血小板源生长因子和转化生长因子-β1及其受体在视网膜表面膜分布的免疫电镜研究
血小板源生长因子和转化生长因子-β1及其受体在视网膜表面膜分布的免疫电镜研究
王方 许迅 张皙 颜永碧
摘 要 目的 观察及评估血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)和转化生长因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)及其相应受体在视网膜表面膜的分布特征及临床意义。方法 对9例孔源性视网膜脱离患者行玻璃体切除术同时获得25块视网膜表面膜，按病程分为早期膜(<2个月)、中期膜(2～6个月)和晚期膜(> 6个月)；采用8种抗体，即PDGF、TGF-β1、PDGF α和β受体、TGF-β Ⅰ和Ⅱ型受体、Ⅰ和Ⅲ型胶原，按研究目的配对后进行胶体金双重标记。结果 PDGF和TGF-β1标记程度在早、晚期膜强，中期膜总体上呈现弱；增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)C2～C3膜标本的2个生长因子阳性标记程度较PVR D1～D3膜标本强；PDGF和TGF-β1与Ⅰ和Ⅲ型胶原的胶体金颗粒常聚在同一部位，且标记程度一致。4个生长因子受体阳性标记的细胞是一类胞浆丰富、带或不带色素颗粒的上皮样细胞，且细胞周围多伴有生长因子的阳性标记。结论 PDGF和TGF-β1以浓度的变化自始至终参与膜的发生、发展；上皮样细胞是一种功能活跃细胞，在膜形成中起主要作用。
, http://www.100md.com
关键词：视网膜脱离；视网膜；受体，生长因子；显微镜检查，免疫电子
增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是视网膜脱离手术失败的主要原因[1]。目前PVR的发病机制尚不完全清楚，认为这一过程受到多因素调控，其中生长因子以浓度变化和因子间的联络影响PVR的发生和发展[2] 。
血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)和转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)是血小板源释放的几种因子中促分裂活动最强的2个因子，且它们之间相互依赖和影响。少量研究发现在视网膜表面膜有PDGF和受体存在[3,4]，在黄斑表面膜也证实TGF-β 3个异构体呈现阳性标记[5]。本研究将采用胶体金双标技术，结合免疫电镜技术观察PDGF和TGF-β1及其受体(receptor, R)的分布，了解它们与膜发展的关系，探讨2个因子及其受体在PVR发生中的作用。
, 百拇医药
材料和方法
1.标本来源：选择本院9例孔源性视网膜脱离伴有PVR患者的25块视网膜表面膜，通过玻璃体切除术获得。按照惯用分期法[6]，分为早期膜(<2个月)5例、中期膜(2～6个月)3例及晚期膜(>6个月)1例。PVR分级[7]，C2～C3 5例，D1～D3 4例。
2.双抗体标记：PDGF(兔抗人IgG，美国Promega公司， 稀释度1∶100)/TGF-β1(兔抗人IgG，美国Santa Cruz公司，稀释度1∶200)；PDGF/PDGFR-α/PDGFR-β(同前，稀释度1∶500)；TGF-β1/TGFR Ⅰ/TGFR Ⅱ(同前，稀释度1∶200)；PDGF/Ⅰ、Ⅲ型胶原(兔抗牛、兔抗人IgG，稀释度1∶50，上海医科大学病理解剖室)；TGF-β1/Ⅰ、Ⅲ型胶原。
, 百拇医药
3.免疫电镜标本制作：标本在新鲜配制的2%多聚甲醛和0.5%戊二醛(0.2 mol PBS配制，pH 7.3)固定液中室温下固定30 min，PBS漂洗数次后，一抗体滴于干净玻片上，使标本飘浮在其内，微波处理5 s，室温放置15 min，再微波处理5 s后，放置1 h。微波温度控制在35℃以下，并保持一定湿度。1∶3稀释的胶体金(GAP 10 nm)微波下作用标本5 s，35℃振荡孵育1 h。标本应用IgG(羊抗兔)封闭，微波处理5 s，保持湿度，室温下放置1 h。第2种抗体再滴入标本，微波处理5 s，湿盒内室温放置1 h，然后应用相同稀释度的胶体金(GAP 5 nm)再标记，微波处理5 s，35℃振荡孵育1 h。将1滴22%白蛋白滴在清洁玻片上，用解剖针轻轻将视网膜前膜捞入白蛋白，并使其自然铺展，再滴3%戊二醛2或3滴于白蛋白上，微波固定10 s，室温下放置2 min，使白蛋白和戊二醛凝固成块状，用双面刀片从底部刮下，去除无组织部分。每一步骤之间均进行充分漂洗。最后用1%锇酸后固定2 h，逐级酒精脱水，多角孔的平板竖立包埋标本，切厚片进行定位，作500～700 ?超薄切片，铀铅双染，H-800电镜观察。
, 百拇医药
4.阴性对照和结果判定：阴性对照以PBS代替研究抗体，其他处理过程相同。胶体金标记程度按以下4个级别判断：无标记“-”，弱标记“+”，中度标记“++”，强标记“+++”。
5. 统计学方法：采用χ2检验。
结果
9例患者19个膜标本进行PDGF、PDGFR α和β、TGF-β1、TGFR Ⅰ和Ⅱ双重标记，6个膜标本进行PDGF、TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原双重标记。
1.生长因子标记程度与PVR病程的关系： 5例早期膜10个标本中，TGF-β1和PDGF的标记均在“++～+++”(图1)；3例中期膜5个标本中，1个“-”，3个“+”，1个“++”(图2)；晚期膜4个标本均“+++”(图3)。对应的受体表达程度呈现相似情况。进一步发现，早期膜PDGFR α和β在胞浆丰富的无色素上皮样细胞中表达明显；中期膜α受体在色素细胞上表达较β受体多(图4)。早期膜中TGF-β R Ⅰ、Ⅱ主要在无色素上皮样细胞，表达程度R Ⅱ>RⅠ，中期膜含色素细胞的RⅠ表达明显(图4)。
, http://www.100md.com
2.生长因子标记程度与膜分级的关系：在6例患者17个膜标本中发现，3例PVR分级在C2～C3患者，除1个膜TGF-β1标记为“++”外， 其他膜PDGF和TGF-β1的标记水平为“+++”(图5) ；而3例D1～D3的患者除1块膜PDGF和TGF-β1呈“++”外，其他膜显示“+”标记(图6)，其中1个PDGF为“-”(D2)，显示出生长因子标记程度与膜分级成反比；进一步对TGF-β1标记与膜形成分级关系的统计学检验发现，P<0.05 (χ2 =7.71)。
3.生长因子与Ⅰ、Ⅲ型胶原分布上的特征： 在3例患者的6个标本进行生长因子与Ⅰ、Ⅲ型胶原双标观察中，发现两个趋向，即标记Ⅰ、Ⅲ型胶原和生长因子的胶体金颗粒倾向聚在同一部位，而且标记的程度基本相同(图5)。
, http://www.100md.com
4.生长因子及其受体的表达部位：PDGF和TGF-β1表达既可在细胞周围(图1，3，6)，又可见于胶原间质中(图5)；阳性标记的细胞具有相同的特征，即胞浆异常丰富，色素颗粒或有或无，在细胞边缘有微绒毛(图3)和足突结构(图4)；在这类细胞胞膜上，生长因子受体抗体常呈阳性标记(图4)。
讨论
10多年前，Campochiaro和Glaser[8] 发现PDGF是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞和视网膜胶质细胞的趋化因子，并促进两种细胞的增生，加强RPE细胞与胶原的收缩。有报道，PVR眼的玻璃体中TGF-β含量明显增高； 应用PDGF或TGF-β结合纤维连接蛋白 (fibronectin, FN)在动物眼成功诱发PVR模型[9]。
近年，Robbins等[3]和Vinores等[4]分别对PVR患者的膜标本进行光镜下PDGF-A和PDGF-B及其受体免疫定位研究。Clausen等[5]以同样的研究手段对黄斑表面膜TGF-β1～3的分布进行研究。由于光镜检查所限，他们未能对阳性标记细胞和细胞外间质(extracellular matrix，ECM)做深入的超微结构研究。本研究将免疫组化与电镜结合，弥补了光镜的不足之处，使其能够在亚细胞水平上认识2个生长因子及受体对PVR膜的作用。
, 百拇医药
在PVR中，PVR细胞(如RPE细胞)对其所处的环境表现一种特殊敏感性，即细胞表面受体上调，细胞呈现高应答状态，Campochiaro[2]认为该现象在葡萄膜炎不会出现，可能是PVR发生的关键之一。为了从超微结构上了解这一现象，我们也对2个生长因子的相应受体进行了观察。
当我们用线图显示PDGF和TGF-β1标记程度与PVR病程的关系时，呈现一“V”字形图形，即在中期膜标本表现低标记量，晚期膜2个因子阳性标记又很明显，尤其是TGF-β1，呈大范围标记。为何在中期膜出现低峰？曾有研究显示[10]，PDGF和TGF-β的量效关系始终存在于伤口愈合过程中，PDGF的诸多影响伤口愈合的功能是在低浓度下发挥的。进一步，TGF-β增强RPE细胞的活动也是在低浓度下完成的。实际上，TGF-β、PDGF的生物作用更多的是依赖于细胞膜上受体的上调[11]。我们推测，在不同时期PVR膜2个生长因子及其受体表达程度的变化可能与PVR的病理发展过程有关，中期膜的低表达，也许正是细胞介导胶原活动所需要的环境。该推测也能解释膜分级与生长因子标记程度的关系。
, http://www.100md.com
许多体外研究[2,12]证明，2个因子加强RPE细胞、成纤维样细胞及Müller细胞与胶原的收缩。虽然本研究方法不可能直接证实这些功能，但在膜组织抗体标记中，PDGF和TGF-β1倾向伴随Ⅰ和Ⅲ型胶原表达的现象可能暗示这种调控功能的存在。
PDGF、TGF-β1和其受体倾向在同一类细胞表达现象，使我们推测这些细胞是一种生物功能活跃的细胞，且很可能既是PDGF和TGF-β1作用的靶细胞，又是二者的自分泌细胞。这种循环作用或称网络调控方式，Bryan和Campochiaro[13]认为是血-视网膜屏障破坏后细胞继续增生的原因。Guidry[12]认为在伤口愈合过程中，血源性生长因子的作用时间很短，以后生长因子对愈合的影响是靠愈合组织中细胞自身产生、作用。本研究结果未见抗体标记与细胞是否含有色素颗粒的关系。Robbins等[3]特别指出，PDGF受体β在含色素颗粒细胞明显。然而，我们注意到受体的阳性标记细胞随着PVR病程稍有变化。此外，TGF-β受体Ⅰ和Ⅱ的表达明显存在时间差，即早期膜的R Ⅱ表达比R Ⅰ明显，中期膜2个受体表达基本一致。这种反映在时间上的差别，是否反映了TGF-β1与R Ⅱ和R Ⅰ的“连锁”式结合方式[14]?
, http://www.100md.com
本研究应用超微组织学和免疫组织化学方法对PDGF和TGF-β1及其受体的标记细胞作进一步观察，证实PDGF和TGF-β1以浓度上的变化始终参与PVR的发生及发展，但其表达水平与临床现象的确切关系尚待进一步研究证实。
图1 视网膜表面早期膜 TGF-β1(10mm胶体金颗粒)和PEDF(5nm胶体金颗粒)的强标记(++-+++ )，金颗粒一般出现在细胞附近，且这些细胞有丰富的细胞器(箭头)。N示细胞核，F示细胞外间质(下同)×22500
, 百拇医药
图2 视网膜表面中期膜 TGF-β1(10nm)和PDGF(5nm)标记特征，在细胞附近金颗粒稀少。P示色素颗粒(下同)×30000
图3 视网膜表面晚期膜 TGF-β1(10nm)和PDGF(5nm)的强标记，可见微绒毛结构(箭头)×3000
图4 PVR形成晚期标本，一带有色素颗粒细胞，在细胞膜显示PDGFα(10nm) 和TGF-β1(5nm)阳性标记，细胞器丰富(黑箭头)，有足突(白箭头)。M示细胞膜(下同)×30000
, 百拇医药
图5 PDGF(10nm)III型胶(5nm)在PVR膜分级C2-C3的膜标本标记，显示在细胞周围间质有大量的金颗粒标记，表现生长因子与胶原伴随标记特征×30000
图6 PDGF(10nm)/TGF-β1(5nm)在PVR-D1-D2膜标本的抗体标记，显示细胞膜外间质阳性表达的金颗粒较少 ×45000
作者单位：王方(200080 上海市第一人民医院眼科)
许迅(200080 上海市第一人民医院眼科)
, 百拇医药 张皙(200080 上海市第一人民医院眼科)
颜永碧(第二军医大学生物物理所)
参考文献
1，Charteris DG. Proliferative vitreoretinopathy: pathobiology, surgical management, and adjunctive treatment. Br J Ophthalmol,1995,79:953-960.
2，Campochiaro PA. Pathogenic mechanisms in proliferative vitreoretinopathy. Arch Ophthalmol,1997，115:237-241.
3，Robbins SG, Mixon RN, Wilson DJ, et al. Platelet-derived growth factor ligands and receptors immunolocalized in proliferative retinal diseases. Invest Ophthalmol Vis Sci，1994,35:3649-3663.
, http://www.100md.com
4，Vinores SA, Henderer JD, Mahlow J, et al. Isoforms of platelet-derived growth factor and its receptors in epiretinal membranes: immunolocalization to retinal pigmented epithelial cells. Exp Eye Res,1995,60: 607-619.
5，Clausen M,El-Hifnawi E, Hoerauf H, et al. VEGF, bFGF and TGF β1-3 in macular pucker membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci,1997,38 ARVO Supp1: S787.
6，Casaroli Marano RP, Vilaro S. The role of fibronectin, laminin, vitronectin and their receptors on cellular adhesion in proliferative vitreoretinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci，1994, 35:2791-2803.
, 百拇医药
7，The Retina Society Terminology Committee. The classification of retinal detachment with proliferative vitreoretinopathy. Ophthalmology,1983,90：121-125.
8，Campochiaro PA, Glaser BM. Platelet-derived growth factor is chemotactic for human retinal pigment epithelial cells. Arch Ophthalmol,1985，103:576-579.
9，Connor TB Jr, Roberts AB, Sporn MB, et al. Correlation of fibrosis and transforming growth factor-β type 2 levels in the eye. J Clin Invest，1989,83：1661-1666.
, 百拇医药
10，Raymond MC, Thompson JT. RPE-mediated collagen gel contraction inhibition by colchicine and stimulation by TGF-beta. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990，31：1079-1086.
11，Barrett TB, Seifert RA, Bowen-Pope DF. Regulation of platelet-derived growth factor receptor expression by cell context overrides regulation by cytokines. J Cell Physiol,1996，169：126-138.
12，Guidry C. Extracellular matrix contraction by fibroblasts: peptide promoters and second messengers. Cancer Metastasis Rev，1992，11：45-54.
13，Bryan JA 3d, Campochiaro PA. A retinal pigment epithelial cell-derived growth factor(s). Arch Ophthalmol,1986，104：422-425.
14，Joyce NC, Zieske JD. Transforming growth factor-beta receptor expression in human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci,1997，38：1922-1928., 百拇医药(血小板源生长因子和转化生长因子-β1及其受体在视网膜表面膜分布的免疫电镜研究)
王方 许迅 张皙 颜永碧
摘 要 目的 观察及评估血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)和转化生长因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)及其相应受体在视网膜表面膜的分布特征及临床意义。方法 对9例孔源性视网膜脱离患者行玻璃体切除术同时获得25块视网膜表面膜，按病程分为早期膜(<2个月)、中期膜(2～6个月)和晚期膜(> 6个月)；采用8种抗体，即PDGF、TGF-β1、PDGF α和β受体、TGF-β Ⅰ和Ⅱ型受体、Ⅰ和Ⅲ型胶原，按研究目的配对后进行胶体金双重标记。结果 PDGF和TGF-β1标记程度在早、晚期膜强，中期膜总体上呈现弱；增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)C2～C3膜标本的2个生长因子阳性标记程度较PVR D1～D3膜标本强；PDGF和TGF-β1与Ⅰ和Ⅲ型胶原的胶体金颗粒常聚在同一部位，且标记程度一致。4个生长因子受体阳性标记的细胞是一类胞浆丰富、带或不带色素颗粒的上皮样细胞，且细胞周围多伴有生长因子的阳性标记。结论 PDGF和TGF-β1以浓度的变化自始至终参与膜的发生、发展；上皮样细胞是一种功能活跃细胞，在膜形成中起主要作用。
, http://www.100md.com
关键词：视网膜脱离；视网膜；受体，生长因子；显微镜检查，免疫电子
增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是视网膜脱离手术失败的主要原因[1]。目前PVR的发病机制尚不完全清楚，认为这一过程受到多因素调控，其中生长因子以浓度变化和因子间的联络影响PVR的发生和发展[2] 。
血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)和转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)是血小板源释放的几种因子中促分裂活动最强的2个因子，且它们之间相互依赖和影响。少量研究发现在视网膜表面膜有PDGF和受体存在[3,4]，在黄斑表面膜也证实TGF-β 3个异构体呈现阳性标记[5]。本研究将采用胶体金双标技术，结合免疫电镜技术观察PDGF和TGF-β1及其受体(receptor, R)的分布，了解它们与膜发展的关系，探讨2个因子及其受体在PVR发生中的作用。
, 百拇医药
材料和方法
1.标本来源：选择本院9例孔源性视网膜脱离伴有PVR患者的25块视网膜表面膜，通过玻璃体切除术获得。按照惯用分期法[6]，分为早期膜(<2个月)5例、中期膜(2～6个月)3例及晚期膜(>6个月)1例。PVR分级[7]，C2～C3 5例，D1～D3 4例。
2.双抗体标记：PDGF(兔抗人IgG，美国Promega公司， 稀释度1∶100)/TGF-β1(兔抗人IgG，美国Santa Cruz公司，稀释度1∶200)；PDGF/PDGFR-α/PDGFR-β(同前，稀释度1∶500)；TGF-β1/TGFR Ⅰ/TGFR Ⅱ(同前，稀释度1∶200)；PDGF/Ⅰ、Ⅲ型胶原(兔抗牛、兔抗人IgG，稀释度1∶50，上海医科大学病理解剖室)；TGF-β1/Ⅰ、Ⅲ型胶原。
, 百拇医药
3.免疫电镜标本制作：标本在新鲜配制的2%多聚甲醛和0.5%戊二醛(0.2 mol PBS配制，pH 7.3)固定液中室温下固定30 min，PBS漂洗数次后，一抗体滴于干净玻片上，使标本飘浮在其内，微波处理5 s，室温放置15 min，再微波处理5 s后，放置1 h。微波温度控制在35℃以下，并保持一定湿度。1∶3稀释的胶体金(GAP 10 nm)微波下作用标本5 s，35℃振荡孵育1 h。标本应用IgG(羊抗兔)封闭，微波处理5 s，保持湿度，室温下放置1 h。第2种抗体再滴入标本，微波处理5 s，湿盒内室温放置1 h，然后应用相同稀释度的胶体金(GAP 5 nm)再标记，微波处理5 s，35℃振荡孵育1 h。将1滴22%白蛋白滴在清洁玻片上，用解剖针轻轻将视网膜前膜捞入白蛋白，并使其自然铺展，再滴3%戊二醛2或3滴于白蛋白上，微波固定10 s，室温下放置2 min，使白蛋白和戊二醛凝固成块状，用双面刀片从底部刮下，去除无组织部分。每一步骤之间均进行充分漂洗。最后用1%锇酸后固定2 h，逐级酒精脱水，多角孔的平板竖立包埋标本，切厚片进行定位，作500～700 ?超薄切片，铀铅双染，H-800电镜观察。
, 百拇医药
4.阴性对照和结果判定：阴性对照以PBS代替研究抗体，其他处理过程相同。胶体金标记程度按以下4个级别判断：无标记“-”，弱标记“+”，中度标记“++”，强标记“+++”。
5. 统计学方法：采用χ2检验。
结果
9例患者19个膜标本进行PDGF、PDGFR α和β、TGF-β1、TGFR Ⅰ和Ⅱ双重标记，6个膜标本进行PDGF、TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原双重标记。
1.生长因子标记程度与PVR病程的关系： 5例早期膜10个标本中，TGF-β1和PDGF的标记均在“++～+++”(图1)；3例中期膜5个标本中，1个“-”，3个“+”，1个“++”(图2)；晚期膜4个标本均“+++”(图3)。对应的受体表达程度呈现相似情况。进一步发现，早期膜PDGFR α和β在胞浆丰富的无色素上皮样细胞中表达明显；中期膜α受体在色素细胞上表达较β受体多(图4)。早期膜中TGF-β R Ⅰ、Ⅱ主要在无色素上皮样细胞，表达程度R Ⅱ>RⅠ，中期膜含色素细胞的RⅠ表达明显(图4)。
, http://www.100md.com
2.生长因子标记程度与膜分级的关系：在6例患者17个膜标本中发现，3例PVR分级在C2～C3患者，除1个膜TGF-β1标记为“++”外， 其他膜PDGF和TGF-β1的标记水平为“+++”(图5) ；而3例D1～D3的患者除1块膜PDGF和TGF-β1呈“++”外，其他膜显示“+”标记(图6)，其中1个PDGF为“-”(D2)，显示出生长因子标记程度与膜分级成反比；进一步对TGF-β1标记与膜形成分级关系的统计学检验发现，P<0.05 (χ2 =7.71)。
3.生长因子与Ⅰ、Ⅲ型胶原分布上的特征： 在3例患者的6个标本进行生长因子与Ⅰ、Ⅲ型胶原双标观察中，发现两个趋向，即标记Ⅰ、Ⅲ型胶原和生长因子的胶体金颗粒倾向聚在同一部位，而且标记的程度基本相同(图5)。
, http://www.100md.com
4.生长因子及其受体的表达部位：PDGF和TGF-β1表达既可在细胞周围(图1，3，6)，又可见于胶原间质中(图5)；阳性标记的细胞具有相同的特征，即胞浆异常丰富，色素颗粒或有或无，在细胞边缘有微绒毛(图3)和足突结构(图4)；在这类细胞胞膜上，生长因子受体抗体常呈阳性标记(图4)。
讨论
10多年前，Campochiaro和Glaser[8] 发现PDGF是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞和视网膜胶质细胞的趋化因子，并促进两种细胞的增生，加强RPE细胞与胶原的收缩。有报道，PVR眼的玻璃体中TGF-β含量明显增高； 应用PDGF或TGF-β结合纤维连接蛋白 (fibronectin, FN)在动物眼成功诱发PVR模型[9]。
近年，Robbins等[3]和Vinores等[4]分别对PVR患者的膜标本进行光镜下PDGF-A和PDGF-B及其受体免疫定位研究。Clausen等[5]以同样的研究手段对黄斑表面膜TGF-β1～3的分布进行研究。由于光镜检查所限，他们未能对阳性标记细胞和细胞外间质(extracellular matrix，ECM)做深入的超微结构研究。本研究将免疫组化与电镜结合，弥补了光镜的不足之处，使其能够在亚细胞水平上认识2个生长因子及受体对PVR膜的作用。
, 百拇医药
在PVR中，PVR细胞(如RPE细胞)对其所处的环境表现一种特殊敏感性，即细胞表面受体上调，细胞呈现高应答状态，Campochiaro[2]认为该现象在葡萄膜炎不会出现，可能是PVR发生的关键之一。为了从超微结构上了解这一现象，我们也对2个生长因子的相应受体进行了观察。
当我们用线图显示PDGF和TGF-β1标记程度与PVR病程的关系时，呈现一“V”字形图形，即在中期膜标本表现低标记量，晚期膜2个因子阳性标记又很明显，尤其是TGF-β1，呈大范围标记。为何在中期膜出现低峰？曾有研究显示[10]，PDGF和TGF-β的量效关系始终存在于伤口愈合过程中，PDGF的诸多影响伤口愈合的功能是在低浓度下发挥的。进一步，TGF-β增强RPE细胞的活动也是在低浓度下完成的。实际上，TGF-β、PDGF的生物作用更多的是依赖于细胞膜上受体的上调[11]。我们推测，在不同时期PVR膜2个生长因子及其受体表达程度的变化可能与PVR的病理发展过程有关，中期膜的低表达，也许正是细胞介导胶原活动所需要的环境。该推测也能解释膜分级与生长因子标记程度的关系。
, http://www.100md.com
许多体外研究[2,12]证明，2个因子加强RPE细胞、成纤维样细胞及Müller细胞与胶原的收缩。虽然本研究方法不可能直接证实这些功能，但在膜组织抗体标记中，PDGF和TGF-β1倾向伴随Ⅰ和Ⅲ型胶原表达的现象可能暗示这种调控功能的存在。
PDGF、TGF-β1和其受体倾向在同一类细胞表达现象，使我们推测这些细胞是一种生物功能活跃的细胞，且很可能既是PDGF和TGF-β1作用的靶细胞，又是二者的自分泌细胞。这种循环作用或称网络调控方式，Bryan和Campochiaro[13]认为是血-视网膜屏障破坏后细胞继续增生的原因。Guidry[12]认为在伤口愈合过程中，血源性生长因子的作用时间很短，以后生长因子对愈合的影响是靠愈合组织中细胞自身产生、作用。本研究结果未见抗体标记与细胞是否含有色素颗粒的关系。Robbins等[3]特别指出，PDGF受体β在含色素颗粒细胞明显。然而，我们注意到受体的阳性标记细胞随着PVR病程稍有变化。此外，TGF-β受体Ⅰ和Ⅱ的表达明显存在时间差，即早期膜的R Ⅱ表达比R Ⅰ明显，中期膜2个受体表达基本一致。这种反映在时间上的差别，是否反映了TGF-β1与R Ⅱ和R Ⅰ的“连锁”式结合方式[14]?
, http://www.100md.com
本研究应用超微组织学和免疫组织化学方法对PDGF和TGF-β1及其受体的标记细胞作进一步观察，证实PDGF和TGF-β1以浓度上的变化始终参与PVR的发生及发展，但其表达水平与临床现象的确切关系尚待进一步研究证实。
图1 视网膜表面早期膜 TGF-β1(10mm胶体金颗粒)和PEDF(5nm胶体金颗粒)的强标记(++-+++ )，金颗粒一般出现在细胞附近，且这些细胞有丰富的细胞器(箭头)。N示细胞核，F示细胞外间质(下同)×22500
, 百拇医药
图2 视网膜表面中期膜 TGF-β1(10nm)和PDGF(5nm)标记特征，在细胞附近金颗粒稀少。P示色素颗粒(下同)×30000
图3 视网膜表面晚期膜 TGF-β1(10nm)和PDGF(5nm)的强标记，可见微绒毛结构(箭头)×3000
图4 PVR形成晚期标本，一带有色素颗粒细胞，在细胞膜显示PDGFα(10nm) 和TGF-β1(5nm)阳性标记，细胞器丰富(黑箭头)，有足突(白箭头)。M示细胞膜(下同)×30000
, 百拇医药
图5 PDGF(10nm)III型胶(5nm)在PVR膜分级C2-C3的膜标本标记，显示在细胞周围间质有大量的金颗粒标记，表现生长因子与胶原伴随标记特征×30000
图6 PDGF(10nm)/TGF-β1(5nm)在PVR-D1-D2膜标本的抗体标记，显示细胞膜外间质阳性表达的金颗粒较少 ×45000
作者单位：王方(200080 上海市第一人民医院眼科)
许迅(200080 上海市第一人民医院眼科)
, 百拇医药 张皙(200080 上海市第一人民医院眼科)
颜永碧(第二军医大学生物物理所)
参考文献
1，Charteris DG. Proliferative vitreoretinopathy: pathobiology, surgical management, and adjunctive treatment. Br J Ophthalmol,1995,79:953-960.
2，Campochiaro PA. Pathogenic mechanisms in proliferative vitreoretinopathy. Arch Ophthalmol,1997，115:237-241.
3，Robbins SG, Mixon RN, Wilson DJ, et al. Platelet-derived growth factor ligands and receptors immunolocalized in proliferative retinal diseases. Invest Ophthalmol Vis Sci，1994,35:3649-3663.
, http://www.100md.com
4，Vinores SA, Henderer JD, Mahlow J, et al. Isoforms of platelet-derived growth factor and its receptors in epiretinal membranes: immunolocalization to retinal pigmented epithelial cells. Exp Eye Res,1995,60: 607-619.
5，Clausen M,El-Hifnawi E, Hoerauf H, et al. VEGF, bFGF and TGF β1-3 in macular pucker membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci,1997,38 ARVO Supp1: S787.
6，Casaroli Marano RP, Vilaro S. The role of fibronectin, laminin, vitronectin and their receptors on cellular adhesion in proliferative vitreoretinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci，1994, 35:2791-2803.
, 百拇医药
7，The Retina Society Terminology Committee. The classification of retinal detachment with proliferative vitreoretinopathy. Ophthalmology,1983,90：121-125.
8，Campochiaro PA, Glaser BM. Platelet-derived growth factor is chemotactic for human retinal pigment epithelial cells. Arch Ophthalmol,1985，103:576-579.
9，Connor TB Jr, Roberts AB, Sporn MB, et al. Correlation of fibrosis and transforming growth factor-β type 2 levels in the eye. J Clin Invest，1989,83：1661-1666.
, 百拇医药
10，Raymond MC, Thompson JT. RPE-mediated collagen gel contraction inhibition by colchicine and stimulation by TGF-beta. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990，31：1079-1086.
11，Barrett TB, Seifert RA, Bowen-Pope DF. Regulation of platelet-derived growth factor receptor expression by cell context overrides regulation by cytokines. J Cell Physiol,1996，169：126-138.
12，Guidry C. Extracellular matrix contraction by fibroblasts: peptide promoters and second messengers. Cancer Metastasis Rev，1992，11：45-54.
13，Bryan JA 3d, Campochiaro PA. A retinal pigment epithelial cell-derived growth factor(s). Arch Ophthalmol,1986，104：422-425.
14，Joyce NC, Zieske JD. Transforming growth factor-beta receptor expression in human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci,1997，38：1922-1928., 百拇医药(血小板源生长因子和转化生长因子-β1及其受体在视网膜表面膜分布的免疫电镜研究)