌有较强的抑制作用，机理可能为小檗碱影响了真菌细胞膜合成或代谢的某个环节，改变其通透性，使药物进入细胞内，导致细胞溶解、细胞器消失，体外动物试验也表明外涂小檗碱后，临床和真菌学检查均在短时间内消失和转阴。, 百拇医药
徐薇 赵俊英 曹仁烈
关键词；小檗碱；皮肤癣菌
我们自1997年6月至1999年2月采用试管内液基稀释法测定了小檗碱对部分致病性真菌的最小抑菌浓度(MIC)，通过电镜观察药物作用后真菌的超微结构改变。并对小檗碱溶液治疗浅部真菌病的作用进行了实验动物观察。
一、材料与方法
(一)小檗碱对部分致病性真菌最小抑菌浓度的测定：
1.药物与菌种：小檗碱由北京制药六厂提供。皮肤癣菌56株中红色毛癣菌36株，须癣毛癣菌6株，絮状表皮癣菌8株，羊毛状小孢子菌6株；念珠菌属10株。
, 百拇医药
2.抑菌实验：将小檗碱用2.5%二甲基亚砜(DMSO)溶解后，倍比稀释成以下不同浓度的药液培养基，每毫升含药量依次为400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56μg，另设二组对照管，依次为含2.5%DMSO管和空白对照管。待测真菌用0.9%灭菌盐水制成菌液，最终含菌量控制在1×105～5×105cfu/mL。将制备好的各株菌的菌悬液加入药液培养基后，置温箱培养6d后观察结果。
3.结果判定：按0、+、、和5个等级记录，0级表示真菌未生长，培养液清晰；+级表示真菌略有生长，培养液微混；级表示真菌约有50%的生长；级表示真菌生长后的浊度比无药对照管稍有减少；级表示浊度与对照管相同，真菌完全生长。终点判定为80%的真菌被抑制(0～+)时的第1个药物浓度即定为其MIC值。1周后完全按上述方法和程序重复1次。
(二)电镜观察：在含有200μg/mL的小檗碱沙堡斜面上接种米粒大小菌块(须————————
, 百拇医药
癣毛癣菌)，25℃孵育7d，采取小块菌落，常规制备扫描电镜和透射电镜标本观察。
(三)动物试验：
1.受试动物Wistar大鼠20只，为国家标准动物，鼠龄3个月左右，体重400g左右，均为雄性。
2.受试药物：治疗组，小檗碱由北京制药六厂提供，以DMSO溶解后，配成质量浓度为200μg/mL的溶液。对照组，5%DMSO。空白对照组，0.9%灭菌生理盐水，以观察真菌感染的自然消长。
3.方法：将大鼠适应性饲喂1周后，以受试大鼠背面的左侧、中侧和右侧为感染区，常规感染须癣毛癣菌，并经真菌镜检、真菌培养和组织病理证实后，在上述三处分别外用小檗碱溶液、5%DMSO溶液和0.9%灭菌生理盐水。每感染处涂药2次/d，连续8周，每3d进行一次真菌镜检和皮损观察。
, 百拇医药 4.疗效判断：痊愈为皮损完全消退，真菌学检查阴性；显效为皮损消退>60%，真菌学检查阴性；好转为皮损消退20%～60%，真菌学检查阴性或阳性；无效为皮损消退<20%，真菌学检查阳性；复发为临床痊愈后，在原处出现皮损，真菌学检查阳性。
二、结果
(一)小檗碱对部分致病性真菌最小抑菌浓度的测定：溶媒对照与生长对照均见菌落生长，可见2.5%DMSO无抑制真菌作用。小檗碱对红色毛癣菌、须癣毛癣菌和絮状表皮癣菌的MIC值均为200
μg/mL，对羊毛状小孢子菌的MIC值为100μg/mL，对念珠菌属无明显抑菌作用。在含有200μg/mL小檗碱的沙堡斜面上，接种须癣毛癣菌，并与含2%DMSO的沙堡固基做对比，可见含小檗碱的沙堡斜面上的菌落明显<2%DMSO组，而2%DMSO组与0.9%生理盐水组菌落大小相近。取小块菌落观察，发现经小檗碱处理后，透射电镜下细胞壁不完整，边缘模糊，细胞膜皱缩，与胞膜分离，细胞浆空泡增大，细胞破坏明显，可见大量电子薄区，细胞核结构破坏。扫描电镜下菌丝皱缩、断裂、变形、紊乱，孢子粗糙，形状不等。
, 百拇医药
(二)动物实验：背部接种须癣毛癣菌的大鼠至第6天感染形成，经真菌镜检和真菌培养证实，并做病理经PAS染色，在角质层中可见到菌丝和孢子。确定真菌感染形成后，开始外用药治疗。治疗组涂药后7d痊愈4只，10d痊愈12只，14d痊愈2只，20d痊愈2只，治疗20d左右，局部感染处开始生长毛发，至40d左右基本恢复，PAS染色未见菌丝和孢子。对照组涂药后35d痊愈2只，42d痊愈4只，45d痊愈12只，49d痊愈2只，毛发恢复时间长达50d。空白对照组，即真菌的自然消长在感染后60d。
三、讨论
小檗碱是从植物黄连、黄柏等药用植物中提取出来的有效成分，我们测定了小檗碱对部分致病性皮肤癣菌的最小抑菌浓度，并用扫描和透射电镜观察到，小檗碱作用后细胞壁、细胞膜和细胞浆均发生明显变形、破坏。根据此结果，我们又做了动物试验，本次动物试验采用自身对照试验，结果发现治疗组痊愈天数平均为10.8d；而对照组痊愈天数平均为43.8d，明显高于治疗组。上述研究表明小檗碱对皮肤癣菌有较强的抑制作用，机理可能为小檗碱影响了真菌细胞膜合成或代谢的某个环节，改变其通透性，使药物进入细胞内，导致细胞溶解、细胞器消失，体外动物试验也表明外涂小檗碱后，临床和真菌学检查均在短时间内消失和转阴。, 百拇医药