白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3免疫原性的影响
白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3免疫原性的影响
张震宇 郎景和
摘 要 目的 探讨白细胞介素2 (IL-2)基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3免疫原性的影响。方法 应用流式细胞术，测定SKOV3细胞组织相容性白细胞抗原(HLA)HLA-ABC、HLA-DQ及HLA-DR分子的表达，51Cr-4h释放实验显示SKOV3、SKOV3/Neo、SKOV3/IL-2细胞对自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞杀伤的敏感性。结果 SKOV3/IL-2细胞中HLA-ABC、 HLA-DQ 及HLA-DR分子的表达率(17.7%、19.1%及9.4%)较SKOV3(1.5%、2.4%及4.7%)和SKOV3/Neo(4.3%、6.9%及2.1%)显著提高；SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2细胞对NK细胞的杀伤均不敏感，但SKOV3/IL-2细胞对LAK细胞的杀伤敏感性较SKOV3、SKOV3/Neo细胞提高约1倍，差异有非常显著性；肿瘤细胞与淋巴细胞混合培养显示，淋巴细胞有向SKOV3/IL-2细胞聚集的趋势。结论 IL-2基因转导可提高卵巢癌细胞系SKOV3的免疫原性。
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关键词：卵巢肿瘤；白细胞介素2；基因转移；癌症疫苗；肿瘤细胞，培养的
肿瘤免疫属T淋巴细胞免疫[1]，由于肿瘤相关抗原的抗原性弱、肿瘤细胞组织相容性白细胞抗原(HLA)及共刺激信号B7低表达或不表达，致使肿瘤抗原不能有效递呈，最终导致机体对肿瘤细胞的免疫耐受[2,3]。基因重组技术的不断完善，由分子水平修饰肿瘤细胞的设想成为现实[4]。本研究旨在探讨白细胞介素2 (IL-2)基因转导对卵巢癌细胞免疫原性的影响，及IL-2基因修饰卵巢癌细胞作为肿瘤疫苗的可能性。
材料与方法
一、细胞系
SKOV3为卵巢腺癌细胞系，由北京协和医院妇产科制备。SKOV3/Neo由逆转录病毒介导，将新霉素抗性基因Neo导入SKOV3细胞而建立，具有新霉素抗性[5]。SKOV3/IL-2由逆转录病毒介导，将IL-2基因导入SKOV3细胞而建立，IL-2每24 h分泌量为318 U/106个细胞，具有新霉素抗性[5]。
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二、方法
1.细胞HLA分子检测：待测肿瘤细胞共1×106个，分别与鼠抗人HLA-ABC、HLA-DR及HLA-DQ单克隆抗体(购于中国华美公司)稀释液混合、孵育、洗涤，用荧光标记的兔抗鼠IgG标记，2%多聚甲醛固定过夜，第2天应用流式细胞仪检测表达上述3种免疫分子的细胞比例。
2.自然杀伤(NK)细胞的制备：外周血单个核细胞经密度梯度离心法分离后，置于培养瓶中常规培养1 h，去除贴壁的单核细胞，未贴壁细胞用于NK细胞杀伤实验。
3.淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养：培养体系为含10%新出生牛血清和5×10-5 mol/L二巯基乙醇的PRIM-1640培养液。取正常成人外周血淋巴细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml；待测肿瘤细胞经60Co 50 Gy照射，调整细胞浓度为5×104个/ml；取96孔培养板，每孔加入淋巴细胞悬液、肿瘤细胞悬液各100 μ1，孵育36～48 h，显微镜下观察淋巴细胞生长情况。
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4.淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞的诱导：培养体系为含10%人AB血清、1 000 μ/ml重组人IL-2(r-h-IL-2)、5×10-5 mol/L 二巯基乙醇、2% 血清白蛋白及5 μ/ml植物血凝素的PRIM-1640培养液。将正常成人外周血淋巴细胞，加入上述培养体系，常规培养5～7 d。
5.淋巴细胞杀伤活性的测定：以SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2为靶细胞，应用51Cr对其进行标记；分别以NK和LAK细胞为效应细胞，设3个效靶比，分别为100∶1、50∶1和10∶1，将效应细胞与靶细胞混合(实验组)，同时设加PRMI-1640培养液者为自然释放组，设加6 mol/L盐酸者为最大释放组，γ计数仪测定各孔上清液放射性强度(cpm)。自然释放率和杀伤活性的计算公式如下：
结果
一、SKOV3及其基因修饰细胞HLA分子的表达
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SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2 3类细胞HLA-ABC、HLA-DR和HLA-DQ分子的表达率见表1。与SKOV3和SKOV3/Neo比较，SKOV3/IL-2细胞HLA-ABC和HLA-DQ分子的表达率均有提高，差异有非常显著性(P<0.001)。
二、SKOV3及其基因修饰细胞对NK细胞杀伤的敏感性
3种靶细胞对NK细胞的杀伤作用均不敏感，差异无显著性(P>0.05)，见表2。
表1 SKOV3及其基因修饰细胞HLA分子的表达率(%)
类别
HLA-ABC
HLA-DR
HLA-DQ
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SKOV3
1.5
4.7
2.4
SKOV3/Neo
4.3
2.1
6.9
SKOV3/IL-2
17.7
9.4
19.1
表2 3种靶细胞对不同效靶比NK细胞杀伤的敏感性(%)
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类别
100∶1
50∶1
10∶1
SKOV3
6.5
3.4
0.0
SKOV3/Neo
5.3
4.2
0.0
SKOV3/IL-2
, http://www.100md.com
6.8
4.6
0.0
三、SKOV3及其基因修饰细胞对LAK细胞杀伤的敏感性
LAK对3种靶细胞均有不同程度的杀伤效应，SKOV3/IL-2细胞对LAK杀伤的敏感性最高，3个效靶比的杀伤敏感性均分别为SKOV3、SKOV3/Neo的2倍，差别有非常显著性(P<0.001)，见表3。表3 3种靶细胞对不同效靶比LNK细胞杀伤的敏感性(%)
类别
100∶1
50∶1
10∶1
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SKOV3
39.5
20.1
12.1
SKOV3/Neo
34.4
15.3
12.5
SKOV3/IL-2
75.6
40.0
33.3
四、肿瘤细胞和淋巴细胞混合培养情况
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淋巴细胞与肿瘤细胞共培养36～48 h后，含SKOV3/IL-2细胞的培养孔内，淋巴细胞以肿瘤细胞为中心聚集成簇，可见淋巴细胞围绕于肿瘤细胞周围，呈花瓣状；含SKOV3、SKOV3/Neo细胞的培养孔内淋巴细胞均匀分布于培养皿底部，呈沙粒状，未见淋巴细胞将肿瘤细胞包绕的现象。
讨论
细胞免疫原性的高低，在一定程度上取决于细胞免疫分子表达的强弱。目前，已知的免疫分子主要有HLA、B7及肿瘤相关抗原(TAA)等[1, 6, 7]。TAA是一种相对分子质量极小的肽，必须与肿瘤细胞或多形核白细胞膜表面的HLA(又称为主要组织相容复合物，MHC)分子结合，才能被T淋巴细胞表面受体(TCR)识别，继而T淋巴细胞被激活、扩增，发挥免疫效应，这种识别受T淋巴细胞膜表面HLA分子的限制。可见免疫分子在肿瘤免疫调控中具有极为重要的意义，肿瘤细胞MHC分子多为低表达甚至不表达，是肿瘤免疫耐受的主要原因之一[4]。
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本研究显示，IL-2基因转导可增强卵巢癌细胞系SKOV3的免疫原性，主要表现在以下两个方面：(1) 在淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养过程中，可见淋巴细胞向SKOV3/IL-2细胞聚集、包绕；裸鼠皮下成瘤实验中，在SKOV3/IL-2组肿瘤包膜周围，可见大量单个核细胞渗出，向肿瘤组织浸润[8]，说明IL-2基因修饰肿瘤细胞与淋巴细胞间有cross-tal(“通讯”)[9]现象存在。(2) IL-2基因修饰细胞对LAK细胞的敏感性较亲本细胞明显增强。IL-2基因转导细胞的免疫原性增强，可能与以下因素有关：(1)IL-2基因转导使肿瘤细胞膜表面MHC分子表达上调、抗原性增强，有利于肿瘤抗原的递呈、识别，激发抗肿瘤免疫，对打破肿瘤免疫耐受具有极其重要的意义；(2) SKOV3/IL-2细胞可分泌IL-2，IL-2是淋巴细胞活化和维持增殖的重要因子[10]，SKOV3/IL-2细胞所分泌的IL-2，改变了肿瘤细胞局部的微环境，利于淋巴细胞的生存，因此，可对淋巴细胞产生一种类似趋化的作用。Fearon等[11]证实，IL-2基因修饰的肿瘤细胞的抗原递呈能力增强，不需辅助性T细胞参予即可激活T淋巴细胞。可见，通过转基因技术，改善肿瘤细胞免疫相关分子的表达，可打破肿瘤免疫耐受状况。
, 百拇医药
对卵巢癌以外的其他诸多肿瘤基因转导动物模型的研究证实, IL-2基因转导可提高肿瘤细胞MHC的表达，改善肿瘤细胞局部的免疫微环境，激活CD8+T淋巴细胞，产生针对野生型肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应，可作为肿瘤疫苗，治疗已荷肿瘤，抵御肿瘤再次侵袭[12,13]。IL-2基因转导使人卵巢癌细胞免疫原性增强，提示IL-2基因修饰卵巢癌细胞有望成为肿瘤疫苗，用于卵巢癌的预防与治疗。
作者单位：张震宇(100700 北京军区总医院妇产科)
郎景和(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科)
参考文献
1，Baxevanis CN, Papamihail M. Characterization of the anti-tumor immune response in human cancers and strategies for immunotherapy. Crit Rev Oncol Hematol, 1994, 16:157-179.
, 百拇医药
2，Mondino A, Khoruts A, Jenkins MK. The anatomy of T-cell activation and tolerance. Proc Natl Acad Sci USA， 1996， 93: 2245-2252.
3，Browning MJ, Bodmer WF. MHC antigen and cancer: implications for T-cell surveillance. Curr Opinion Immunol, 1992, 4: 613-618.
4，Bruyns C, Gerard C, Velu T. Cancer escape from immune surveillance: how can it be overcome by gene transfer Eur J Cancer, 1994, 30: 1176-1181.
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5，张震宇，郎景和. 白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞SKOV3形态及增殖的影响. 中华妇产科杂志，1998，33: 614-617.
6，Germain RN. MHC-dependent antigen processing and peptide presentation: providing ligands for T lymphocyte activation. Cell, 1994, 76: 287-299.
7，Boussiotis VA, Treeman GJ, Gribben JG, et al. Activated human B lymphocytes express three CTLA-4 counterreceptors that costimulate T-cell activation. Proc Nat Acad Sci USA, 1993, 90:11059-11063,11112.
, 百拇医药
8，张震宇，郎景和. 白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3致瘤性的影响. 妇产科新进展，1998, 7:122-126.
9，Colombo MP, Modesti A, Parmiana G. Local cytokine availability elicits tumor rejection and systemic immunity through granulocyte-T-lymphocyte cross-talk. Cancer Res, 1992, 52: 4853-4857.
10，周廷冲, 主编. 多肽生长因子基础与临床. 北京：中国科技出版社，1992. 268-279.
11，Fearon ER, Pardoll DM, Itaya T, et al. Interleukin-2 production by tumor cells bypasses T helper function in the generation of an antitumor response. Cell， 1990, 60: 397-403.
12，Gansbacher BB, Zier K, Daniels B, et al. Interleukin 2 gene transfer into tumor cells abrogates tumorigenicity and induces protective immunity. J Exp Med 1990, 172: 1217-1224.
13，Dalgleish D. The role of IL-2 in gene therapy. Gene Therapy, 1994, 1: 83-87., 百拇医药
张震宇 郎景和
摘 要 目的 探讨白细胞介素2 (IL-2)基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3免疫原性的影响。方法 应用流式细胞术，测定SKOV3细胞组织相容性白细胞抗原(HLA)HLA-ABC、HLA-DQ及HLA-DR分子的表达，51Cr-4h释放实验显示SKOV3、SKOV3/Neo、SKOV3/IL-2细胞对自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞杀伤的敏感性。结果 SKOV3/IL-2细胞中HLA-ABC、 HLA-DQ 及HLA-DR分子的表达率(17.7%、19.1%及9.4%)较SKOV3(1.5%、2.4%及4.7%)和SKOV3/Neo(4.3%、6.9%及2.1%)显著提高；SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2细胞对NK细胞的杀伤均不敏感，但SKOV3/IL-2细胞对LAK细胞的杀伤敏感性较SKOV3、SKOV3/Neo细胞提高约1倍，差异有非常显著性；肿瘤细胞与淋巴细胞混合培养显示，淋巴细胞有向SKOV3/IL-2细胞聚集的趋势。结论 IL-2基因转导可提高卵巢癌细胞系SKOV3的免疫原性。
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关键词：卵巢肿瘤；白细胞介素2；基因转移；癌症疫苗；肿瘤细胞，培养的
肿瘤免疫属T淋巴细胞免疫[1]，由于肿瘤相关抗原的抗原性弱、肿瘤细胞组织相容性白细胞抗原(HLA)及共刺激信号B7低表达或不表达，致使肿瘤抗原不能有效递呈，最终导致机体对肿瘤细胞的免疫耐受[2,3]。基因重组技术的不断完善，由分子水平修饰肿瘤细胞的设想成为现实[4]。本研究旨在探讨白细胞介素2 (IL-2)基因转导对卵巢癌细胞免疫原性的影响，及IL-2基因修饰卵巢癌细胞作为肿瘤疫苗的可能性。
材料与方法
一、细胞系
SKOV3为卵巢腺癌细胞系，由北京协和医院妇产科制备。SKOV3/Neo由逆转录病毒介导，将新霉素抗性基因Neo导入SKOV3细胞而建立，具有新霉素抗性[5]。SKOV3/IL-2由逆转录病毒介导，将IL-2基因导入SKOV3细胞而建立，IL-2每24 h分泌量为318 U/106个细胞，具有新霉素抗性[5]。
, 百拇医药
二、方法
1.细胞HLA分子检测：待测肿瘤细胞共1×106个，分别与鼠抗人HLA-ABC、HLA-DR及HLA-DQ单克隆抗体(购于中国华美公司)稀释液混合、孵育、洗涤，用荧光标记的兔抗鼠IgG标记，2%多聚甲醛固定过夜，第2天应用流式细胞仪检测表达上述3种免疫分子的细胞比例。
2.自然杀伤(NK)细胞的制备：外周血单个核细胞经密度梯度离心法分离后，置于培养瓶中常规培养1 h，去除贴壁的单核细胞，未贴壁细胞用于NK细胞杀伤实验。
3.淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养：培养体系为含10%新出生牛血清和5×10-5 mol/L二巯基乙醇的PRIM-1640培养液。取正常成人外周血淋巴细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml；待测肿瘤细胞经60Co 50 Gy照射，调整细胞浓度为5×104个/ml；取96孔培养板，每孔加入淋巴细胞悬液、肿瘤细胞悬液各100 μ1，孵育36～48 h，显微镜下观察淋巴细胞生长情况。
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4.淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞的诱导：培养体系为含10%人AB血清、1 000 μ/ml重组人IL-2(r-h-IL-2)、5×10-5 mol/L 二巯基乙醇、2% 血清白蛋白及5 μ/ml植物血凝素的PRIM-1640培养液。将正常成人外周血淋巴细胞，加入上述培养体系，常规培养5～7 d。
5.淋巴细胞杀伤活性的测定：以SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2为靶细胞，应用51Cr对其进行标记；分别以NK和LAK细胞为效应细胞，设3个效靶比，分别为100∶1、50∶1和10∶1，将效应细胞与靶细胞混合(实验组)，同时设加PRMI-1640培养液者为自然释放组，设加6 mol/L盐酸者为最大释放组，γ计数仪测定各孔上清液放射性强度(cpm)。自然释放率和杀伤活性的计算公式如下：
结果
一、SKOV3及其基因修饰细胞HLA分子的表达
, 百拇医药
SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2 3类细胞HLA-ABC、HLA-DR和HLA-DQ分子的表达率见表1。与SKOV3和SKOV3/Neo比较，SKOV3/IL-2细胞HLA-ABC和HLA-DQ分子的表达率均有提高，差异有非常显著性(P<0.001)。
二、SKOV3及其基因修饰细胞对NK细胞杀伤的敏感性
3种靶细胞对NK细胞的杀伤作用均不敏感，差异无显著性(P>0.05)，见表2。
表1 SKOV3及其基因修饰细胞HLA分子的表达率(%)
类别
HLA-ABC
HLA-DR
HLA-DQ
, 百拇医药
SKOV3
1.5
4.7
2.4
SKOV3/Neo
4.3
2.1
6.9
SKOV3/IL-2
17.7
9.4
19.1
表2 3种靶细胞对不同效靶比NK细胞杀伤的敏感性(%)
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类别
100∶1
50∶1
10∶1
SKOV3
6.5
3.4
0.0
SKOV3/Neo
5.3
4.2
0.0
SKOV3/IL-2
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6.8
4.6
0.0
三、SKOV3及其基因修饰细胞对LAK细胞杀伤的敏感性
LAK对3种靶细胞均有不同程度的杀伤效应，SKOV3/IL-2细胞对LAK杀伤的敏感性最高，3个效靶比的杀伤敏感性均分别为SKOV3、SKOV3/Neo的2倍，差别有非常显著性(P<0.001)，见表3。表3 3种靶细胞对不同效靶比LNK细胞杀伤的敏感性(%)
类别
100∶1
50∶1
10∶1
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SKOV3
39.5
20.1
12.1
SKOV3/Neo
34.4
15.3
12.5
SKOV3/IL-2
75.6
40.0
33.3
四、肿瘤细胞和淋巴细胞混合培养情况
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淋巴细胞与肿瘤细胞共培养36～48 h后，含SKOV3/IL-2细胞的培养孔内，淋巴细胞以肿瘤细胞为中心聚集成簇，可见淋巴细胞围绕于肿瘤细胞周围，呈花瓣状；含SKOV3、SKOV3/Neo细胞的培养孔内淋巴细胞均匀分布于培养皿底部，呈沙粒状，未见淋巴细胞将肿瘤细胞包绕的现象。
讨论
细胞免疫原性的高低，在一定程度上取决于细胞免疫分子表达的强弱。目前，已知的免疫分子主要有HLA、B7及肿瘤相关抗原(TAA)等[1, 6, 7]。TAA是一种相对分子质量极小的肽，必须与肿瘤细胞或多形核白细胞膜表面的HLA(又称为主要组织相容复合物，MHC)分子结合，才能被T淋巴细胞表面受体(TCR)识别，继而T淋巴细胞被激活、扩增，发挥免疫效应，这种识别受T淋巴细胞膜表面HLA分子的限制。可见免疫分子在肿瘤免疫调控中具有极为重要的意义，肿瘤细胞MHC分子多为低表达甚至不表达，是肿瘤免疫耐受的主要原因之一[4]。
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本研究显示，IL-2基因转导可增强卵巢癌细胞系SKOV3的免疫原性，主要表现在以下两个方面：(1) 在淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养过程中，可见淋巴细胞向SKOV3/IL-2细胞聚集、包绕；裸鼠皮下成瘤实验中，在SKOV3/IL-2组肿瘤包膜周围，可见大量单个核细胞渗出，向肿瘤组织浸润[8]，说明IL-2基因修饰肿瘤细胞与淋巴细胞间有cross-tal(“通讯”)[9]现象存在。(2) IL-2基因修饰细胞对LAK细胞的敏感性较亲本细胞明显增强。IL-2基因转导细胞的免疫原性增强，可能与以下因素有关：(1)IL-2基因转导使肿瘤细胞膜表面MHC分子表达上调、抗原性增强，有利于肿瘤抗原的递呈、识别，激发抗肿瘤免疫，对打破肿瘤免疫耐受具有极其重要的意义；(2) SKOV3/IL-2细胞可分泌IL-2，IL-2是淋巴细胞活化和维持增殖的重要因子[10]，SKOV3/IL-2细胞所分泌的IL-2，改变了肿瘤细胞局部的微环境，利于淋巴细胞的生存，因此，可对淋巴细胞产生一种类似趋化的作用。Fearon等[11]证实，IL-2基因修饰的肿瘤细胞的抗原递呈能力增强，不需辅助性T细胞参予即可激活T淋巴细胞。可见，通过转基因技术，改善肿瘤细胞免疫相关分子的表达，可打破肿瘤免疫耐受状况。
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对卵巢癌以外的其他诸多肿瘤基因转导动物模型的研究证实, IL-2基因转导可提高肿瘤细胞MHC的表达，改善肿瘤细胞局部的免疫微环境，激活CD8+T淋巴细胞，产生针对野生型肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应，可作为肿瘤疫苗，治疗已荷肿瘤，抵御肿瘤再次侵袭[12,13]。IL-2基因转导使人卵巢癌细胞免疫原性增强，提示IL-2基因修饰卵巢癌细胞有望成为肿瘤疫苗，用于卵巢癌的预防与治疗。
作者单位：张震宇(100700 北京军区总医院妇产科)
郎景和(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科)
参考文献
1，Baxevanis CN, Papamihail M. Characterization of the anti-tumor immune response in human cancers and strategies for immunotherapy. Crit Rev Oncol Hematol, 1994, 16:157-179.
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2，Mondino A, Khoruts A, Jenkins MK. The anatomy of T-cell activation and tolerance. Proc Natl Acad Sci USA， 1996， 93: 2245-2252.
3，Browning MJ, Bodmer WF. MHC antigen and cancer: implications for T-cell surveillance. Curr Opinion Immunol, 1992, 4: 613-618.
4，Bruyns C, Gerard C, Velu T. Cancer escape from immune surveillance: how can it be overcome by gene transfer Eur J Cancer, 1994, 30: 1176-1181.
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5，张震宇，郎景和. 白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞SKOV3形态及增殖的影响. 中华妇产科杂志，1998，33: 614-617.
6，Germain RN. MHC-dependent antigen processing and peptide presentation: providing ligands for T lymphocyte activation. Cell, 1994, 76: 287-299.
7，Boussiotis VA, Treeman GJ, Gribben JG, et al. Activated human B lymphocytes express three CTLA-4 counterreceptors that costimulate T-cell activation. Proc Nat Acad Sci USA, 1993, 90:11059-11063,11112.
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8，张震宇，郎景和. 白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3致瘤性的影响. 妇产科新进展，1998, 7:122-126.
9，Colombo MP, Modesti A, Parmiana G. Local cytokine availability elicits tumor rejection and systemic immunity through granulocyte-T-lymphocyte cross-talk. Cancer Res, 1992, 52: 4853-4857.
10，周廷冲, 主编. 多肽生长因子基础与临床. 北京：中国科技出版社，1992. 268-279.
11，Fearon ER, Pardoll DM, Itaya T, et al. Interleukin-2 production by tumor cells bypasses T helper function in the generation of an antitumor response. Cell， 1990, 60: 397-403.
12，Gansbacher BB, Zier K, Daniels B, et al. Interleukin 2 gene transfer into tumor cells abrogates tumorigenicity and induces protective immunity. J Exp Med 1990, 172: 1217-1224.
13，Dalgleish D. The role of IL-2 in gene therapy. Gene Therapy, 1994, 1: 83-87., 百拇医药