氧化型脂蛋白(a)对血管内皮细胞血小板衍生生长因子B链表达的影响
氧化型脂蛋白(a)对血管内皮细胞血小板衍生生长因子B链表达的影响
赵水平 许丹焰
摘 要 目的 探讨氧化型脂蛋白(a)〔ox-Lp(a)〕对人脐静脉内皮细胞表达血小板衍生生长因子-B链(PDGF-B)的影响，以阐明其在动脉粥样硬化发生中的作用。 方法 在内皮细胞培养基中分别加入天然脂蛋白(a)〔n-Lp(a)〕与ox-Lp(a)及天然低密度脂蛋白(n-LDL)与氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，37℃温育。用细胞酶联免疫检测PDGF-B蛋白的表达，同时用荧光免疫方法证实PDGF-B蛋白表达，并用Northern杂交检测PDGF-B mRNA的表达。 结果 ox-Lp(a)增加内皮细胞PDGF-B蛋白表达呈剂量依赖性，并且5 nmol/L及20 nmol/L ox-Lp(a)分别使PDGF-B表达明显增加了(156±18)%及(219±42)%。同时用免疫荧光证实ox-Lp(a)促使PDGF-B表达增强。比较相同浓度的n-LDL、n-Lp(a)、ox-LDL、ox-Lp(a)4种脂蛋白的作用，显示ox-Lp(a)的作用最强，10 nmol/L的n-LDL、n-Lp(a)、ox-LDL、ox-Lp(a)分别使PDGF-B表达增加了(96±17)%、(138±19)%、(127±11)%、(248±41)%。Northern杂交检测结果显示，ox-Lp(a)能促使PDGF-B mRNA表达明显增加。 结论 ox-Lp(a)能诱导内皮细胞表达PDGF-B增强，这可能与Lp(a)致动脉粥样硬化作用机制有关。
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关键词：脂蛋白类；血小板源生长因子；动脉粥样硬化
血小板衍生生长因子(PDGF)主要促进动脉中膜收缩型平滑肌细胞(SMC)转化为分泌型SMC迁移到内膜进行增殖,同时分泌大量活性物质〔1〕。血小板衍生生长因子B链(PDGF-B)主要由巨噬细胞、内皮细胞产生。脂蛋白(a)〔Lp(a)〕已被证明是动脉粥样硬化的独立危险因素，其在动脉粥样硬化的发病过程中发挥了极重要的作用，但其作用机制尚不明确。已有研究发现Lp(a)在血管内膜下易被氧化〔2〕。本研究着重探讨氧化修饰后的Lp(a)〔ox-Lp(a)〕能否调节血管内皮细胞PDGF-B的表达及其特征。
材料与方法
一、人外周血Lp(a)与低密度脂蛋白(LDL)的分离和氧化
筛选血浆Lp(a)浓度大于900 mg/L的献血员，用不连续密度梯度离心法〔Backman L8-80M型超高速离心机，VAC 50 rotors(转头)〕从外周血中分离Lp(a)和LDL，采用Sepharose 6B层析柱纯化Lp(a)。蛋白含量用Bradford方法检测。加入终浓度为10 μmol/L的CuSO4 37℃温育24 h使Lp(a)和LDL氧化。在0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS)中透析24 h后测定丙二醛浓度作为硫巴比妥酸反应物质(TBARS)浓度。
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二、人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养与处理
HUVECs细胞系(ECV-30)购自美国典型物保藏中心。用10% FCS-DME培养基(美国Sigma公司产品)培养，第3～5代用于实验。96孔细胞培养皿中细胞生长至融合24 h后，换以无血清培养基继续培养12～24 h，分别加入：(1)终浓度为2.5、5、10、20 nmol/L的ox-Lp(a)，作用2 h；(2)终浓度为10 nmol/L的ox-Lp(a)，作用0.5、1、2、6、12 h；(3)终浓度为10 nmol/L的天然Lp(a)〔n-Lp(a)〕和ox-Lp(a)、天然LDL(n-LDL)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，作用2 h。加入不同浓度的PBS作为阴性对照组，不加任何刺激因素作为空白对照组。
三、PDGF-B蛋白表达的检测
采用细胞酶联免疫法，由Pigott等〔3〕的方法改进而来。培养皿弃液，固定、清洗、用小牛血清阻断2 h后加入兔抗人PDGF-B抗体(N-13，美国Gene公司产品)，37℃作用2 h，清洗4～6次后加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(美国Sigma公司产品)；37℃作用1 h，加入过氧化酶底物邻苯二胺，显色后加2 mol/L H2SO4以终止反应。用Bio-Rad 450酶标仪测量492 nm波长时的吸光度(A)值。将在不加任何处理因素的细胞培养孔中所测得的A值定义为100%，加入处理因素的各孔所测得的A值记录为增加的百分率。
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四、内皮细胞表面PDGF-B蛋白表达的检测
采用荧光免疫法。细胞接种于无菌盖玻片上，当细胞生长至亚融合状态时在培养基中加入ox-Lp(a)至终浓度为10 nmol/L,作用2 h后固定、清洗、加入兔抗人PDGF-B一抗(N-13)，37℃作用2 h后加入荧光素标记的羊抗兔-IgG，再清洗后加入抗荧光淬灭剂，荧光显微镜下观察、照相。
五、内皮细胞PDGF-B mRNA的检测
内皮细胞暴露于4种脂蛋白3～4 h后，用TRIZOL TM Reagent(美国GIBCO公司产品)提取细胞总RNA，取15～20 μg RNA在含甲醛的1%琼脂糖胶中电泳5 h，真空电转移至Hybood-N+尼龙膜上。与〔γ-32P〕dATP标记的PDGF-B寡核苷酸探针(美国CAL公司产品)杂交，洗膜后-70℃曝光1周。使用GAPDH探针重复杂交作为内对照。用医用图像处理系统检测X线片上的杂交信号。
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六、统计学处理
多组间均数比较采用方差分析，两组间均数比较采用t检验，对有相关趋势的变量进行直线相关分析。
结 果
一、脂质过氧化测定
见图1。n-Lp(a)和n-LDL的TBARS值分别为(6.96±1.10)和(5.06±3.95)nmol/mg protein；而ox-Lp(a)和ox-LDL的TBARS值分别为(48.75±2.90)和(38.25±3.95)nmol/mg protein,分别明显高于n-Lp(a)和n-LDL；并且ox-Lp(a)和ox-LDL的TBARS值差异有显著性。
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1 n-LDL; 2 n-Lp(a); 3 ox-LDL; 4 ox-Lp(a)
与n-LDL比较，*P<0.001;与n-Lp(a)比较，△P<0.001；与ox-LDL比较，＃P<0.05
图1 LDL与Lp(a)氧化的比较
二、不同浓度ox-Lp(a)对PDGF-B表达的影响
见表1。以空白对照的PDGF-B表达为100%，当不同浓度ox-Lp(a)与内皮细胞孵育2 h后,PDGF-B表达逐步增高，并与ox-Lp(a)呈剂量依赖性(r=0.957,b=6.05，P<0.05)。5.0 nmol/L ox-Lp(a)能使PDGF-B表达明显增强。而不同浓度的PBS不能使PDGF-B表达增加。荧光免疫实验亦证实，10 nmol/L ox-Lp(a)促使内皮细胞表面PDGF-B表达的作用较空白对照增强。
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表1 ox-Lp(a)浓度对内皮细胞表面PDGF-B表达
的影响(X±s,%)
ox-Lp(a)浓度
(nmol/L)
PDGF-B表达
PBS组
ox-Lp(a)组
0
100.00±?0.00
100.00±?0.00
2.5
, 百拇医药 93.32±11.13
110.26±14.96
5.0
113.49±12.67
156.10±18.02*△
10.0
112.80±14.01
185.35±28.08**△△
20.0
99.58±12.57
219.26±42.50**△△
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注：与空白对照〔ox-Lp(a)浓度为0〕比较，*P<0.05，**P<0.01；与PBS组比较，△P<0.05，△△P<0.01
三、孵育时间与ox-Lp(a)对内皮细胞PDGF-B表达的影响的关系
见表2。以空白对照的PDGF-B表达为100%，10 nmol/L ox-Lp(a)与内皮细胞作用仅0.5 h,PDGF-B表达即显著增加。PDGF-B表达于2 h达高峰,此后逐渐下降；12 h时PDGF-B表达与空白及阴性对照组无明显差异。但PBS与内皮细胞作用12 h不引起PDGF-B蛋白的显著变化。
表2 孵育时间与ox-Lp(a)对内皮细胞表面
PDGF-B表达的关系(X±s，%)
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时间(h)
PDGF-B表达
PBS组
ox-Lp(a)组
0.5
98.49±2.13
138.79±12.87**△△
1.0
114.84±7.20
142.96±10.04**△△
2.0
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107.89±7.20
146.94±13.03**△△
6.0
115.60±3.67
140.70±15.71*△
12.0
116.15±8.51
131.85±15.62
注：与空白对照(PDGF-B表达为100%)比较，*P<0.05，**P<0.01；与PBS组比较，△P<0.05，△△P<0.01
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四、4种脂蛋白对内皮细胞PDGF-B蛋白表达的影响
见图2。10 nmol/L n-LDL、n-Lp(a)、ox-LDL、ox-Lp(a)分别使PDGF-B表达增加了(96±17)%、(138±19)%、(127±11)%、(248±41)%。n-Lp(a)、ox-Lp(a)和ox-LDL均明显增加PDGF-B蛋白的表达,并且ox-Lp(a)促使PDGF-B蛋白表达的作用强于ox-LDL及n-Lp(a)，而n-LDL及PBS的作用却不明显。
五、各种脂蛋白对内皮细胞PDGF-B mRNA表达的影响
见图3。当内皮细胞暴露于n-LDL 3～4 h后,PDGF-B mRNA表达增加不明显,为对照组的1.13倍。当内皮细胞暴露于n-Lp(a)和ox-LDL 3～4 h后,PDGF-B mRNA表达下降。相反,当内皮细胞暴露于10、20 nmol/L ox-Lp(a) 3～4 h后,PDGF-B mRNA表达明显增加,分别为对照组的2.9倍及4.6倍。
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1 空白对照； 2 PBS； 3 n-LDL; 4 n-Lp(a); 5 ox-LDL; 6 ox-Lp(a)
与空白对照、PBS、n-LDL组分别比较,*P<0.05，**P<0.001；与n-Lp(a)比较,△P<0.05；与ox-LDL比较,##P<0.01
图2 4种脂蛋白对内皮细胞表面PDGF-B表达作用的比较
1 空白对照; 2 n-LDL； 3 ox-LDL； 4 n-Lp(a)； 5 ox-Lp(a)； 6 ox-Lp(a)(2、3、4、6浓度为10 nmol/L，5为20 nmol/L)
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图3 用PDGF-B和GAPDH探针进行Northern杂交检测结果
讨 论
动脉粥样硬化病变的发生、发展涉及许多慢性过程，包括多种参与动脉粥样硬化的细胞的粘附、移行、增殖和分化，而这些过程均由各种细胞因子和生长因子所调控。在所有的生长因子中，PDGF同时具有刺激细胞增殖、促使细胞粘附及强烈的缩血管作用，因此认为PDGF在动脉粥样硬化病变的发展过程中起着重要作用〔4〕。
血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖及向内膜移行是动脉粥样硬化病变和经皮冠状动脉成形术(PTCA)后再狭窄的主要病理表现。大量流行病学调查证明，血浆Lp(a)水平升高是动脉粥样硬化和PTCA后再狭窄的独立危险因素〔5〕，但Lp(a)引起这两种病变的机制不明。Grainger等〔6〕将n-Lp(a)直接作用于离体培养的VSMC，能刺激VSMC增殖。本研究观测到10 nmol/L的n-Lp(a)使内皮细胞上PDGF-B蛋白表达增强，结果与之相符。已知PDGF是一种强烈的刺激细胞增殖的蛋白，因此推测n-Lp(a)通过促使内皮细胞表达PDGF-B增多而作用于VSMC并使其异常增殖。
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已经证实脂蛋白在体内不仅以天然形式存在，也可以修饰的脂蛋白形式存在，其中以氧化修饰的脂蛋白的作用最为重要。体内的众多因素如血浆中的超氧阴离子、金属基团、血管内皮细胞均能使脂蛋白发生氧化修饰作用。LDL的氧化已被广泛研究。Lp(a)与LDL相比，在化学结构上十分类似，仅较LDL多含1个载脂蛋白(a)〔apo(a)〕。已逐渐认识到Lp(a)与LDL一样能被氧化，而且Lp(a)的氧化敏感性较LDL更高〔2〕。在实验动物动脉粥样硬化斑块中能检测到大量ox-Lp(a)的存在〔7〕，因此推测ox-Lp(a)更具有致动脉粥样硬化作用。我们首次报道了ox-Lp(a)在较低浓度(5 nmol/L)即能明显增加内皮细胞PDGF-B的表达，并且ox-Lp(a)致内皮细胞PDGF-B表达增加与其剂量呈依赖性。这些结果提示，ox-Lp(a)可能是通过调节PDGF-B的表达，而在动脉粥样硬化的发展及PTCA后再狭窄中起重要作用。
大量研究证实氧化修饰脂蛋白的生物活性明显大于天然的脂蛋白。本研究结果亦支持这一观点。本研究观察到，体外ox-LDL为10 nmol/L浓度时促使内皮细胞表达PDGF-B的作用较同样浓度的n-LDL的作用强，而且在相同浓度时，ox-Lp(a)促使内皮细胞表达PDGF-B的作用较n-Lp(a)更强。因为氧化后脂蛋白的结构和生物活性发生了明显的改变，并且脂蛋白的氧化伴随着大量高活性反应物质的生成〔2〕，因此氧化型脂蛋白能刺激内皮细胞分泌更多的细胞因子和生长因子。
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ox-LDL已被确认是一种具有强的致动脉粥样硬化作用的脂蛋白，其在动脉粥样斑块形成与发展中起决定性作用。但本研究发现，在同样浓度下，ox-Lp(a)促使内皮细胞PDGF-B表达的作用较ox-LDL强，此结果与进一步的Northern杂交检测结果一致。Northern杂交检测显示ox-LDL不能促使PDGF-B mRNA表达增加，这与Malden等〔8〕的结果相符，他们发现将ox-LDL与人类单核来源的巨噬细胞孵育24 h，能明显抑制巨噬细胞PDGF-B mRNA的表达。而更为重要的是，本研究观察到ox-Lp(a)能明显增加PDGF-B mRNA的表达。由此可以解释两种氧化型脂蛋白促PDGF-B表达作用存在差异的原因。在PDGF-B表达较多的区域，其平滑肌细胞增殖、炎性细胞粘附及血管收缩作用可能更剧烈，因此本实验的结果亦支持ox-Lp(a)较ox- LDL具有更强的致动脉粥样硬化作用的观点〔9，10〕。
基金项目：国家自然科学基金(39670318)、CMB基金
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作者单位：赵水平(410011 长沙市，湖南医科大学附属第二医院心内科)
许丹焰(410011 长沙市，湖南医科大学附属第二医院心内科)
参考文献
1，Khachigian LM, Chesterman CN. Platelet-derived growth factor and its receptor: structure and roles in normal growth and pathology. Platelets，1991, 4: 304-315.
2，Naruszewicz M, Selinger E, Davignon J, et al. Oxidative modification of lipoprotein (a) and the effect of β-carotene. Metabolism，1992, 41: 1215-1224.
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4，Ross R, Bawen-Pope DF, Raines EW, et al. Platelet-derived growth factor and its role in health and disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，1990,327: 155-169.
5，Ultermann G. The mysteries of lipoprotein (a). Science，1989,246: 904-910.
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6，Grainger DJ, Kirschenlohr HL, Metcalfe JC, et al. Proliferation of human smooth muscle cells promoted by lipoprotein (a). Science， 1993, 260: 1655-1657.
7，Jurgen SG, Chen Q, Esterbauer H, et al. Immunostaining of human autopsy aortas with antibodies to modified apolipoprotein B and apolipoprotein(a). Arterioscler Thromb，1993, 13: 1689-1699.
8，Malden LT, Chalt A, Raines EW, et al. The influence of oxidatively modified low density lipoproteins on expression of platelet-derived growth factor by human monocyte-derived macrophages. J Biol Chem， 1991,266: 13901-13907.
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9，Gave J , Bengen J, Schollmeyer P, et al. Impairment of endothelium-dependent dilation in rabbit renal arteries by oxidized lipoprotein (a): role of oxygen derived radicals. Circulation，1995, 92: 1582-1589.
10，Galle J, Schneider R, Heinloth A, et al. Lp(a) and LDL induce apoptosis in human endothelial cells and in rabbit aorta: role of oxidative stress. Kidney Int，1999, 55:1450-1460., 百拇医药
赵水平 许丹焰
摘 要 目的 探讨氧化型脂蛋白(a)〔ox-Lp(a)〕对人脐静脉内皮细胞表达血小板衍生生长因子-B链(PDGF-B)的影响，以阐明其在动脉粥样硬化发生中的作用。 方法 在内皮细胞培养基中分别加入天然脂蛋白(a)〔n-Lp(a)〕与ox-Lp(a)及天然低密度脂蛋白(n-LDL)与氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，37℃温育。用细胞酶联免疫检测PDGF-B蛋白的表达，同时用荧光免疫方法证实PDGF-B蛋白表达，并用Northern杂交检测PDGF-B mRNA的表达。 结果 ox-Lp(a)增加内皮细胞PDGF-B蛋白表达呈剂量依赖性，并且5 nmol/L及20 nmol/L ox-Lp(a)分别使PDGF-B表达明显增加了(156±18)%及(219±42)%。同时用免疫荧光证实ox-Lp(a)促使PDGF-B表达增强。比较相同浓度的n-LDL、n-Lp(a)、ox-LDL、ox-Lp(a)4种脂蛋白的作用，显示ox-Lp(a)的作用最强，10 nmol/L的n-LDL、n-Lp(a)、ox-LDL、ox-Lp(a)分别使PDGF-B表达增加了(96±17)%、(138±19)%、(127±11)%、(248±41)%。Northern杂交检测结果显示，ox-Lp(a)能促使PDGF-B mRNA表达明显增加。 结论 ox-Lp(a)能诱导内皮细胞表达PDGF-B增强，这可能与Lp(a)致动脉粥样硬化作用机制有关。
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关键词：脂蛋白类；血小板源生长因子；动脉粥样硬化
血小板衍生生长因子(PDGF)主要促进动脉中膜收缩型平滑肌细胞(SMC)转化为分泌型SMC迁移到内膜进行增殖,同时分泌大量活性物质〔1〕。血小板衍生生长因子B链(PDGF-B)主要由巨噬细胞、内皮细胞产生。脂蛋白(a)〔Lp(a)〕已被证明是动脉粥样硬化的独立危险因素，其在动脉粥样硬化的发病过程中发挥了极重要的作用，但其作用机制尚不明确。已有研究发现Lp(a)在血管内膜下易被氧化〔2〕。本研究着重探讨氧化修饰后的Lp(a)〔ox-Lp(a)〕能否调节血管内皮细胞PDGF-B的表达及其特征。
材料与方法
一、人外周血Lp(a)与低密度脂蛋白(LDL)的分离和氧化
筛选血浆Lp(a)浓度大于900 mg/L的献血员，用不连续密度梯度离心法〔Backman L8-80M型超高速离心机，VAC 50 rotors(转头)〕从外周血中分离Lp(a)和LDL，采用Sepharose 6B层析柱纯化Lp(a)。蛋白含量用Bradford方法检测。加入终浓度为10 μmol/L的CuSO4 37℃温育24 h使Lp(a)和LDL氧化。在0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS)中透析24 h后测定丙二醛浓度作为硫巴比妥酸反应物质(TBARS)浓度。
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二、人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养与处理
HUVECs细胞系(ECV-30)购自美国典型物保藏中心。用10% FCS-DME培养基(美国Sigma公司产品)培养，第3～5代用于实验。96孔细胞培养皿中细胞生长至融合24 h后，换以无血清培养基继续培养12～24 h，分别加入：(1)终浓度为2.5、5、10、20 nmol/L的ox-Lp(a)，作用2 h；(2)终浓度为10 nmol/L的ox-Lp(a)，作用0.5、1、2、6、12 h；(3)终浓度为10 nmol/L的天然Lp(a)〔n-Lp(a)〕和ox-Lp(a)、天然LDL(n-LDL)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，作用2 h。加入不同浓度的PBS作为阴性对照组，不加任何刺激因素作为空白对照组。
三、PDGF-B蛋白表达的检测
采用细胞酶联免疫法，由Pigott等〔3〕的方法改进而来。培养皿弃液，固定、清洗、用小牛血清阻断2 h后加入兔抗人PDGF-B抗体(N-13，美国Gene公司产品)，37℃作用2 h，清洗4～6次后加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(美国Sigma公司产品)；37℃作用1 h，加入过氧化酶底物邻苯二胺，显色后加2 mol/L H2SO4以终止反应。用Bio-Rad 450酶标仪测量492 nm波长时的吸光度(A)值。将在不加任何处理因素的细胞培养孔中所测得的A值定义为100%，加入处理因素的各孔所测得的A值记录为增加的百分率。
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四、内皮细胞表面PDGF-B蛋白表达的检测
采用荧光免疫法。细胞接种于无菌盖玻片上，当细胞生长至亚融合状态时在培养基中加入ox-Lp(a)至终浓度为10 nmol/L,作用2 h后固定、清洗、加入兔抗人PDGF-B一抗(N-13)，37℃作用2 h后加入荧光素标记的羊抗兔-IgG，再清洗后加入抗荧光淬灭剂，荧光显微镜下观察、照相。
五、内皮细胞PDGF-B mRNA的检测
内皮细胞暴露于4种脂蛋白3～4 h后，用TRIZOL TM Reagent(美国GIBCO公司产品)提取细胞总RNA，取15～20 μg RNA在含甲醛的1%琼脂糖胶中电泳5 h，真空电转移至Hybood-N+尼龙膜上。与〔γ-32P〕dATP标记的PDGF-B寡核苷酸探针(美国CAL公司产品)杂交，洗膜后-70℃曝光1周。使用GAPDH探针重复杂交作为内对照。用医用图像处理系统检测X线片上的杂交信号。
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六、统计学处理
多组间均数比较采用方差分析，两组间均数比较采用t检验，对有相关趋势的变量进行直线相关分析。
结 果
一、脂质过氧化测定
见图1。n-Lp(a)和n-LDL的TBARS值分别为(6.96±1.10)和(5.06±3.95)nmol/mg protein；而ox-Lp(a)和ox-LDL的TBARS值分别为(48.75±2.90)和(38.25±3.95)nmol/mg protein,分别明显高于n-Lp(a)和n-LDL；并且ox-Lp(a)和ox-LDL的TBARS值差异有显著性。
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1 n-LDL; 2 n-Lp(a); 3 ox-LDL; 4 ox-Lp(a)
与n-LDL比较，*P<0.001;与n-Lp(a)比较，△P<0.001；与ox-LDL比较，＃P<0.05
图1 LDL与Lp(a)氧化的比较
二、不同浓度ox-Lp(a)对PDGF-B表达的影响
见表1。以空白对照的PDGF-B表达为100%，当不同浓度ox-Lp(a)与内皮细胞孵育2 h后,PDGF-B表达逐步增高，并与ox-Lp(a)呈剂量依赖性(r=0.957,b=6.05，P<0.05)。5.0 nmol/L ox-Lp(a)能使PDGF-B表达明显增强。而不同浓度的PBS不能使PDGF-B表达增加。荧光免疫实验亦证实，10 nmol/L ox-Lp(a)促使内皮细胞表面PDGF-B表达的作用较空白对照增强。
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表1 ox-Lp(a)浓度对内皮细胞表面PDGF-B表达
的影响(X±s,%)
ox-Lp(a)浓度
(nmol/L)
PDGF-B表达
PBS组
ox-Lp(a)组
0
100.00±?0.00
100.00±?0.00
2.5
, 百拇医药 93.32±11.13
110.26±14.96
5.0
113.49±12.67
156.10±18.02*△
10.0
112.80±14.01
185.35±28.08**△△
20.0
99.58±12.57
219.26±42.50**△△
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注：与空白对照〔ox-Lp(a)浓度为0〕比较，*P<0.05，**P<0.01；与PBS组比较，△P<0.05，△△P<0.01
三、孵育时间与ox-Lp(a)对内皮细胞PDGF-B表达的影响的关系
见表2。以空白对照的PDGF-B表达为100%，10 nmol/L ox-Lp(a)与内皮细胞作用仅0.5 h,PDGF-B表达即显著增加。PDGF-B表达于2 h达高峰,此后逐渐下降；12 h时PDGF-B表达与空白及阴性对照组无明显差异。但PBS与内皮细胞作用12 h不引起PDGF-B蛋白的显著变化。
表2 孵育时间与ox-Lp(a)对内皮细胞表面
PDGF-B表达的关系(X±s，%)
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时间(h)
PDGF-B表达
PBS组
ox-Lp(a)组
0.5
98.49±2.13
138.79±12.87**△△
1.0
114.84±7.20
142.96±10.04**△△
2.0
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107.89±7.20
146.94±13.03**△△
6.0
115.60±3.67
140.70±15.71*△
12.0
116.15±8.51
131.85±15.62
注：与空白对照(PDGF-B表达为100%)比较，*P<0.05，**P<0.01；与PBS组比较，△P<0.05，△△P<0.01
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四、4种脂蛋白对内皮细胞PDGF-B蛋白表达的影响
见图2。10 nmol/L n-LDL、n-Lp(a)、ox-LDL、ox-Lp(a)分别使PDGF-B表达增加了(96±17)%、(138±19)%、(127±11)%、(248±41)%。n-Lp(a)、ox-Lp(a)和ox-LDL均明显增加PDGF-B蛋白的表达,并且ox-Lp(a)促使PDGF-B蛋白表达的作用强于ox-LDL及n-Lp(a)，而n-LDL及PBS的作用却不明显。
五、各种脂蛋白对内皮细胞PDGF-B mRNA表达的影响
见图3。当内皮细胞暴露于n-LDL 3～4 h后,PDGF-B mRNA表达增加不明显,为对照组的1.13倍。当内皮细胞暴露于n-Lp(a)和ox-LDL 3～4 h后,PDGF-B mRNA表达下降。相反,当内皮细胞暴露于10、20 nmol/L ox-Lp(a) 3～4 h后,PDGF-B mRNA表达明显增加,分别为对照组的2.9倍及4.6倍。
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1 空白对照； 2 PBS； 3 n-LDL; 4 n-Lp(a); 5 ox-LDL; 6 ox-Lp(a)
与空白对照、PBS、n-LDL组分别比较,*P<0.05，**P<0.001；与n-Lp(a)比较,△P<0.05；与ox-LDL比较,##P<0.01
图2 4种脂蛋白对内皮细胞表面PDGF-B表达作用的比较
1 空白对照; 2 n-LDL； 3 ox-LDL； 4 n-Lp(a)； 5 ox-Lp(a)； 6 ox-Lp(a)(2、3、4、6浓度为10 nmol/L，5为20 nmol/L)
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图3 用PDGF-B和GAPDH探针进行Northern杂交检测结果
讨 论
动脉粥样硬化病变的发生、发展涉及许多慢性过程，包括多种参与动脉粥样硬化的细胞的粘附、移行、增殖和分化，而这些过程均由各种细胞因子和生长因子所调控。在所有的生长因子中，PDGF同时具有刺激细胞增殖、促使细胞粘附及强烈的缩血管作用，因此认为PDGF在动脉粥样硬化病变的发展过程中起着重要作用〔4〕。
血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖及向内膜移行是动脉粥样硬化病变和经皮冠状动脉成形术(PTCA)后再狭窄的主要病理表现。大量流行病学调查证明，血浆Lp(a)水平升高是动脉粥样硬化和PTCA后再狭窄的独立危险因素〔5〕，但Lp(a)引起这两种病变的机制不明。Grainger等〔6〕将n-Lp(a)直接作用于离体培养的VSMC，能刺激VSMC增殖。本研究观测到10 nmol/L的n-Lp(a)使内皮细胞上PDGF-B蛋白表达增强，结果与之相符。已知PDGF是一种强烈的刺激细胞增殖的蛋白，因此推测n-Lp(a)通过促使内皮细胞表达PDGF-B增多而作用于VSMC并使其异常增殖。
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已经证实脂蛋白在体内不仅以天然形式存在，也可以修饰的脂蛋白形式存在，其中以氧化修饰的脂蛋白的作用最为重要。体内的众多因素如血浆中的超氧阴离子、金属基团、血管内皮细胞均能使脂蛋白发生氧化修饰作用。LDL的氧化已被广泛研究。Lp(a)与LDL相比，在化学结构上十分类似，仅较LDL多含1个载脂蛋白(a)〔apo(a)〕。已逐渐认识到Lp(a)与LDL一样能被氧化，而且Lp(a)的氧化敏感性较LDL更高〔2〕。在实验动物动脉粥样硬化斑块中能检测到大量ox-Lp(a)的存在〔7〕，因此推测ox-Lp(a)更具有致动脉粥样硬化作用。我们首次报道了ox-Lp(a)在较低浓度(5 nmol/L)即能明显增加内皮细胞PDGF-B的表达，并且ox-Lp(a)致内皮细胞PDGF-B表达增加与其剂量呈依赖性。这些结果提示，ox-Lp(a)可能是通过调节PDGF-B的表达，而在动脉粥样硬化的发展及PTCA后再狭窄中起重要作用。
大量研究证实氧化修饰脂蛋白的生物活性明显大于天然的脂蛋白。本研究结果亦支持这一观点。本研究观察到，体外ox-LDL为10 nmol/L浓度时促使内皮细胞表达PDGF-B的作用较同样浓度的n-LDL的作用强，而且在相同浓度时，ox-Lp(a)促使内皮细胞表达PDGF-B的作用较n-Lp(a)更强。因为氧化后脂蛋白的结构和生物活性发生了明显的改变，并且脂蛋白的氧化伴随着大量高活性反应物质的生成〔2〕，因此氧化型脂蛋白能刺激内皮细胞分泌更多的细胞因子和生长因子。
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ox-LDL已被确认是一种具有强的致动脉粥样硬化作用的脂蛋白，其在动脉粥样斑块形成与发展中起决定性作用。但本研究发现，在同样浓度下，ox-Lp(a)促使内皮细胞PDGF-B表达的作用较ox-LDL强，此结果与进一步的Northern杂交检测结果一致。Northern杂交检测显示ox-LDL不能促使PDGF-B mRNA表达增加，这与Malden等〔8〕的结果相符，他们发现将ox-LDL与人类单核来源的巨噬细胞孵育24 h，能明显抑制巨噬细胞PDGF-B mRNA的表达。而更为重要的是，本研究观察到ox-Lp(a)能明显增加PDGF-B mRNA的表达。由此可以解释两种氧化型脂蛋白促PDGF-B表达作用存在差异的原因。在PDGF-B表达较多的区域，其平滑肌细胞增殖、炎性细胞粘附及血管收缩作用可能更剧烈，因此本实验的结果亦支持ox-Lp(a)较ox- LDL具有更强的致动脉粥样硬化作用的观点〔9，10〕。
基金项目：国家自然科学基金(39670318)、CMB基金
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作者单位：赵水平(410011 长沙市，湖南医科大学附属第二医院心内科)
许丹焰(410011 长沙市，湖南医科大学附属第二医院心内科)
参考文献
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10，Galle J, Schneider R, Heinloth A, et al. Lp(a) and LDL induce apoptosis in human endothelial cells and in rabbit aorta: role of oxidative stress. Kidney Int，1999, 55:1450-1460., 百拇医药