体外无血清小鼠胚胎种植模型的建立
体外无血清小鼠胚胎种植模型的建立
刘建新 罗丽兰 阎洁 艾继辉
摘 要 目的 观察小鼠胚胎的体外发育及种植过程。方法 采用全组蜕膜细胞培养方式进行体外培养，然后移入孕4 d的小鼠胚胎，建立无血清联合培养体系，对胚胎和蜕膜细胞的生长情况进行显微观察。结果 小鼠胚胎在体外无血清培养体系中能够顺利孵化、粘附、种植及外延生长，并形成外胎盘锥和羊膜囊；蜕膜细胞的形态在4 d与小鼠胚胎的共同培养时限内保持完好。结论 蜕膜细胞是理想的共同培养的饲养细胞，本实验方法具有简单、实用和可靠的特点。
关键词：蜕膜；胎儿发育；胚泡移植；培养基，无血清
蜕膜细胞以其营养胚泡、调节内分泌、调控滋养细胞的侵入、防止胚胎被母体排斥等功能，成为一种被广泛采用的饲养细胞(feeder cell)。小鼠因有规律的性周期，其胚胎的种植过程与人类非常相似而成为人们普遍采用的研究对象和胚胎来源。本研究在以往研究[1,2]的基础上，建立无血清小鼠胚胎体外种植模型，以进一步探讨胚胎发育及种植的机理。
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材料与方法
一、 材料
无血清培养基，包括下列试剂：DMEM/Ham′s F-12(美国Gibco公司产品)，含0.3%牛血清白蛋白(美国Sigma公司产品)、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml(pH 7.2,渗透压282 mOsmol/kg)。人绝经期促性腺激素(hMG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)为丽珠制药有限公司产品。胶原酶和透明质酸酶为美国Sigma公司产品。胰蛋白酶由上海第二生化制品公司提供。培养容器为12孔培养板(丹麦Nunc公司产品)和25 cm2一次性培养瓶(丹麦Corning公司产品)。
二、方法
1.小鼠胚胎的采集：选用由同济医科大学实验动物中心提供的4周龄昆明小鼠150只，每只腹腔内注射hMG 7.5 IU，48 h后腹腔内注射hCG 10 U，于当日下午4时与同种雄鼠按1∶1比例合笼过夜，次日晨检查发现有阴道交配栓者即判定为妊娠第1天(D1)。hCG注射后4 d，脱颈椎法处死小鼠，取出双角子宫，用30 G针头连接1 ml注射器(含培养液)冲洗双侧子宫角，于解剖显微镜下以巴氏管采集形态正常的桑椹胚(morula)和囊胚(blastcyst)用于培养。
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2.人类蜕膜细胞的获取和培养：对早孕人工流产健康妇女，于术中用无菌瓶收集蜕膜标本，置于盛有100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的-4℃的无钙平衡盐液(D-hanks)中，即刻送至实验室进行消化和培养。本实验对冷颖等[1]及 Yoshimura等[2]报道的方法进行了简化和修改。复合消化酶由0.25%胰蛋白酶、0.2% 透明质酸酶和0.2% 胶原酶，按2∶1∶2的比例(V/V)混合而成，消化时间30～40 min，消化期间无须震荡。消化后细胞直接进行培养，过夜换液清除污染的红细胞和未贴壁成分。
3.体外无血清胚胎种植模型的建立：取传代蜕膜细胞以1×105个/ml接种到12孔培养板上，一般24 h左右蜕膜细胞即可铺满培养孔的70%～80%，此时换无血清培养基，4～6 h后即可加入孕4 d小鼠胚胎进行共同培养，每孔加入胚胎10～20个。在37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养4 d。自培养开始，每12 h在显微镜下观察胚胎的发育、孵化、粘附、种植及外延生长的过程,并记录摄影。
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结果
传代蜕膜细胞与小鼠胚胎共同培养4 d后，蜕膜细胞形态保持完好，无脱落。
胚胎经培养12 h，大部分形态正常的胚胎已发育至囊胚期，并孵化出透明带。部分发育较迟胚胎的透明带正在脱落，孕卵透明带出现缺口，滋养细胞及部分囊腔呈疝气状由透明带缺口突出，已脱落的透明带呈空壳状。孵化胚胎较孵化前略有增大，外周滋养细胞呈单层排列，清晰可数；内细胞团(inner cell)增大，清晰可辨。此时稍稍倾斜平皿，镜下可见囊胚沿平皿底部蜕膜细胞表面滚动，说明胚胎尚未粘附；培养24 h，囊胚较前明显增大，以其背向内细胞团的一极与蜕膜细胞接触，此时倾斜平皿或用极细孔径的巴氏管轻轻吹向囊胚，不能使囊胚移动位置，但可使囊胚以粘附一极为支点轻轻左右摇动，说明囊胚此时已发生粘附，即囊胚滋养细胞与蜕膜细胞和细胞外基质之间，已建立了细胞表面的连接。培养36 h发现，囊胚与蜕膜细胞的接触面积明显增大，大量的滋养细胞在此处增生成复层，囊胚腔仍清晰可见，见图1。
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培养48 h后，胚胎与蜕膜细胞的接触面进一步增大，胚胎整体呈匍匐状与蜕膜细胞全面接触，其体积进一步增大。此时因卵柱形成，囊胚腔已难以看清，见图2。 培养72 h后，胚胎滋养细胞从外胎盘锥(extraplacental cone,EC)部分外延生长，多个滋养细胞结节突起使此时的胚胎失去其原有的球形而变为不规则。因滋养细胞长入蜕膜细胞与平皿间隙，而使胚胎周围蜕膜细胞略微高起，呈被推挤状，此为滋养细胞浸入的结果。部分胚胎停止发育，外观色泽变暗。培养96 h后，一些生命力较旺盛的胚胎继续发育成为明显的3个部分：(1)底部：相当于与蜕膜细胞密切接触的外胎盘锥部分;(2)中间部分:呈索状漂浮于培养液中，相当于鼠胚的胚外外胚层;(3)索状物的顶端成囊状结构，相当于外胚层，囊状结构为羊膜囊腔。至此，无血清小鼠胚体外种植模型建立成功。以上胚胎体外发育过程与文献报道基本相同[3]。
讨论
一、建立胚胎种植模型的意义
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胚胎种植是生命过程中至关重要的一步，胚胎种植模型是研究种植机理必不可少的手段。国外学者利用胚胎和母体成分建立了许多胚胎种植模型[4，5]，对胚胎体外发育、子宫内膜接受性、胚胎与子宫内膜间复杂的信息沟通、滋养上皮与腔上皮之间相互识别的胚胎学、细胞学以及分子生物学机理进行了深入的探讨。本研究根据早期胚胎对蜕膜组织无种属要求的特性，采用人类蜕膜细胞与4 d小鼠胚胎共同培养，成功的建立了无血清胚胎体外种植模型，对胚胎体外发育、孵化、粘附、种植、滋养细胞外延生长进行了详细的观察。胚胎最终发育形成外胎盘锥和羊膜囊，说明本研究报道的培养体系具有良好的促进胚胎发育的特点。
二、本研究的方法学特点
本研究对原有的蜕膜间质细胞(DSC)的提纯方式进行了部分简化和改进；具体为利用复合消化酶具有消化彻底、时间短、不需震荡的特点，采集细胞数目多，活细胞率高；采用全组细胞培养方式省略了复杂的DSC梯度离心过程；原代细胞过夜换液去除红细胞和未贴壁成分；通过简单的传代，利用DSC生长速度较其他细胞快的特点，使DSC取得数量优势[6]，纯度提高。经泌乳素免疫组织化学证实，传代3代的蜕膜细胞中，DSC纯度达95%。由于其他细胞成分的存在，使培养细胞的细胞因子合成模式更接近生理状态，这对胚胎的发育和着床可能有积极影响。
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三、种植模型的局限性及改进方向
目前，由于细胞培养的条件还难以达到与体内相同的理想状态，胚胎的体外发育与体内发育相比存在明显的不同，早期孕卵和桑椹胚受影响较小，培养时间越长，胎龄越大则影响越大。本研究发现，羊膜囊出现的时间较体内发育延迟，并且形态也明显不同。为了尽量使体外培养条件与体内相似，人们用子宫内膜细胞接种到Metrigel胶(子宫胶)上，使子宫内膜上皮细胞贴壁生长，而DSC则长入Metrigel胶内，制成人工子宫内膜。已有研究表明，滋养细胞能够长入Metrigel胶内，呈现胎盘绒毛状结构[7]。这可能是今后研究胚胎种植模型的方向。
总之，本研究建立的体外无血清胚胎种植模型，具有简单、实用和可靠的特点，为进一步研究胚胎种植机理及细胞因子或激素等对该过程的作用，打下了一定基础。
图1 培养36h小鼠胚胎。胚胎与蜕膜细胞接触面积增加×160 图2培养48h小鼠胚胎，胚胎与蜕膜组织密切接触，滋养细胞外延生长，腔模糊×400
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作者单位：刘建新(现在青岛市立医院妇产科)
罗丽兰(430030 武汉， 同济医科大学附属同济医院妇产科)
阎洁(430030 武汉， 同济医科大学附属同济医院妇产科)
艾继辉(430030 武汉， 同济医科大学附属同济医院妇产科)
参考文献
1，冷颖，杨纫姝.钙调素拮抗剂对离体培养人蜕膜细胞形态和活力的影响.生殖与避孕,1997,17:76-81.
2，Yoshimura Y, Shiokawa S, Nagamatsu S, et al. Effects of beta-1 integrins in the process of implantation. Horm Res， 1995,44 (Suppl 2): 36-41.
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3，Shiokawa S, Yoshimura Y, Nagamatasu S, et al. Function of beta-1 integrins on human decidual cells during implantation.Biol Reprod, 1996,54:745-752.
4，Shiotani M, Noda Y, Mori T.Embryo-dependent induction of uterine receptivity assessed by an in vitro model of implantation in mice. Biol Reprod, 1993,49:704-801.
5，Armant DR, Kameda S.Mouse trophoblast cell invasion of extracellular matrix purified from endometrial tissue: a model for peri-implantation development.J Exp Zool,1994,269:146-156.
6，Montes MJ, Tortase CG, Borja C, et al. Constitutive secretion of Il-6 by human decidual stromal cells in culture, regulatory effect of progesterone. Am J Reprod Immunol, 1995,34:188-194.
7，Tominaga T. Studies on the mechanism of embryo implantation. Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi, 1996, 48:591-603., http://www.100md.com
刘建新 罗丽兰 阎洁 艾继辉
摘 要 目的 观察小鼠胚胎的体外发育及种植过程。方法 采用全组蜕膜细胞培养方式进行体外培养，然后移入孕4 d的小鼠胚胎，建立无血清联合培养体系，对胚胎和蜕膜细胞的生长情况进行显微观察。结果 小鼠胚胎在体外无血清培养体系中能够顺利孵化、粘附、种植及外延生长，并形成外胎盘锥和羊膜囊；蜕膜细胞的形态在4 d与小鼠胚胎的共同培养时限内保持完好。结论 蜕膜细胞是理想的共同培养的饲养细胞，本实验方法具有简单、实用和可靠的特点。
关键词：蜕膜；胎儿发育；胚泡移植；培养基，无血清
蜕膜细胞以其营养胚泡、调节内分泌、调控滋养细胞的侵入、防止胚胎被母体排斥等功能，成为一种被广泛采用的饲养细胞(feeder cell)。小鼠因有规律的性周期，其胚胎的种植过程与人类非常相似而成为人们普遍采用的研究对象和胚胎来源。本研究在以往研究[1,2]的基础上，建立无血清小鼠胚胎体外种植模型，以进一步探讨胚胎发育及种植的机理。
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材料与方法
一、 材料
无血清培养基，包括下列试剂：DMEM/Ham′s F-12(美国Gibco公司产品)，含0.3%牛血清白蛋白(美国Sigma公司产品)、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml(pH 7.2,渗透压282 mOsmol/kg)。人绝经期促性腺激素(hMG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)为丽珠制药有限公司产品。胶原酶和透明质酸酶为美国Sigma公司产品。胰蛋白酶由上海第二生化制品公司提供。培养容器为12孔培养板(丹麦Nunc公司产品)和25 cm2一次性培养瓶(丹麦Corning公司产品)。
二、方法
1.小鼠胚胎的采集：选用由同济医科大学实验动物中心提供的4周龄昆明小鼠150只，每只腹腔内注射hMG 7.5 IU，48 h后腹腔内注射hCG 10 U，于当日下午4时与同种雄鼠按1∶1比例合笼过夜，次日晨检查发现有阴道交配栓者即判定为妊娠第1天(D1)。hCG注射后4 d，脱颈椎法处死小鼠，取出双角子宫，用30 G针头连接1 ml注射器(含培养液)冲洗双侧子宫角，于解剖显微镜下以巴氏管采集形态正常的桑椹胚(morula)和囊胚(blastcyst)用于培养。
, 百拇医药
2.人类蜕膜细胞的获取和培养：对早孕人工流产健康妇女，于术中用无菌瓶收集蜕膜标本，置于盛有100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的-4℃的无钙平衡盐液(D-hanks)中，即刻送至实验室进行消化和培养。本实验对冷颖等[1]及 Yoshimura等[2]报道的方法进行了简化和修改。复合消化酶由0.25%胰蛋白酶、0.2% 透明质酸酶和0.2% 胶原酶，按2∶1∶2的比例(V/V)混合而成，消化时间30～40 min，消化期间无须震荡。消化后细胞直接进行培养，过夜换液清除污染的红细胞和未贴壁成分。
3.体外无血清胚胎种植模型的建立：取传代蜕膜细胞以1×105个/ml接种到12孔培养板上，一般24 h左右蜕膜细胞即可铺满培养孔的70%～80%，此时换无血清培养基，4～6 h后即可加入孕4 d小鼠胚胎进行共同培养，每孔加入胚胎10～20个。在37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养4 d。自培养开始，每12 h在显微镜下观察胚胎的发育、孵化、粘附、种植及外延生长的过程,并记录摄影。
, http://www.100md.com
结果
传代蜕膜细胞与小鼠胚胎共同培养4 d后，蜕膜细胞形态保持完好，无脱落。
胚胎经培养12 h，大部分形态正常的胚胎已发育至囊胚期，并孵化出透明带。部分发育较迟胚胎的透明带正在脱落，孕卵透明带出现缺口，滋养细胞及部分囊腔呈疝气状由透明带缺口突出，已脱落的透明带呈空壳状。孵化胚胎较孵化前略有增大，外周滋养细胞呈单层排列，清晰可数；内细胞团(inner cell)增大，清晰可辨。此时稍稍倾斜平皿，镜下可见囊胚沿平皿底部蜕膜细胞表面滚动，说明胚胎尚未粘附；培养24 h，囊胚较前明显增大，以其背向内细胞团的一极与蜕膜细胞接触，此时倾斜平皿或用极细孔径的巴氏管轻轻吹向囊胚，不能使囊胚移动位置，但可使囊胚以粘附一极为支点轻轻左右摇动，说明囊胚此时已发生粘附，即囊胚滋养细胞与蜕膜细胞和细胞外基质之间，已建立了细胞表面的连接。培养36 h发现，囊胚与蜕膜细胞的接触面积明显增大，大量的滋养细胞在此处增生成复层，囊胚腔仍清晰可见，见图1。
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培养48 h后，胚胎与蜕膜细胞的接触面进一步增大，胚胎整体呈匍匐状与蜕膜细胞全面接触，其体积进一步增大。此时因卵柱形成，囊胚腔已难以看清，见图2。 培养72 h后，胚胎滋养细胞从外胎盘锥(extraplacental cone,EC)部分外延生长，多个滋养细胞结节突起使此时的胚胎失去其原有的球形而变为不规则。因滋养细胞长入蜕膜细胞与平皿间隙，而使胚胎周围蜕膜细胞略微高起，呈被推挤状，此为滋养细胞浸入的结果。部分胚胎停止发育，外观色泽变暗。培养96 h后，一些生命力较旺盛的胚胎继续发育成为明显的3个部分：(1)底部：相当于与蜕膜细胞密切接触的外胎盘锥部分;(2)中间部分:呈索状漂浮于培养液中，相当于鼠胚的胚外外胚层;(3)索状物的顶端成囊状结构，相当于外胚层，囊状结构为羊膜囊腔。至此，无血清小鼠胚体外种植模型建立成功。以上胚胎体外发育过程与文献报道基本相同[3]。
讨论
一、建立胚胎种植模型的意义
, 百拇医药
胚胎种植是生命过程中至关重要的一步，胚胎种植模型是研究种植机理必不可少的手段。国外学者利用胚胎和母体成分建立了许多胚胎种植模型[4，5]，对胚胎体外发育、子宫内膜接受性、胚胎与子宫内膜间复杂的信息沟通、滋养上皮与腔上皮之间相互识别的胚胎学、细胞学以及分子生物学机理进行了深入的探讨。本研究根据早期胚胎对蜕膜组织无种属要求的特性，采用人类蜕膜细胞与4 d小鼠胚胎共同培养，成功的建立了无血清胚胎体外种植模型，对胚胎体外发育、孵化、粘附、种植、滋养细胞外延生长进行了详细的观察。胚胎最终发育形成外胎盘锥和羊膜囊，说明本研究报道的培养体系具有良好的促进胚胎发育的特点。
二、本研究的方法学特点
本研究对原有的蜕膜间质细胞(DSC)的提纯方式进行了部分简化和改进；具体为利用复合消化酶具有消化彻底、时间短、不需震荡的特点，采集细胞数目多，活细胞率高；采用全组细胞培养方式省略了复杂的DSC梯度离心过程；原代细胞过夜换液去除红细胞和未贴壁成分；通过简单的传代，利用DSC生长速度较其他细胞快的特点，使DSC取得数量优势[6]，纯度提高。经泌乳素免疫组织化学证实，传代3代的蜕膜细胞中，DSC纯度达95%。由于其他细胞成分的存在，使培养细胞的细胞因子合成模式更接近生理状态，这对胚胎的发育和着床可能有积极影响。
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三、种植模型的局限性及改进方向
目前，由于细胞培养的条件还难以达到与体内相同的理想状态，胚胎的体外发育与体内发育相比存在明显的不同，早期孕卵和桑椹胚受影响较小，培养时间越长，胎龄越大则影响越大。本研究发现，羊膜囊出现的时间较体内发育延迟，并且形态也明显不同。为了尽量使体外培养条件与体内相似，人们用子宫内膜细胞接种到Metrigel胶(子宫胶)上，使子宫内膜上皮细胞贴壁生长，而DSC则长入Metrigel胶内，制成人工子宫内膜。已有研究表明，滋养细胞能够长入Metrigel胶内，呈现胎盘绒毛状结构[7]。这可能是今后研究胚胎种植模型的方向。
总之，本研究建立的体外无血清胚胎种植模型，具有简单、实用和可靠的特点，为进一步研究胚胎种植机理及细胞因子或激素等对该过程的作用，打下了一定基础。
图1 培养36h小鼠胚胎。胚胎与蜕膜细胞接触面积增加×160 图2培养48h小鼠胚胎，胚胎与蜕膜组织密切接触，滋养细胞外延生长，腔模糊×400
, http://www.100md.com
作者单位：刘建新(现在青岛市立医院妇产科)
罗丽兰(430030 武汉， 同济医科大学附属同济医院妇产科)
阎洁(430030 武汉， 同济医科大学附属同济医院妇产科)
艾继辉(430030 武汉， 同济医科大学附属同济医院妇产科)
参考文献
1，冷颖，杨纫姝.钙调素拮抗剂对离体培养人蜕膜细胞形态和活力的影响.生殖与避孕,1997,17:76-81.
2，Yoshimura Y, Shiokawa S, Nagamatsu S, et al. Effects of beta-1 integrins in the process of implantation. Horm Res， 1995,44 (Suppl 2): 36-41.
, http://www.100md.com
3，Shiokawa S, Yoshimura Y, Nagamatasu S, et al. Function of beta-1 integrins on human decidual cells during implantation.Biol Reprod, 1996,54:745-752.
4，Shiotani M, Noda Y, Mori T.Embryo-dependent induction of uterine receptivity assessed by an in vitro model of implantation in mice. Biol Reprod, 1993,49:704-801.
5，Armant DR, Kameda S.Mouse trophoblast cell invasion of extracellular matrix purified from endometrial tissue: a model for peri-implantation development.J Exp Zool,1994,269:146-156.
6，Montes MJ, Tortase CG, Borja C, et al. Constitutive secretion of Il-6 by human decidual stromal cells in culture, regulatory effect of progesterone. Am J Reprod Immunol, 1995,34:188-194.
7，Tominaga T. Studies on the mechanism of embryo implantation. Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi, 1996, 48:591-603., http://www.100md.com