低浓度一氧化碳对大鼠肺动脉平滑肌细胞的作用机制
低浓度一氧化碳对大鼠肺动脉平滑肌细胞的作用机制
王关嵩 钱桂生 杨晓静 张广运 陈绍珍
关键词：一氧化碳；大鼠；肺动脉；平滑肌细胞 慢性阻塞性肺疾病、肺动脉高压等疾病，其病理基础是动脉中膜肌层增厚，平滑肌细胞 由收缩 型变为合成型，肥大增殖。一氧化碳(CO)作为新的血管舒张因子，可能 具有与一氧化氮(NO)相似的性质，对肺组织又没有直接毒性作用，有研究之必要。本实验 探讨低 浓度CO对缺氧条件下大鼠肺动脉平滑肌细胞(RASMC)的作用机制。
材料与方法 采用贴块法培养RASMC并鉴定后[1]，应用本研究所建立的低浓度CO和缺氧气体处 理培养 细胞容器，对各组细胞进行相应处理，常氧组放在二氧化碳孵箱内作为对照。分为常氧组(N )，缺氧组(H)及低浓度CO复合缺氧组(CO+H)。 生长特性观察及胞内钙浓度[Ca2+] 测定：选 择第4代生长良好的RASMC，胰蛋白酶消化后分散成1×104个/cm2，接种于6孔板，随机 分N、 H、CO+H三组培养，每组6板。每日定时各取2孔细胞观察生长情况。取长满层的细胞，Hanks 液冲洗3次，再用乙二胺四乙酸(EDTA)液温育6 min,最后用M199培养基制成细胞 悬液106个/ml，将荧光剂Fura-2/AM(5 mmol/L) 加入，37℃ 45 min。离心弃上清将细胞悬浮于D′Hanks液[内含1 mmol/L乙二醇四乙酸酯( EGTA)]中测定。激发波 长340 nm和380 nm，光栅5 nm；发射波长510 nm，光栅10 nm。自身荧光作对照，分别加入1 %曲拉 通和20 mmol/L EGTA测最大和最小荧光强度。环-磷酸鸟苷(cGMP)含量测定：三组均先 通入21 % O2 15 min，然后H和CO+H组再通入N2或N2+CO，于1、6、15 min 3个时点取样 。取样时先吸取培养液，再马上加 入1 ml冰冷的0.24 mol/L高氯酸，刮取收集细胞，冰浴超声破碎，离心取上清以3 mol/L K OH中 和至pH值6.3左右，离心除去高氯酸钾沉淀，-20℃贮存备测。cGMP测定按药盒说明进行。 结果以均值±标准差表示(X±s)，采用多因素或单因素方差分析，并做方差保 护显著性检验。
, 百拇医药
结果 (1)对RASMC生长的影响：常氧条件下RASMC细胞呈长梭型，部分区域可重叠生长达多层，部 分区域较稀疏，有典型的“峰-谷”样长势，缺氧条件下RASMC细胞体积肥大，分布比较均 匀 ；低浓度CO处理RASMC，则细胞仍出现较明显的“峰-谷”长势，缺氧条件下RASMC生长较快 ， 于第5天达最大数量，常氧和低浓度CO条件下RASMC均于第7～8天达高峰。(2)对RASMC内[Ca 2+]的效应：缺氧1 min时RASMC的[Ca2+]开始升高(P<0.01)，随着缺氧 时间的延长，[Ca2+]持 续升高至475 mmol/L。低浓度吸入CO 1 min时[Ca2+]未见变化。5 min时升高，其 后虽有升高， 但相差均不显著，见表1。(3)对RASMC的cGMP含量的影响：缺氧1 min RASMC的cGMP变化不 明显 ，5 min时升高为(1.02±0.23) pmol/mg蛋白质(P<0.05)，10 min时高达(1.23±0.19) pmol/mg蛋白质(P<0.01)。低浓度CO处理RASMC 后,RASMC的cGMP与缺氧组比较明显降低 ，但与处理前比较无明显变化。
, 百拇医药
表1 低浓度CO对RASMC的钙浓度的影响(nmol/L)
组别
处理前
1 min
5 min
10 min
15 min
缺氧组
101±14
267±21*
342±20*
408±15*
, 百拇医药
475±19*
低浓度CO组
101±14
102±16
119±28
125±32
128±17
注：与处理前比较，*P<0.01
讨论 既往，有研究指出缺氧可以使大动物的平滑肌细胞收缩增生[2]，本实验证 实对大鼠(缺氧敏感性中等的小动物)缺氧也可以直接发挥作用。而且，缺氧条件下大鼠肺动 脉平滑肌细胞的[Ca2+]、环-磷酸腺苷(cAMP)、cGMP均呈上升趋势，说明急性缺氧 还通过第二信使系统发挥 作用。我们的研究还发现，低浓度CO处理缺氧条件下的RASMC，可使RASMC生长接近常氧状况 ，说明CO具有对抗缺氧的效应。但是，实验表明，CO可以使急性缺氧导致的[Ca2+] 的升高趋 势降低，cGMP含量升高。所以，这种对抗效应只能是部分的。既往有报道，CO在细胞 内也能激活可溶性鸟苷酸环化酶(SGC)，进而调节cGMP合成[3]，与我们的研究一 致。我们的实验证明，外源性低CO既 可以通过调节RASMC内cGMP含量，也可以通过调节细胞内[Ca2+]水平来对RASMC发挥 作用。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700057)
作者单位：王关嵩(400037 重庆，第三军医大学新桥医院呼吸病研究所)
钱桂生(400037 重庆，第三军医大学新桥医院呼吸病研究所)
杨晓静(400037 重庆，第三军医大学新桥医院呼吸病研究所)
陈绍珍(中心实验室)
张广运(检验系)
参考文献
1,王关嵩, 杨晓静, 钱桂生, 等. 大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨. 第三军医大学学 报, 1998，20: 348-350.
2,罗兰, 蔡英年, 李世强, 等. 缺氧对新生小牛肺血管平滑肌细胞增殖的 影响及764-3的抑制作用.中国应用生理学杂志, 1993，9: 205-209.
3,Verma A, Hirsch DJ, Glatt CE, et al. Carbon monoxide: a putati ve neural messenger. Science, 1993，259: 381-384., http://www.100md.com
王关嵩 钱桂生 杨晓静 张广运 陈绍珍
关键词：一氧化碳；大鼠；肺动脉；平滑肌细胞 慢性阻塞性肺疾病、肺动脉高压等疾病，其病理基础是动脉中膜肌层增厚，平滑肌细胞 由收缩 型变为合成型，肥大增殖。一氧化碳(CO)作为新的血管舒张因子，可能 具有与一氧化氮(NO)相似的性质，对肺组织又没有直接毒性作用，有研究之必要。本实验 探讨低 浓度CO对缺氧条件下大鼠肺动脉平滑肌细胞(RASMC)的作用机制。
材料与方法 采用贴块法培养RASMC并鉴定后[1]，应用本研究所建立的低浓度CO和缺氧气体处 理培养 细胞容器，对各组细胞进行相应处理，常氧组放在二氧化碳孵箱内作为对照。分为常氧组(N )，缺氧组(H)及低浓度CO复合缺氧组(CO+H)。 生长特性观察及胞内钙浓度[Ca2+] 测定：选 择第4代生长良好的RASMC，胰蛋白酶消化后分散成1×104个/cm2，接种于6孔板，随机 分N、 H、CO+H三组培养，每组6板。每日定时各取2孔细胞观察生长情况。取长满层的细胞，Hanks 液冲洗3次，再用乙二胺四乙酸(EDTA)液温育6 min,最后用M199培养基制成细胞 悬液106个/ml，将荧光剂Fura-2/AM(5 mmol/L) 加入，37℃ 45 min。离心弃上清将细胞悬浮于D′Hanks液[内含1 mmol/L乙二醇四乙酸酯( EGTA)]中测定。激发波 长340 nm和380 nm，光栅5 nm；发射波长510 nm，光栅10 nm。自身荧光作对照，分别加入1 %曲拉 通和20 mmol/L EGTA测最大和最小荧光强度。环-磷酸鸟苷(cGMP)含量测定：三组均先 通入21 % O2 15 min，然后H和CO+H组再通入N2或N2+CO，于1、6、15 min 3个时点取样 。取样时先吸取培养液，再马上加 入1 ml冰冷的0.24 mol/L高氯酸，刮取收集细胞，冰浴超声破碎，离心取上清以3 mol/L K OH中 和至pH值6.3左右，离心除去高氯酸钾沉淀，-20℃贮存备测。cGMP测定按药盒说明进行。 结果以均值±标准差表示(X±s)，采用多因素或单因素方差分析，并做方差保 护显著性检验。
, 百拇医药
结果 (1)对RASMC生长的影响：常氧条件下RASMC细胞呈长梭型，部分区域可重叠生长达多层，部 分区域较稀疏，有典型的“峰-谷”样长势，缺氧条件下RASMC细胞体积肥大，分布比较均 匀 ；低浓度CO处理RASMC，则细胞仍出现较明显的“峰-谷”长势，缺氧条件下RASMC生长较快 ， 于第5天达最大数量，常氧和低浓度CO条件下RASMC均于第7～8天达高峰。(2)对RASMC内[Ca 2+]的效应：缺氧1 min时RASMC的[Ca2+]开始升高(P<0.01)，随着缺氧 时间的延长，[Ca2+]持 续升高至475 mmol/L。低浓度吸入CO 1 min时[Ca2+]未见变化。5 min时升高，其 后虽有升高， 但相差均不显著，见表1。(3)对RASMC的cGMP含量的影响：缺氧1 min RASMC的cGMP变化不 明显 ，5 min时升高为(1.02±0.23) pmol/mg蛋白质(P<0.05)，10 min时高达(1.23±0.19) pmol/mg蛋白质(P<0.01)。低浓度CO处理RASMC 后,RASMC的cGMP与缺氧组比较明显降低 ，但与处理前比较无明显变化。
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表1 低浓度CO对RASMC的钙浓度的影响(nmol/L)
组别
处理前
1 min
5 min
10 min
15 min
缺氧组
101±14
267±21*
342±20*
408±15*
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475±19*
低浓度CO组
101±14
102±16
119±28
125±32
128±17
注：与处理前比较，*P<0.01
讨论 既往，有研究指出缺氧可以使大动物的平滑肌细胞收缩增生[2]，本实验证 实对大鼠(缺氧敏感性中等的小动物)缺氧也可以直接发挥作用。而且，缺氧条件下大鼠肺动 脉平滑肌细胞的[Ca2+]、环-磷酸腺苷(cAMP)、cGMP均呈上升趋势，说明急性缺氧 还通过第二信使系统发挥 作用。我们的研究还发现，低浓度CO处理缺氧条件下的RASMC，可使RASMC生长接近常氧状况 ，说明CO具有对抗缺氧的效应。但是，实验表明，CO可以使急性缺氧导致的[Ca2+] 的升高趋 势降低，cGMP含量升高。所以，这种对抗效应只能是部分的。既往有报道，CO在细胞 内也能激活可溶性鸟苷酸环化酶(SGC)，进而调节cGMP合成[3]，与我们的研究一 致。我们的实验证明，外源性低CO既 可以通过调节RASMC内cGMP含量，也可以通过调节细胞内[Ca2+]水平来对RASMC发挥 作用。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700057)
作者单位：王关嵩(400037 重庆，第三军医大学新桥医院呼吸病研究所)
钱桂生(400037 重庆，第三军医大学新桥医院呼吸病研究所)
杨晓静(400037 重庆，第三军医大学新桥医院呼吸病研究所)
陈绍珍(中心实验室)
张广运(检验系)
参考文献
1,王关嵩, 杨晓静, 钱桂生, 等. 大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨. 第三军医大学学 报, 1998，20: 348-350.
2,罗兰, 蔡英年, 李世强, 等. 缺氧对新生小牛肺血管平滑肌细胞增殖的 影响及764-3的抑制作用.中国应用生理学杂志, 1993，9: 205-209.
3,Verma A, Hirsch DJ, Glatt CE, et al. Carbon monoxide: a putati ve neural messenger. Science, 1993，259: 381-384., http://www.100md.com