阴道加德纳菌四种临床检测方法的比较
阴道加德纳菌四种临床检测方法的比较
苏明权 于文彬 陈必良 马越云 王德堂 张建芳 丁振若
关键词：阴道加德纳菌 细菌性阴道病是近年来被确定的与性传播有关的疾病，其病原体为阴道加德纳菌，随着性病病原体感染谱的变化，发病率有逐年增高的趋势。 目前对加德纳菌的实验诊断，主要以直接涂片找线索细胞、分离培养法、免疫荧光法及聚合酶链反应(PCR)技术等。为探讨细菌性阴道病实验诊断方法应用的效果，我们对阴道加德纳菌临床4种检测方法进行比较。报告如下。
一、材料和方法
1.临床标本：50份宫颈分泌物，取自西京医院门诊妇产科就诊的非特异性阴道炎(NSV)患者，常规消毒用无菌棉签自宫颈口取分泌物于无菌生理盐水管中。
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2.革兰染色法：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，常规革兰染色，找到线索细胞者为阳性。
3.吖啶橙染色荧光法[1]：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，自然干燥， 火焰固定，0.1 mmol/L吖啶橙染色37℃30 min，用0.01 mol/L PBS冲洗2次，0.01 mmol/L 氯化钙分色1 min，用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗1次，甘油封片，荧光显微镜观察结果。在上皮细胞中发现成堆桔黄色细小杆菌为阳性。
4.分离培养鉴定法[2]：将无菌生理盐水中的阴道或宫颈分泌物，以无菌手续接种于阴道加德纳菌专用分离培养基上，置5%二氧化碳培养箱37℃孵育48 h，挑取灰色、半透明、光滑、露滴状样菌落，如为革兰染色阴性小杆菌者，进行生化鉴定，生化鉴定标准按文献[3]进行鉴定。
5.PCR检测法：(1)根据Belkum等[4]报道加德纳菌位于IIS-23srRNA基因区为特异性引物序列，扩增片段：433bp。引物1 5′-TTTCGTGGAGGGTTCGATTCTGG-3′引物2 5′-TACA-AGCTGATAGGACGCG-3′由上海生物工程公司合成。(2)临床标本模板DNA的制备：将宫颈分泌物500 μl生理盐水中，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加碱性裂解液，98℃10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液做模板。(3)PCR扩增和产物检测：反应总体积为25 μl，包括10×PCR缓冲液2.5 μl，4×dNTP 1.5 μl，引物1，2各0.25 μl，无菌去离子水9.5 μl，模板10 μl，Taq DNA聚合酶1 U/μl，以无菌石蜡油30 μl覆盖，进入PCR循环，循环参数为:95℃ 5 min，94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，32个循环，最后72℃延伸5 min。取扩增产物15 μl，于2%琼脂糖(含EB液)上100 V电泳30 min，于紫外光下观察结果，出现433 bp扩增带者为阳性，未见433 bp扩增带为阴性。
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二、结果
将50份宫颈分泌物标本，用革兰染色、吖啶橙染色、分离培养，PCR检测同时对加德纳菌进行检测，其中，革兰染色9份为阳性，阳性检出率为18.0%；吖啶橙染色10份为阳性，阳性检出率为20.0%分离培养有8份为阳性，阳性检出率为16.0%；PCR有14份为阳性，阳性率为28.0%。在14份PCR检测阳性的标本中，同时有9份被革兰染色，8份被分离培养所证实，对6份PCR检测阳性而分离培养阴性的患者，经临床调查为取标本前曾用抗生素治疗的患者。
三、讨论
目前革兰染色找线索细胞仍是一种诊断细菌性阴道病的常规方法。吖啶橙染色免疫荧光检测法是近年来一种新的较为理想的检测手段[5，6]，由于吖啶橙是一种具有异染性染料，吖啶橙以插入方式与病原体双螺旋DNA分子结合，根据病原体DNA或RNA对吖啶橙染料的吸附方式不同所放射的荧光也不同，再加上加德纳菌在侵袭的靶目标为上皮细胞聚集，当吖啶橙染色后在荧光照射下，发射出桔红色荧光，能清晰地检测出加德纳菌在上皮细胞上的聚集现象，作出精确的诊断。分离培养鉴定法是国际确认的金指标，临床上由于不正规的应用抗生素，导致许多病原体在一定程度上受到抑制，给分离培养带来困难，造成分离培养阴性结果，建议做分离培养应取材于治疗前的标本，需要专用的高营养的培养基，以提高分离培养的阳性检出率。PCR技术具有高度的特异性和敏感性，选用特异的寡核苷酸引物序列，检测目的是病原体的遗传物质DNA不受抗生素治疗等药物治疗的影响，对彻底根治病原体有着极其重要的意义。
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作者单位：苏明权(710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)
于文彬(710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)
马越云(710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)
张建芳(710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)
丁振若(710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)
陈必良(710032 西安，第四军医大学西京医院妇产科)
王德堂(710032 西安，第四军医大学西京医院妇产科)
参考文献
, 百拇医药
1，丁振若，苏明权，孙怡群，等.荧光法检测肿瘤细胞在泌尿系肿瘤诊断中的应用.中华医学检验杂志，1989，12:167-169.
2，谭巨莲，吴宝印，李仕英，等.阴道加德纳尔菌的分离鉴定.中华医学检验杂志，1991，14:107-108.
3，罗海波，张福森，何浙生，等.现代医学细菌学. 北京：人民卫生出版社, 1995.6:109.
4，Belkum AV, Koeken A, Vandmme P, et al.Development of a species-specific polymerase chain reaction assay for gardnerella vaginalis. Molecul cel probes, 1995,9:167.
5，邓光贵,张文俊,孙为，等. 用吖啶橙染色法快速检查阴道分泌物涂片. 中华医学检验杂志，1992，16:225-226.
6，陈汝光,朱美玲,黄呈辉，等. 阴道加德纳菌致病株的基因诊断方法. 中华医学检验杂志，1999，22:168-169., 百拇医药
苏明权 于文彬 陈必良 马越云 王德堂 张建芳 丁振若
关键词：阴道加德纳菌 细菌性阴道病是近年来被确定的与性传播有关的疾病，其病原体为阴道加德纳菌，随着性病病原体感染谱的变化，发病率有逐年增高的趋势。 目前对加德纳菌的实验诊断，主要以直接涂片找线索细胞、分离培养法、免疫荧光法及聚合酶链反应(PCR)技术等。为探讨细菌性阴道病实验诊断方法应用的效果，我们对阴道加德纳菌临床4种检测方法进行比较。报告如下。
一、材料和方法
1.临床标本：50份宫颈分泌物，取自西京医院门诊妇产科就诊的非特异性阴道炎(NSV)患者，常规消毒用无菌棉签自宫颈口取分泌物于无菌生理盐水管中。
, 百拇医药
2.革兰染色法：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，常规革兰染色，找到线索细胞者为阳性。
3.吖啶橙染色荧光法[1]：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，自然干燥， 火焰固定，0.1 mmol/L吖啶橙染色37℃30 min，用0.01 mol/L PBS冲洗2次，0.01 mmol/L 氯化钙分色1 min，用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗1次，甘油封片，荧光显微镜观察结果。在上皮细胞中发现成堆桔黄色细小杆菌为阳性。
4.分离培养鉴定法[2]：将无菌生理盐水中的阴道或宫颈分泌物，以无菌手续接种于阴道加德纳菌专用分离培养基上，置5%二氧化碳培养箱37℃孵育48 h，挑取灰色、半透明、光滑、露滴状样菌落，如为革兰染色阴性小杆菌者，进行生化鉴定，生化鉴定标准按文献[3]进行鉴定。
5.PCR检测法：(1)根据Belkum等[4]报道加德纳菌位于IIS-23srRNA基因区为特异性引物序列，扩增片段：433bp。引物1 5′-TTTCGTGGAGGGTTCGATTCTGG-3′引物2 5′-TACA-AGCTGATAGGACGCG-3′由上海生物工程公司合成。(2)临床标本模板DNA的制备：将宫颈分泌物500 μl生理盐水中，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加碱性裂解液，98℃10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液做模板。(3)PCR扩增和产物检测：反应总体积为25 μl，包括10×PCR缓冲液2.5 μl，4×dNTP 1.5 μl，引物1，2各0.25 μl，无菌去离子水9.5 μl，模板10 μl，Taq DNA聚合酶1 U/μl，以无菌石蜡油30 μl覆盖，进入PCR循环，循环参数为:95℃ 5 min，94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，32个循环，最后72℃延伸5 min。取扩增产物15 μl，于2%琼脂糖(含EB液)上100 V电泳30 min，于紫外光下观察结果，出现433 bp扩增带者为阳性，未见433 bp扩增带为阴性。
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二、结果
将50份宫颈分泌物标本，用革兰染色、吖啶橙染色、分离培养，PCR检测同时对加德纳菌进行检测，其中，革兰染色9份为阳性，阳性检出率为18.0%；吖啶橙染色10份为阳性，阳性检出率为20.0%分离培养有8份为阳性，阳性检出率为16.0%；PCR有14份为阳性，阳性率为28.0%。在14份PCR检测阳性的标本中，同时有9份被革兰染色，8份被分离培养所证实，对6份PCR检测阳性而分离培养阴性的患者，经临床调查为取标本前曾用抗生素治疗的患者。
三、讨论
目前革兰染色找线索细胞仍是一种诊断细菌性阴道病的常规方法。吖啶橙染色免疫荧光检测法是近年来一种新的较为理想的检测手段[5，6]，由于吖啶橙是一种具有异染性染料，吖啶橙以插入方式与病原体双螺旋DNA分子结合，根据病原体DNA或RNA对吖啶橙染料的吸附方式不同所放射的荧光也不同，再加上加德纳菌在侵袭的靶目标为上皮细胞聚集，当吖啶橙染色后在荧光照射下，发射出桔红色荧光，能清晰地检测出加德纳菌在上皮细胞上的聚集现象，作出精确的诊断。分离培养鉴定法是国际确认的金指标，临床上由于不正规的应用抗生素，导致许多病原体在一定程度上受到抑制，给分离培养带来困难，造成分离培养阴性结果，建议做分离培养应取材于治疗前的标本，需要专用的高营养的培养基，以提高分离培养的阳性检出率。PCR技术具有高度的特异性和敏感性，选用特异的寡核苷酸引物序列，检测目的是病原体的遗传物质DNA不受抗生素治疗等药物治疗的影响，对彻底根治病原体有着极其重要的意义。
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作者单位：苏明权(710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)
于文彬(710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)
马越云(710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)
张建芳(710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)
丁振若(710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)
陈必良(710032 西安，第四军医大学西京医院妇产科)
王德堂(710032 西安，第四军医大学西京医院妇产科)
参考文献
, 百拇医药
1，丁振若，苏明权，孙怡群，等.荧光法检测肿瘤细胞在泌尿系肿瘤诊断中的应用.中华医学检验杂志，1989，12:167-169.
2，谭巨莲，吴宝印，李仕英，等.阴道加德纳尔菌的分离鉴定.中华医学检验杂志，1991，14:107-108.
3，罗海波，张福森，何浙生，等.现代医学细菌学. 北京：人民卫生出版社, 1995.6:109.
4，Belkum AV, Koeken A, Vandmme P, et al.Development of a species-specific polymerase chain reaction assay for gardnerella vaginalis. Molecul cel probes, 1995,9:167.
5，邓光贵,张文俊,孙为，等. 用吖啶橙染色法快速检查阴道分泌物涂片. 中华医学检验杂志，1992，16:225-226.
6，陈汝光,朱美玲,黄呈辉，等. 阴道加德纳菌致病株的基因诊断方法. 中华医学检验杂志，1999，22:168-169., 百拇医药