单链构象多态性银染技术检测结核菌katG基因变异
单链构象多态性银染技术检测结核菌katG基因变异
朱中元 陈允凤 王海波 陈贻平 张贵琛 邵寒霜
关键词：单链构象多态性(SSCP)技术 ；结核分枝杆菌；katG基因 单链构象多态性(SSCP)技术能分辨碱基不同的核酸片段，并应用于基因变异检测。我们根据对耐药结核菌的测序结果，设计了一对引物，建立SSCP检测katG基因突变的方法。
一、材料与方法
1.菌株分离与药敏测定方法同文献[1]。
2.核酸提取：痰液经碱消化，提取DNA。方法同文献[1]。
3.引物设计和PCR扩增： KG3： 5′-TCA CCA GCG GCA TCG AGG TC-3′，KG4：5′-ATG CCC GGA TCT GGC TCT TA-3′ 。位于katG的第2916～3371碱基位置，长度为456bp。由大连宝生物技术公司合成并纯化。
, 百拇医药
4.SSCP：取PCR产物，加入等量变性液，100℃水浴10 min，冰浴，上样于3%聚丙烯酰胺凝胶，140 V电泳，二甲苯青至胶底，取下一侧玻璃，凝胶粘附在另一块玻璃上，依次置入固定液浸泡30 min，在0.1%AgNO3溶液中浸泡30 min，取出置入显色液中显色，放入10%乙酸终止反应，观察结果。
二、结果
1.PCR扩增：对66株结核菌、H37Rv、H37Ra、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌、棒状杆菌、肺炎链球菌、痢疾杆菌和大肠埃希菌等细菌的DNA进行扩增。所有H37Rv、H37Ra和结核菌均出现456 bp产物，其他细菌均阴性。表明引物和反应体系的特异性好。从改良罗氏培养基上取H37Rv菌20 mg，按107个细菌/mg计算，稀释成105、104、……、10个细菌/ml，提取DNA进行扩增，敏感性可达100个菌体。重复扩增均能得到稳定一致的结果。
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2.SSCP结果与药敏结果比较：进行SSCP和药敏试验的30株结核菌，对异烟肼(INH)敏感者，28株(93.3%)的电泳带位置与H37Rv的位置一致，即SSCP结果均正常，无突变出现。而耐INH的20株结核菌中，只有1株PCR产物位置与H37Rv一致，SSCP正常，其余均出现电泳位置差异，表明有突变。其敏感性达到95%(19/20)，特异性达到93.3%。
3.SSCP结果与DNA测序结果比较：已测定序列的15株结核菌株，SSCP检测，全部菌株与H37Rv标准株及敏感株有不同的电泳位置，表明SSCP结果与测序结果一致。
4.应用情况：11份痰液，PCR-SSCP检测时，与H37Rv有位置不同的电泳带，表明存在katG基因变异。5株结核菌培养阳性中，3株INH最低抑菌浓度分别为5 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml，且均对INH耐药。
三、讨论
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我们建立的方法的检出率高于张宗德等[2]报告的SSCP检测katG基因突变率为57%的结果，可能与我们选定的区域变异率为100%，而且检测的片段较长有关。
SSCP的技术关键是引物的设计与筛选。该方法的检出率高的原因是采用了建立在自行测序研究基础上设计的引物，而且该片段内katG的突变率为100%，检测结果与测序的结果完全符合。另一关键在于采用的聚丙烯酰胺的浓度为3%较理想，优点是电泳带的差异明显，银染本底浅，方便观察。缺点是卸下玻板时易造成凝胶破裂，但只取下1侧玻璃，让凝胶粘附在另1块玻板上银染，即可解决。以上结果表明，该方法在实验室有推广使用价值。
基金项目：本研究受海南省自然科学基金资助(39611)
作者单位：朱中元(570311 海口，海南省农垦总局医院)
陈允凤(570311 海口，海南省农垦总局医院)
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王海波(570311 海口，海南省农垦总局医院)
陈贻平(570311 海口，海南省农垦总局医院)
张贵琛(570311 海口，海南省农垦总局医院)
邵寒霜(中国热带农业科学院生物技术国家重点实验室)
参考文献
1，朱中元，陈贻平，陈允凤，等. 耐药结核分枝杆菌基因变异研究. 中华检验医学杂志，2000，23：26-28.
2，张宗德，马玙，程绍基，等. 异烟肼耐药与结核分支杆菌katG基因突变的研究. 中华结核与呼吸杂志, 1996, 19:346-349., http://www.100md.com
朱中元 陈允凤 王海波 陈贻平 张贵琛 邵寒霜
关键词：单链构象多态性(SSCP)技术 ；结核分枝杆菌；katG基因 单链构象多态性(SSCP)技术能分辨碱基不同的核酸片段，并应用于基因变异检测。我们根据对耐药结核菌的测序结果，设计了一对引物，建立SSCP检测katG基因突变的方法。
一、材料与方法
1.菌株分离与药敏测定方法同文献[1]。
2.核酸提取：痰液经碱消化，提取DNA。方法同文献[1]。
3.引物设计和PCR扩增： KG3： 5′-TCA CCA GCG GCA TCG AGG TC-3′，KG4：5′-ATG CCC GGA TCT GGC TCT TA-3′ 。位于katG的第2916～3371碱基位置，长度为456bp。由大连宝生物技术公司合成并纯化。
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4.SSCP：取PCR产物，加入等量变性液，100℃水浴10 min，冰浴，上样于3%聚丙烯酰胺凝胶，140 V电泳，二甲苯青至胶底，取下一侧玻璃，凝胶粘附在另一块玻璃上，依次置入固定液浸泡30 min，在0.1%AgNO3溶液中浸泡30 min，取出置入显色液中显色，放入10%乙酸终止反应，观察结果。
二、结果
1.PCR扩增：对66株结核菌、H37Rv、H37Ra、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌、棒状杆菌、肺炎链球菌、痢疾杆菌和大肠埃希菌等细菌的DNA进行扩增。所有H37Rv、H37Ra和结核菌均出现456 bp产物，其他细菌均阴性。表明引物和反应体系的特异性好。从改良罗氏培养基上取H37Rv菌20 mg，按107个细菌/mg计算，稀释成105、104、……、10个细菌/ml，提取DNA进行扩增，敏感性可达100个菌体。重复扩增均能得到稳定一致的结果。
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2.SSCP结果与药敏结果比较：进行SSCP和药敏试验的30株结核菌，对异烟肼(INH)敏感者，28株(93.3%)的电泳带位置与H37Rv的位置一致，即SSCP结果均正常，无突变出现。而耐INH的20株结核菌中，只有1株PCR产物位置与H37Rv一致，SSCP正常，其余均出现电泳位置差异，表明有突变。其敏感性达到95%(19/20)，特异性达到93.3%。
3.SSCP结果与DNA测序结果比较：已测定序列的15株结核菌株，SSCP检测，全部菌株与H37Rv标准株及敏感株有不同的电泳位置，表明SSCP结果与测序结果一致。
4.应用情况：11份痰液，PCR-SSCP检测时，与H37Rv有位置不同的电泳带，表明存在katG基因变异。5株结核菌培养阳性中，3株INH最低抑菌浓度分别为5 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml，且均对INH耐药。
三、讨论
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我们建立的方法的检出率高于张宗德等[2]报告的SSCP检测katG基因突变率为57%的结果，可能与我们选定的区域变异率为100%，而且检测的片段较长有关。
SSCP的技术关键是引物的设计与筛选。该方法的检出率高的原因是采用了建立在自行测序研究基础上设计的引物，而且该片段内katG的突变率为100%，检测结果与测序的结果完全符合。另一关键在于采用的聚丙烯酰胺的浓度为3%较理想，优点是电泳带的差异明显，银染本底浅，方便观察。缺点是卸下玻板时易造成凝胶破裂，但只取下1侧玻璃，让凝胶粘附在另1块玻板上银染，即可解决。以上结果表明，该方法在实验室有推广使用价值。
基金项目：本研究受海南省自然科学基金资助(39611)
作者单位：朱中元(570311 海口，海南省农垦总局医院)
陈允凤(570311 海口，海南省农垦总局医院)
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王海波(570311 海口，海南省农垦总局医院)
陈贻平(570311 海口，海南省农垦总局医院)
张贵琛(570311 海口，海南省农垦总局医院)
邵寒霜(中国热带农业科学院生物技术国家重点实验室)
参考文献
1，朱中元，陈贻平，陈允凤，等. 耐药结核分枝杆菌基因变异研究. 中华检验医学杂志，2000，23：26-28.
2，张宗德，马玙，程绍基，等. 异烟肼耐药与结核分支杆菌katG基因突变的研究. 中华结核与呼吸杂志, 1996, 19:346-349., http://www.100md.com