支杆菌分子分类鉴定研究进展
支杆菌分子分类鉴定研究进展
庄玉辉
关键词：分支杆菌；分子分类鉴定 分支杆菌的菌种报道越来越多，迄今已达150种以上。结核分支杆菌与麻风分支杆菌是分支杆菌属内典型的、代表性菌种，其余菌种的命名既往五花八门，现统称为非结核分支杆菌(NTM)。
分支杆菌在生物学上已有公认的分类地位。其中，伯吉细菌分类鉴定系统是最具权威的且一直在沿用着，对包括分支杆菌在内的细菌分类、鉴定仍将发挥着巨大的作用。但这类传统的分类、鉴定系统主要以形态和生理生化特征的综合指标为依据，存在着很大的异质性，也不能揭露生物间的进化关系，是不太可靠的，而且须综合指标，操作繁杂，鉴定一种菌种费时约4周，有其局限性。因此，长期以来，人们不断探索新的分类鉴定方法，这对于生长缓慢、菌种种类繁多且与人类健康戚戚相关的分支杆菌来说显得尤为重要。近几年来，分子分类鉴定方法进展较快，现做概要的介绍。
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一、分子分类鉴定的主要靶基因序列
选作分支杆菌分类鉴定的靶基因序列有hsp65、danj、16 s RNA、16 s～23 s rDNA间隔区序列等。
表1 16 s～23 s rDNA间隔区序列聚合酶链反应(PCR)及限制性片段长度多态性分析(RFLP)
片段范围(bp)
菌种名称
DNA片段大小(bp)
PCR扩增片段
HaeⅢ酶切片段
MspI酶切片段
, 百拇医药
300～350
分支杆菌
戈登分支杆菌
340
190 150
蟾蜍分支杆菌
340
180 100 50
190 90
结核分支杆菌
H37RV
350
, 百拇医药
205 95 55
190 170
BCG
350
205 95 75
190 170
猿猴分支杆菌
350
205 95 75
190 170
海分支杆菌
350
, 百拇医药 205 160
220 150
胞内分支杆菌
350
205 140
240 105
堪萨斯分支杆菌
350
210 154
370～400
胃分支杆菌
370
230 150
, 百拇医药
230 130
蛙分支杆菌
380
210 140
200 130 70
土地分支杆菌
380 316
298 210 100
牛分支杆菌
400
240 95 75
240 160
, 百拇医药
460～500
偶然分支杆菌
470
210 160 100
190 154 100
副偶然分支杆菌
470
310 160
250 170
龟分支杆菌
470 350
340 250 180
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470 140 100
100 75
75
不产色分支杆菌
480
300 200
190 160 100
次要分支杆菌
480
210 170 110
200 150
草分支杆菌
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480
240 160 90
210 190 75
510～600
母牛分支杆菌
516 350
350 300 210
淡黄分支杆菌
575 324
575 190 140
575 190 150
700～
, 百拇医药
苏加分支杆菌
708 340
708 190 190
708 190 150
非分支杆菌
380～
肺炎球菌
380 28
470～
甲链球菌
470 298
470 180 120
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铜绿假单胞菌
479
肺炎克雷伯杆菌
479 398 288
560～
金黄色葡萄球菌
562
340 160 75
表皮葡萄球菌
562 355
562 260 100 75
900～
, 百拇医药
假白喉杆菌
955 562
卡他球菌
1 259 891 562
460～
星状诺卡菌
470
240 160
210 130
短小棒状杆菌
460 280
北京棒状杆菌
, 百拇医药
460 280
500～
红色球菌
516 380
380 300 120
380 240 160
从分类学角度看，一般认为 rRNA 是研究系统进化关系的最好材料。核糖体含23 s、16 s、5 s 三种 rRNA，占细菌所有RNA的80%。因在染色体上有其互补的碱基，称为rDNA。它们含核苷酸数分别约为2 900、1 540、120个。5 s rRNA没有足够的遗传信息用于分类学研究，23 s rRNA相对分子质量较大，分析有一定困难，因此人们看中了16 s rRNA。
16 s rDNA：16 s rDNA 相对分子质量适中，广泛应用于属和种水平种系发育分析、鉴定。16 s rDNA分子中有些部位的序列在进化过程中变化非常缓慢，种间没有太大变化，即有高度保守性，可用这些序列来确定古代的进化关系，作为菌属的划分指标；还有一些部位，序列变化较大，可以用来研究亲缘关系比较接近的种属间的关系，鉴定部分菌种[1,2]。16 s rDNA 已应用于分支杆菌属的划分和菌种鉴定。
, 百拇医药
16 s～23 s rDNA 基因间隔区(intergenic spacer，IGS):是指位于16 s rDNA基因与23 s rDNA基因之间的间隔区域序列。缓慢生长分支杆菌IGS含有一个拷贝，不编码最终产物，不含tRNA，约280 bp长[3]，一般在设计引物时，将邻近的16 s rDNA与23 s rDNA 部分保守性强的序列包括在内，因此，PCR扩增产物相对分子质量要大。IGS序列有高度保守的部分，但与16 s 和23 s rDNA 比较，有更高的变异性，表现出长度和序列结构上的多态性，IGS至少含有7个酶切位点。近几年来已用于多种微生物种水平以下的鉴定。研究表明，IGS是一个良好的遗传标记。1996年泰国Lappayawichit等[4]报道用16 s～23 s rDNA IGS序列对分支杆菌进行较系统的分类、鉴定，证明是一个良好的鉴定单位。有的学者对鸟分支杆菌复合体的IGS进行序列分析，其序列差异至少有12个核苷酸，将其分成12个序列亚型，以达到快速鉴定的目的。张灵霞等[5]报道，IGS序列经PCR扩增和限制性内切酶HaeⅢ、MSPI消化反应，可将分支杆菌与星状诺卡菌、红色球菌、北京棒状杆菌、短小棒状杆菌等不同菌属的代表种区别开；21种受试的分支杆菌，86%可鉴定到种的水平，与9种非分支杆菌的图谱也不同(表1)。
, 百拇医药
hsp65: hsp65基因保守性强，存在于所有分支杆菌以及一些放线菌、白色链霉菌、大肠杆菌中。hsp65序列长度约1 380 bp，PCR扩增产物用限制性内切酶BSTEⅡ和HaeⅢ消化，34种分支杆菌108株临床分离株呈现49种不同图谱。同时，在分支杆菌中含有种特异性等位基因的变异和DNA序列的变异，用于准确、快速鉴定分支杆菌。
二、分子分类鉴定的方法
由于分子生物学技术的引入，使得分支杆菌的分类鉴定发生一些变化，从以表型特征为主逐步向分子分类鉴定拓展。
1.PCR 技术：根据靶序列的特点，设计一对或多对短的核苷酸序列作为PCR的引物，经分析PCR扩增产物来做分类鉴定。单一PCR扩增获得的信息量很少，只能作为属的、群的或某些菌种的鉴定。
2.PCR-RFLP分析：是以PCR为基础的分类鉴定技术和限制性酶切分析相结合而产生的。据文献[6]报道，PCR-RFLP分析是鉴定分支杆菌种的可靠程序，比靠形态和生理生化特性的常规方法更准确、快速、简便。在分支杆菌的分类鉴定中，由于16 s～23 s rDNA IGS的PCR-RFLP分析具有快速、准确及重复性好等优点，已引起人们的重视。这一方法的原则是：选用一对包含16 s～23 s rDNA IGS区域在内的两端某一段保守序列设计引物，PCR扩增获得IGS rDNA片段，用识别4个碱基序列的限制性内切酶HaeⅢ、MSPI消化进行RFLP分析。即根据电泳后比较酶切片段的数目和长度形成的图谱，达到鉴别菌种的目的。
, 百拇医药
这一分析技术已被广泛应用，对16 s rRNA、hsp65等[7，8]也不例外，关键是引物的设计和限制性内切酶的选择。
3.PCR-核酸杂交技术：PCR扩增特定的核酸靶序列，然后针对这一序列设计特异性探针进行杂交反应，显示出探针杂交特异性强的优点。由于探针的专一性强，只能对相应的菌种呈阳性杂交反应，获得信息量少，这样用于菌种鉴定的探针数目就受到限制。目前，对部分分支杆菌，特别是对亲缘关系密切的相邻菌种与复合体，如鸟分支杆菌复合体、结核分支杆菌复合体以及鸟、胞分支杆菌复合体等的鉴定用得比较多，可以鉴定到种、亚种水平。国内外学者研究化学发光显示检测系统以提高探针杂交的敏感性。用反相杂交技术鉴定分支杆菌，一次可鉴定多种菌种。PCR与探针相结合应用，起着互补的作用，改进了两种技术的实用性。
4.直接核酸测序：选择某些核酸靶序列进行直接序列分析，是菌种鉴定可靠、准确的方法，但往往是实验研究的必要手段，难于普及和推广。
, 百拇医药
三、小结与展望
1.长期以来，分支杆菌属的分类鉴定一直采用以表型特征为主的方法。对新的分离菌株的分类鉴定传统方法不太可靠，需要多种信息的综合。现在的趋势是按照种系进化的关系用多相分类鉴定的方法确定精确的位置和定种。概括地讲，多相分类是传统的表型分类、鉴定(形态和生理生化特征)、数值分类及化学分类和分子分类等各种方法的综合选择应用，使分类、鉴定方法更客观合理，更能反映种系间进化关系，多相分类是研究各级分类单位的最有效的手段。
2.由于分子生物学技术的引入，以PCR为基础的各种技术的发展，为分支杆菌分类鉴定开辟了崭新的途径。16 s rDNA、23 s rDNA、16 s～23 s rDNA IGS以及hsp65基因是可选择的不同等级分类单位的核酸靶序列，尤其是16 s～23 s rDNA IGS可变性高，信息量大，对分支杆菌是最理想的分类、鉴定单位。PCR-RFLP是一种快速、简便、准确的技术。当然，分子分类、鉴定方法的研究刚刚起步，处于实验研究阶段，对结果的分析和解释是比较困难的，尚不能用复杂的数值分类法或统计学方法分析处理。需用大量菌株(参考与分离菌株)筛选合适的分子分类、鉴定指标，使分子分类鉴定方法实用化。
, 百拇医药
3.从实用观点看，临床标本以及环境中能分离出的分支杆菌大约有二十几种，其中结核分支杆菌占90%左右，有些亲缘关系比较接近的相邻菌种采用分子分类鉴定方法是可取的，能够快速、简便、准确地鉴定到种或种以下的水平。
作者单位：庄玉辉(100091 北京，解放军第三○九医院结核病研究室)
参考文献
1，Fiss EH, Chehab FF，Brooks GF. DNA amplification and reverse dot blot hybridization for detection and identification of mycobacteria to the species level in the clinical laboratory. J Clin Microbiol, 1992,30:1220-1224.
, 百拇医药
2，Hughes MS, Skuce RA, Beck LA, et al. Identification of mycobacteria from animals by restriction enzyme analysis and direct DNA cycle sequencing of polymerase chain reaction-amplified 16 s rRNA gene sequences. J Clin Microbiol, 1993, 31:3216-3222.
3，Roth A, Fischer M, Hamid ME, et al. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16 s-23 s rRNA gene internal transcribed spacer sequences. J Clin Microbiol, 1998,36:139-147.
, 百拇医药
4，Lappayawichit P, Rienthong D, Rienthong S, et al. Differentiation of mycobacterium species by restriction enzyme analysis of amplified 16 s-23 s ribosomal DNA spacer sequences. Tuberc Lung Dis, 1996, 77:257-263.
5，张灵霞， 庄玉辉. 16 s-23 s rDNA间隔区序列RFLP分析在分枝杆菌分类鉴定中的应用. 防痨信息，1998，2：27-30.
6，Taylor TB, Patterson C, Hale Y,et al. Routine use of PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of mycobacteria growing in liquid media. J Clin Microbiol，1997, 35:79-85.
, http://www.100md.com
7，Vaneechoutte M, Beenhouwer HD, Claeys G, et al. Identification of mycobacterium species by using amplified ribosomal DNA restriction analysis. J Clin Microbiol， 1993, 31:2061-2065.
8，Devallois A, Goh KS, Rastogi N. Rapid identification of mycobacteria to species level by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene and proposition of an algorithm to differentiate 34 mycobacterial species. J Clin Microbiol，1997, 35:2969-2973., 百拇医药
庄玉辉
关键词：分支杆菌；分子分类鉴定 分支杆菌的菌种报道越来越多，迄今已达150种以上。结核分支杆菌与麻风分支杆菌是分支杆菌属内典型的、代表性菌种，其余菌种的命名既往五花八门，现统称为非结核分支杆菌(NTM)。
分支杆菌在生物学上已有公认的分类地位。其中，伯吉细菌分类鉴定系统是最具权威的且一直在沿用着，对包括分支杆菌在内的细菌分类、鉴定仍将发挥着巨大的作用。但这类传统的分类、鉴定系统主要以形态和生理生化特征的综合指标为依据，存在着很大的异质性，也不能揭露生物间的进化关系，是不太可靠的，而且须综合指标，操作繁杂，鉴定一种菌种费时约4周，有其局限性。因此，长期以来，人们不断探索新的分类鉴定方法，这对于生长缓慢、菌种种类繁多且与人类健康戚戚相关的分支杆菌来说显得尤为重要。近几年来，分子分类鉴定方法进展较快，现做概要的介绍。
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一、分子分类鉴定的主要靶基因序列
选作分支杆菌分类鉴定的靶基因序列有hsp65、danj、16 s RNA、16 s～23 s rDNA间隔区序列等。
表1 16 s～23 s rDNA间隔区序列聚合酶链反应(PCR)及限制性片段长度多态性分析(RFLP)
片段范围(bp)
菌种名称
DNA片段大小(bp)
PCR扩增片段
HaeⅢ酶切片段
MspI酶切片段
, 百拇医药
300～350
分支杆菌
戈登分支杆菌
340
190 150
蟾蜍分支杆菌
340
180 100 50
190 90
结核分支杆菌
H37RV
350
, 百拇医药
205 95 55
190 170
BCG
350
205 95 75
190 170
猿猴分支杆菌
350
205 95 75
190 170
海分支杆菌
350
, 百拇医药 205 160
220 150
胞内分支杆菌
350
205 140
240 105
堪萨斯分支杆菌
350
210 154
370～400
胃分支杆菌
370
230 150
, 百拇医药
230 130
蛙分支杆菌
380
210 140
200 130 70
土地分支杆菌
380 316
298 210 100
牛分支杆菌
400
240 95 75
240 160
, 百拇医药
460～500
偶然分支杆菌
470
210 160 100
190 154 100
副偶然分支杆菌
470
310 160
250 170
龟分支杆菌
470 350
340 250 180
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470 140 100
100 75
75
不产色分支杆菌
480
300 200
190 160 100
次要分支杆菌
480
210 170 110
200 150
草分支杆菌
, http://www.100md.com
480
240 160 90
210 190 75
510～600
母牛分支杆菌
516 350
350 300 210
淡黄分支杆菌
575 324
575 190 140
575 190 150
700～
, 百拇医药
苏加分支杆菌
708 340
708 190 190
708 190 150
非分支杆菌
380～
肺炎球菌
380 28
470～
甲链球菌
470 298
470 180 120
, http://www.100md.com
铜绿假单胞菌
479
肺炎克雷伯杆菌
479 398 288
560～
金黄色葡萄球菌
562
340 160 75
表皮葡萄球菌
562 355
562 260 100 75
900～
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假白喉杆菌
955 562
卡他球菌
1 259 891 562
460～
星状诺卡菌
470
240 160
210 130
短小棒状杆菌
460 280
北京棒状杆菌
, 百拇医药
460 280
500～
红色球菌
516 380
380 300 120
380 240 160
从分类学角度看，一般认为 rRNA 是研究系统进化关系的最好材料。核糖体含23 s、16 s、5 s 三种 rRNA，占细菌所有RNA的80%。因在染色体上有其互补的碱基，称为rDNA。它们含核苷酸数分别约为2 900、1 540、120个。5 s rRNA没有足够的遗传信息用于分类学研究，23 s rRNA相对分子质量较大，分析有一定困难，因此人们看中了16 s rRNA。
16 s rDNA：16 s rDNA 相对分子质量适中，广泛应用于属和种水平种系发育分析、鉴定。16 s rDNA分子中有些部位的序列在进化过程中变化非常缓慢，种间没有太大变化，即有高度保守性，可用这些序列来确定古代的进化关系，作为菌属的划分指标；还有一些部位，序列变化较大，可以用来研究亲缘关系比较接近的种属间的关系，鉴定部分菌种[1,2]。16 s rDNA 已应用于分支杆菌属的划分和菌种鉴定。
, 百拇医药
16 s～23 s rDNA 基因间隔区(intergenic spacer，IGS):是指位于16 s rDNA基因与23 s rDNA基因之间的间隔区域序列。缓慢生长分支杆菌IGS含有一个拷贝，不编码最终产物，不含tRNA，约280 bp长[3]，一般在设计引物时，将邻近的16 s rDNA与23 s rDNA 部分保守性强的序列包括在内，因此，PCR扩增产物相对分子质量要大。IGS序列有高度保守的部分，但与16 s 和23 s rDNA 比较，有更高的变异性，表现出长度和序列结构上的多态性，IGS至少含有7个酶切位点。近几年来已用于多种微生物种水平以下的鉴定。研究表明，IGS是一个良好的遗传标记。1996年泰国Lappayawichit等[4]报道用16 s～23 s rDNA IGS序列对分支杆菌进行较系统的分类、鉴定，证明是一个良好的鉴定单位。有的学者对鸟分支杆菌复合体的IGS进行序列分析，其序列差异至少有12个核苷酸，将其分成12个序列亚型，以达到快速鉴定的目的。张灵霞等[5]报道，IGS序列经PCR扩增和限制性内切酶HaeⅢ、MSPI消化反应，可将分支杆菌与星状诺卡菌、红色球菌、北京棒状杆菌、短小棒状杆菌等不同菌属的代表种区别开；21种受试的分支杆菌，86%可鉴定到种的水平，与9种非分支杆菌的图谱也不同(表1)。
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hsp65: hsp65基因保守性强，存在于所有分支杆菌以及一些放线菌、白色链霉菌、大肠杆菌中。hsp65序列长度约1 380 bp，PCR扩增产物用限制性内切酶BSTEⅡ和HaeⅢ消化，34种分支杆菌108株临床分离株呈现49种不同图谱。同时，在分支杆菌中含有种特异性等位基因的变异和DNA序列的变异，用于准确、快速鉴定分支杆菌。
二、分子分类鉴定的方法
由于分子生物学技术的引入，使得分支杆菌的分类鉴定发生一些变化，从以表型特征为主逐步向分子分类鉴定拓展。
1.PCR 技术：根据靶序列的特点，设计一对或多对短的核苷酸序列作为PCR的引物，经分析PCR扩增产物来做分类鉴定。单一PCR扩增获得的信息量很少，只能作为属的、群的或某些菌种的鉴定。
2.PCR-RFLP分析：是以PCR为基础的分类鉴定技术和限制性酶切分析相结合而产生的。据文献[6]报道，PCR-RFLP分析是鉴定分支杆菌种的可靠程序，比靠形态和生理生化特性的常规方法更准确、快速、简便。在分支杆菌的分类鉴定中，由于16 s～23 s rDNA IGS的PCR-RFLP分析具有快速、准确及重复性好等优点，已引起人们的重视。这一方法的原则是：选用一对包含16 s～23 s rDNA IGS区域在内的两端某一段保守序列设计引物，PCR扩增获得IGS rDNA片段，用识别4个碱基序列的限制性内切酶HaeⅢ、MSPI消化进行RFLP分析。即根据电泳后比较酶切片段的数目和长度形成的图谱，达到鉴别菌种的目的。
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这一分析技术已被广泛应用，对16 s rRNA、hsp65等[7，8]也不例外，关键是引物的设计和限制性内切酶的选择。
3.PCR-核酸杂交技术：PCR扩增特定的核酸靶序列，然后针对这一序列设计特异性探针进行杂交反应，显示出探针杂交特异性强的优点。由于探针的专一性强，只能对相应的菌种呈阳性杂交反应，获得信息量少，这样用于菌种鉴定的探针数目就受到限制。目前，对部分分支杆菌，特别是对亲缘关系密切的相邻菌种与复合体，如鸟分支杆菌复合体、结核分支杆菌复合体以及鸟、胞分支杆菌复合体等的鉴定用得比较多，可以鉴定到种、亚种水平。国内外学者研究化学发光显示检测系统以提高探针杂交的敏感性。用反相杂交技术鉴定分支杆菌，一次可鉴定多种菌种。PCR与探针相结合应用，起着互补的作用，改进了两种技术的实用性。
4.直接核酸测序：选择某些核酸靶序列进行直接序列分析，是菌种鉴定可靠、准确的方法，但往往是实验研究的必要手段，难于普及和推广。
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三、小结与展望
1.长期以来，分支杆菌属的分类鉴定一直采用以表型特征为主的方法。对新的分离菌株的分类鉴定传统方法不太可靠，需要多种信息的综合。现在的趋势是按照种系进化的关系用多相分类鉴定的方法确定精确的位置和定种。概括地讲，多相分类是传统的表型分类、鉴定(形态和生理生化特征)、数值分类及化学分类和分子分类等各种方法的综合选择应用，使分类、鉴定方法更客观合理，更能反映种系间进化关系，多相分类是研究各级分类单位的最有效的手段。
2.由于分子生物学技术的引入，以PCR为基础的各种技术的发展，为分支杆菌分类鉴定开辟了崭新的途径。16 s rDNA、23 s rDNA、16 s～23 s rDNA IGS以及hsp65基因是可选择的不同等级分类单位的核酸靶序列，尤其是16 s～23 s rDNA IGS可变性高，信息量大，对分支杆菌是最理想的分类、鉴定单位。PCR-RFLP是一种快速、简便、准确的技术。当然，分子分类、鉴定方法的研究刚刚起步，处于实验研究阶段，对结果的分析和解释是比较困难的，尚不能用复杂的数值分类法或统计学方法分析处理。需用大量菌株(参考与分离菌株)筛选合适的分子分类、鉴定指标，使分子分类鉴定方法实用化。
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3.从实用观点看，临床标本以及环境中能分离出的分支杆菌大约有二十几种，其中结核分支杆菌占90%左右，有些亲缘关系比较接近的相邻菌种采用分子分类鉴定方法是可取的，能够快速、简便、准确地鉴定到种或种以下的水平。
作者单位：庄玉辉(100091 北京，解放军第三○九医院结核病研究室)
参考文献
1，Fiss EH, Chehab FF，Brooks GF. DNA amplification and reverse dot blot hybridization for detection and identification of mycobacteria to the species level in the clinical laboratory. J Clin Microbiol, 1992,30:1220-1224.
, 百拇医药
2，Hughes MS, Skuce RA, Beck LA, et al. Identification of mycobacteria from animals by restriction enzyme analysis and direct DNA cycle sequencing of polymerase chain reaction-amplified 16 s rRNA gene sequences. J Clin Microbiol, 1993, 31:3216-3222.
3，Roth A, Fischer M, Hamid ME, et al. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16 s-23 s rRNA gene internal transcribed spacer sequences. J Clin Microbiol, 1998,36:139-147.
, 百拇医药
4，Lappayawichit P, Rienthong D, Rienthong S, et al. Differentiation of mycobacterium species by restriction enzyme analysis of amplified 16 s-23 s ribosomal DNA spacer sequences. Tuberc Lung Dis, 1996, 77:257-263.
5，张灵霞， 庄玉辉. 16 s-23 s rDNA间隔区序列RFLP分析在分枝杆菌分类鉴定中的应用. 防痨信息，1998，2：27-30.
6，Taylor TB, Patterson C, Hale Y,et al. Routine use of PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of mycobacteria growing in liquid media. J Clin Microbiol，1997, 35:79-85.
, http://www.100md.com
7，Vaneechoutte M, Beenhouwer HD, Claeys G, et al. Identification of mycobacterium species by using amplified ribosomal DNA restriction analysis. J Clin Microbiol， 1993, 31:2061-2065.
8，Devallois A, Goh KS, Rastogi N. Rapid identification of mycobacteria to species level by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene and proposition of an algorithm to differentiate 34 mycobacterial species. J Clin Microbiol，1997, 35:2969-2973., 百拇医药