喹诺酮类药物诱导人型支原体耐药机理研究
喹诺酮类药物诱导人型支原体耐药机理研究
张冉 吴移谋 向斌 陈丽丽 邓仲良
摘 要 目的 探讨人型支原体(Mh)对喹诺酮类药物的耐药机理，指导合理使用抗生素。方法 以含氧氟沙星、左旋氧氟沙星、盐酸环丙沙星的培养基培养标准敏感株及临床敏感株Mh12代后，将其gyrA基因、parE基因扩增，分析其核苷酸序列。结果 3种药物诱导株均产生耐药及交叉耐药性，氧氟沙星、左旋氧氟沙星诱导Mh发生70位G→A的突变，导致426位的天冬氨酸转变为天冬酰胺；盐酸环丙沙星诱导Mh发生113位C→T的突变，导致83位的丝氨酸转变为亮氨酸。结论 Mh长期接触低浓度喹诺酮类药物会产生耐药性，gyrA、parE基因中的点突变可能是耐药机制的一部分。
, 百拇医药 关键词：人型支原体；喹诺酮类药物；gyrA基因；parE基因
人型支原体(mycoplasma hominis，Mh)是泌尿生殖道主要致病支原体之一，喹诺酮类药物是临床上治疗Mh感染的常用药物，其作用机制主要是通过抑制细菌或支原体的DNA旋转酶、拓扑异构酶Ⅳ活性而阻碍DNA的复制，在使用初期，疗效令人满意，但由于滥用抗生素及治疗不当等原因，Mh对喹诺酮类药物的耐药性问题日渐突出。本研究对标准敏感株和临床分离敏感株进行多次抑菌浓度药物体外诱导，观察其药物敏感性的变化，分析耐药性产生的机制。
材料和方法
一、材料
1.支原体株：Mh标准菌株PG21购自首都儿科研究所；敏感株于1998年从性病门诊非淋菌性尿道炎(NGU)患者中收集分离，采用肉汤稀释法筛选对喹诺酮敏感的Mh株，经菌落形态、底物分解、pH值、生长速度初步鉴定[1]液体传3代后，-70℃短期保存备用。试验菌液：Mh冷冻培养物，在室温下融化，用相应液体培养基1∶100稀释，37℃培养24～48 h后，108-10颜色变化单位(color changing unit，CCU)/∕0.1 ml作为接种物。
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2.抗菌药物：3种药物即氧氟沙星(ofloxacin，OFX)、左旋氧氟沙星(levofloxacin,LFX)、盐酸环丙沙星(ciprofloxacin,CFX)均为中国科学院上海药物研究所提供的粉剂。以上药物均用二甲基甲酰胺(DMF)与乙醇溶解后，用灭菌三蒸水配成1 024 mg/L的母液作为储备液，-20℃冰箱保存备用，使用时再用相应液体培养基稀释成所需的浓度。
3.培养基：按文献[1]报道方法配制。
4.试剂：TaqDNA聚合酶、Marker、dNTP和Tris等试剂均购自上海生物工程公司。
二、方法
1.药物敏感性试验：采用肉汤稀释法[2]。
2.诱导耐药试验：将Mh标准敏感株和临床敏感株分别接种到固体培养基中，经95%N2、5%CO2环境条件培养48～96 h后，在低倍镜下挑取单个菌落在液体培养基中增菌，测定MIC。将Mh标准敏感株和临床敏感株分别在含1/2MIC的OFX、LFX、CFX的液体培养基中传代，每隔1～2 d转种1次，12代后转无药物支原体固体培养基，挑单个菌落在支原体液体培养基中培养后测MIC，如药物诱导后MIC≥4倍诱导前MIC为耐药[3]。并设在不含药物的液体培养基中培养12代作对照。
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3.交叉耐药试验：将诱导后的耐药株在液体培养基中培养后测定对非诱导药物的MIC，并比较诱导前后MIC的比值。
4.稳定耐药试验：将诱导后的耐药株在无药物液体培养基中培养，每1～2 d转种1次，12代后测定MIC，以判断耐药的稳定性。
5.模板DNA提取：取诱导后菌株培养物200 μl，12 000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀物中加入50 μl标本裂解液，100℃煮沸10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液10 μl作为DNA模板。
6.PCR引物及反应条件：gyrA基因的上游引物5′-TATGGTATGAGTGAACTTGG-3′，下游引物5′-AATTAGGGAAACGTGATGGC-3′，parE基因的上游引物5′-CTTTCAGGAAAATTAACTCCT-3′，下游引物5′-ATCAGTGTCAGCATCTGTCAT-3′，由上海生物工程公司合成。反应体系成分为MgCl2 8 μl、引物各2 μl、缓冲液10 μl、底物1.5 μl、Taq酶0.75 μl、双蒸水65.75 μl、模板10 μl。扩增条件：92℃预变性10 min后进入循环，92℃60 s，57℃60 s，72℃120 s，40个循环后再72℃450 s，中止反应[4]。试验设空白对照组，取反应产物1 μl进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后观察结果并照相。-20℃保存产物。
, 百拇医药
7.序列测定：PCR扩增的目的片段经回收、纯化后，以PE公司产ABI-Prism377DNA自动测序仪(荧光耦联法)测定DNA序列。用下游引物进行单链测序反应，反应条件：96℃变性10 s，56℃退火5 s，60℃延伸4 min，25个循环后，测序仪进行核苷酸序列测定。
结果
1.敏感株经3种药物诱导前后，肉汤稀释法测定MIC值和交叉耐药结果见表1、2。
表1 3 种药物诱导前/后Mh标准敏感株的
MIC值(μg/ml)
诱导药物
OFX
LFX
, http://www.100md.com
CFX
OFX
1/16
0.5/8
2/8
LFX
1/16
0.5/8
2/8
CFX
1/32
0.5/32
2/32
, 百拇医药
表2 3 种药物诱导前/后Mh临床敏感株的
MIC值(μg/ml)
诱导药物
OFX
LFX
CFX
OFX
2/16
1/16
4/16
LFX
2/32
1/16
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4/16
CFX
2/64
1/64
4/128
2.所有人工诱导的菌株经12代无药物液体培养基培养后，对所有药物均未恢复敏感性。
3.gyrA基因突变检测：对标准敏感株诱导后的3株Mh进行gyrA基因的PCR扩增后，得到3个大小为350bp片段。将这3个片段进行测序后与标准株Mh的gyrA核苷酸序列进行比较发现：3种药物均诱导Mh发生PCR产物中168位T→A、183位C→T、261位T→C的突变，这3个位点的突变均为同义突变，它们编码的氨基酸没有改变；CFX还诱导Mh发生113位C→T的突变，导致gyrA核苷酸序列的编码位83的丝氨酸转变为亮氨酸。
, 百拇医药
4.parE基因突变检测：对标准敏感株诱导后的3株Mh进行parE基因的PCR扩增后，得到3个大小为297bp片段。将这3个片段进行测序后与标准株Mh的parE核苷酸序列进行比较发现：OFX、LFX诱导Mh发生70位G→A的突变，导致parE核苷酸序列的编码位426的天冬氨酸转变为天冬酰胺。
讨论
喹诺酮类药物是近十几年来发展极为迅速的化学合成药物，因其抗菌谱广，临床上广为使用，对于喹诺酮的耐药机制，国内外对某些细菌和支原体有一定研究，目前至少已提出3种机制：(1)DNA旋转酶的改变，该酶由GyrA和GyrB亚基组成；(2)拓扑异构酶Ⅳ的改变，该酶由ParC(GrlA)和ParE(GrlB)亚基组成；(3)细胞膜孔蛋白通道系统的改变，某些通道与药物的主动排出有关。
本研究以次抑菌浓度的OFX、LFX和CFX对Mh进行诱导后，标准敏感株和临床分离敏感株Mh均对这3种药物产生获得性稳定耐药及交叉耐药。本研究结果提示，耐药性的发展与抗生素的使用密切相关，在临床治疗Mh所致感染时，应足量使用该类药物，并使疗程尽可能短，避免低浓度药物与支原体长期接触，人为造成“抗生素压力”，使原来占优势的敏感株被抑制和杀灭，诱导或选择出的耐药菌株则繁衍成抗菌药物主要作用对象，从而造成治疗失败。
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DNA旋转酶是1种Ⅱ型拓扑异构酶，为1个四聚体，由2个A亚基和2个B亚基组成，分别由gyrA和gyrB基因编码。当喹诺酮抑制此酶活性时，将阻止DNA复制、修复、染色体分离、转录及其他功能，从而达到杀菌的目的。旋转酶基因突变引起的耐药，在大肠杆菌中研究较多，Cullen等报道了大肠埃希菌gyrA基因上至少10个点突变导致氨基酸被替代，其中残基67-106区域常常发生突变，因而被命名为喹诺酮药物耐药区(quinolone resistance-determing region，QRDR)。本研究将标准敏感株药物诱导后，进行gyrA基因的扩增、核苷酸序列分析，发现误义突变主要存在于113位的C→T，导致其编码的83位丝氨酸被亮氨酸替代，使全酶结构改变，这种改变产生耐药性可解释为：所引起的空间上的障碍阻止喹诺酮类药物进入喹诺酮作用区。
拓扑异构酶Ⅳ与DNA的复制也有关系，Breines[5]等的研究证实大肠埃希菌的parE基因存在QRDR。本研究将标准敏感株药物诱导后，进行parE基因的扩增、核苷酸序列分析，发现误义突变主要存在于70位的G→A，导致其编码的426位天冬氨酸被天冬酰胺取代。目前人们对ParE亚基与喹诺酮相互作用的研究还有待深入。
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本研究对指导临床合理用药，减少耐药性的发生，进一步研究Mh耐喹诺酮类药物的机理，建立简便药物筛选模式，寻找新的抗泌尿生殖道支原体有效的喹诺酮类药物具有实际意义。
志谢 本文测序部分承蒙湖南医科大学遗传学国家重点实验室帮助
(本文编辑：毛家都)
基金项目：湖南省教委资助项目(98B104)
作者单位：张冉(421001，湖南衡阳医学院病原检测教研室)
吴移谋(421001，湖南衡阳医学院病原检测教研室)
向斌(421001，湖南衡阳医学院病原检测教研室)
陈丽丽(421001，湖南衡阳医学院病原检测教研室)
, 百拇医药
邓仲良(421001，湖南衡阳医学院病原检测教研室)
参考文献
1，吴移谋，余敏君，欧阳著峰，等. 泌尿生殖道支原体感染的实验室诊断研究.中华医学检验杂志，1991，14:157-159.
2，吴移谋，尹卫国，余敏君，等. 3种抗菌药物体外抗五种支原体的活性研究. 中国现代医学杂志，1996，6:8-9.
3，Michea-Hamzehpour M,Kahr A,Pechere JC. In vitro stepwise selection of resistance to quinolones,β-lactams and amikacin in nosocomial Gram-negative bacilli. Infection,1994, Suppl 2:105.
, 百拇医药
4，Bebear CM,Bove JM,Bebear C,et al. Characterization of Mycoplasma hominis mutations involved in resistance to fluoroquinolones. Antimicrob Agents Chemother,1997,41:269-273.
5，Breines DM, Ouabdesselam S, Ng EY, et al. Quinolone resistance locus nfxD of Escherichia coli is a mutant allele of the parE gene encoding a subunit of topoisomerase Ⅳ. Antimicrob Agents Chemother,1997,41:175-179., 百拇医药
张冉 吴移谋 向斌 陈丽丽 邓仲良
摘 要 目的 探讨人型支原体(Mh)对喹诺酮类药物的耐药机理，指导合理使用抗生素。方法 以含氧氟沙星、左旋氧氟沙星、盐酸环丙沙星的培养基培养标准敏感株及临床敏感株Mh12代后，将其gyrA基因、parE基因扩增，分析其核苷酸序列。结果 3种药物诱导株均产生耐药及交叉耐药性，氧氟沙星、左旋氧氟沙星诱导Mh发生70位G→A的突变，导致426位的天冬氨酸转变为天冬酰胺；盐酸环丙沙星诱导Mh发生113位C→T的突变，导致83位的丝氨酸转变为亮氨酸。结论 Mh长期接触低浓度喹诺酮类药物会产生耐药性，gyrA、parE基因中的点突变可能是耐药机制的一部分。
, 百拇医药 关键词：人型支原体；喹诺酮类药物；gyrA基因；parE基因
人型支原体(mycoplasma hominis，Mh)是泌尿生殖道主要致病支原体之一，喹诺酮类药物是临床上治疗Mh感染的常用药物，其作用机制主要是通过抑制细菌或支原体的DNA旋转酶、拓扑异构酶Ⅳ活性而阻碍DNA的复制，在使用初期，疗效令人满意，但由于滥用抗生素及治疗不当等原因，Mh对喹诺酮类药物的耐药性问题日渐突出。本研究对标准敏感株和临床分离敏感株进行多次抑菌浓度药物体外诱导，观察其药物敏感性的变化，分析耐药性产生的机制。
材料和方法
一、材料
1.支原体株：Mh标准菌株PG21购自首都儿科研究所；敏感株于1998年从性病门诊非淋菌性尿道炎(NGU)患者中收集分离，采用肉汤稀释法筛选对喹诺酮敏感的Mh株，经菌落形态、底物分解、pH值、生长速度初步鉴定[1]液体传3代后，-70℃短期保存备用。试验菌液：Mh冷冻培养物，在室温下融化，用相应液体培养基1∶100稀释，37℃培养24～48 h后，108-10颜色变化单位(color changing unit，CCU)/∕0.1 ml作为接种物。
, http://www.100md.com
2.抗菌药物：3种药物即氧氟沙星(ofloxacin，OFX)、左旋氧氟沙星(levofloxacin,LFX)、盐酸环丙沙星(ciprofloxacin,CFX)均为中国科学院上海药物研究所提供的粉剂。以上药物均用二甲基甲酰胺(DMF)与乙醇溶解后，用灭菌三蒸水配成1 024 mg/L的母液作为储备液，-20℃冰箱保存备用，使用时再用相应液体培养基稀释成所需的浓度。
3.培养基：按文献[1]报道方法配制。
4.试剂：TaqDNA聚合酶、Marker、dNTP和Tris等试剂均购自上海生物工程公司。
二、方法
1.药物敏感性试验：采用肉汤稀释法[2]。
2.诱导耐药试验：将Mh标准敏感株和临床敏感株分别接种到固体培养基中，经95%N2、5%CO2环境条件培养48～96 h后，在低倍镜下挑取单个菌落在液体培养基中增菌，测定MIC。将Mh标准敏感株和临床敏感株分别在含1/2MIC的OFX、LFX、CFX的液体培养基中传代，每隔1～2 d转种1次，12代后转无药物支原体固体培养基，挑单个菌落在支原体液体培养基中培养后测MIC，如药物诱导后MIC≥4倍诱导前MIC为耐药[3]。并设在不含药物的液体培养基中培养12代作对照。
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3.交叉耐药试验：将诱导后的耐药株在液体培养基中培养后测定对非诱导药物的MIC，并比较诱导前后MIC的比值。
4.稳定耐药试验：将诱导后的耐药株在无药物液体培养基中培养，每1～2 d转种1次，12代后测定MIC，以判断耐药的稳定性。
5.模板DNA提取：取诱导后菌株培养物200 μl，12 000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀物中加入50 μl标本裂解液，100℃煮沸10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液10 μl作为DNA模板。
6.PCR引物及反应条件：gyrA基因的上游引物5′-TATGGTATGAGTGAACTTGG-3′，下游引物5′-AATTAGGGAAACGTGATGGC-3′，parE基因的上游引物5′-CTTTCAGGAAAATTAACTCCT-3′，下游引物5′-ATCAGTGTCAGCATCTGTCAT-3′，由上海生物工程公司合成。反应体系成分为MgCl2 8 μl、引物各2 μl、缓冲液10 μl、底物1.5 μl、Taq酶0.75 μl、双蒸水65.75 μl、模板10 μl。扩增条件：92℃预变性10 min后进入循环，92℃60 s，57℃60 s，72℃120 s，40个循环后再72℃450 s，中止反应[4]。试验设空白对照组，取反应产物1 μl进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后观察结果并照相。-20℃保存产物。
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7.序列测定：PCR扩增的目的片段经回收、纯化后，以PE公司产ABI-Prism377DNA自动测序仪(荧光耦联法)测定DNA序列。用下游引物进行单链测序反应，反应条件：96℃变性10 s，56℃退火5 s，60℃延伸4 min，25个循环后，测序仪进行核苷酸序列测定。
结果
1.敏感株经3种药物诱导前后，肉汤稀释法测定MIC值和交叉耐药结果见表1、2。
表1 3 种药物诱导前/后Mh标准敏感株的
MIC值(μg/ml)
诱导药物
OFX
LFX
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CFX
OFX
1/16
0.5/8
2/8
LFX
1/16
0.5/8
2/8
CFX
1/32
0.5/32
2/32
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表2 3 种药物诱导前/后Mh临床敏感株的
MIC值(μg/ml)
诱导药物
OFX
LFX
CFX
OFX
2/16
1/16
4/16
LFX
2/32
1/16
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4/16
CFX
2/64
1/64
4/128
2.所有人工诱导的菌株经12代无药物液体培养基培养后，对所有药物均未恢复敏感性。
3.gyrA基因突变检测：对标准敏感株诱导后的3株Mh进行gyrA基因的PCR扩增后，得到3个大小为350bp片段。将这3个片段进行测序后与标准株Mh的gyrA核苷酸序列进行比较发现：3种药物均诱导Mh发生PCR产物中168位T→A、183位C→T、261位T→C的突变，这3个位点的突变均为同义突变，它们编码的氨基酸没有改变；CFX还诱导Mh发生113位C→T的突变，导致gyrA核苷酸序列的编码位83的丝氨酸转变为亮氨酸。
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4.parE基因突变检测：对标准敏感株诱导后的3株Mh进行parE基因的PCR扩增后，得到3个大小为297bp片段。将这3个片段进行测序后与标准株Mh的parE核苷酸序列进行比较发现：OFX、LFX诱导Mh发生70位G→A的突变，导致parE核苷酸序列的编码位426的天冬氨酸转变为天冬酰胺。
讨论
喹诺酮类药物是近十几年来发展极为迅速的化学合成药物，因其抗菌谱广，临床上广为使用，对于喹诺酮的耐药机制，国内外对某些细菌和支原体有一定研究，目前至少已提出3种机制：(1)DNA旋转酶的改变，该酶由GyrA和GyrB亚基组成；(2)拓扑异构酶Ⅳ的改变，该酶由ParC(GrlA)和ParE(GrlB)亚基组成；(3)细胞膜孔蛋白通道系统的改变，某些通道与药物的主动排出有关。
本研究以次抑菌浓度的OFX、LFX和CFX对Mh进行诱导后，标准敏感株和临床分离敏感株Mh均对这3种药物产生获得性稳定耐药及交叉耐药。本研究结果提示，耐药性的发展与抗生素的使用密切相关，在临床治疗Mh所致感染时，应足量使用该类药物，并使疗程尽可能短，避免低浓度药物与支原体长期接触，人为造成“抗生素压力”，使原来占优势的敏感株被抑制和杀灭，诱导或选择出的耐药菌株则繁衍成抗菌药物主要作用对象，从而造成治疗失败。
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DNA旋转酶是1种Ⅱ型拓扑异构酶，为1个四聚体，由2个A亚基和2个B亚基组成，分别由gyrA和gyrB基因编码。当喹诺酮抑制此酶活性时，将阻止DNA复制、修复、染色体分离、转录及其他功能，从而达到杀菌的目的。旋转酶基因突变引起的耐药，在大肠杆菌中研究较多，Cullen等报道了大肠埃希菌gyrA基因上至少10个点突变导致氨基酸被替代，其中残基67-106区域常常发生突变，因而被命名为喹诺酮药物耐药区(quinolone resistance-determing region，QRDR)。本研究将标准敏感株药物诱导后，进行gyrA基因的扩增、核苷酸序列分析，发现误义突变主要存在于113位的C→T，导致其编码的83位丝氨酸被亮氨酸替代，使全酶结构改变，这种改变产生耐药性可解释为：所引起的空间上的障碍阻止喹诺酮类药物进入喹诺酮作用区。
拓扑异构酶Ⅳ与DNA的复制也有关系，Breines[5]等的研究证实大肠埃希菌的parE基因存在QRDR。本研究将标准敏感株药物诱导后，进行parE基因的扩增、核苷酸序列分析，发现误义突变主要存在于70位的G→A，导致其编码的426位天冬氨酸被天冬酰胺取代。目前人们对ParE亚基与喹诺酮相互作用的研究还有待深入。
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本研究对指导临床合理用药，减少耐药性的发生，进一步研究Mh耐喹诺酮类药物的机理，建立简便药物筛选模式，寻找新的抗泌尿生殖道支原体有效的喹诺酮类药物具有实际意义。
志谢 本文测序部分承蒙湖南医科大学遗传学国家重点实验室帮助
(本文编辑：毛家都)
基金项目：湖南省教委资助项目(98B104)
作者单位：张冉(421001，湖南衡阳医学院病原检测教研室)
吴移谋(421001，湖南衡阳医学院病原检测教研室)
向斌(421001，湖南衡阳医学院病原检测教研室)
陈丽丽(421001，湖南衡阳医学院病原检测教研室)
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邓仲良(421001，湖南衡阳医学院病原检测教研室)
参考文献
1，吴移谋，余敏君，欧阳著峰，等. 泌尿生殖道支原体感染的实验室诊断研究.中华医学检验杂志，1991，14:157-159.
2，吴移谋，尹卫国，余敏君，等. 3种抗菌药物体外抗五种支原体的活性研究. 中国现代医学杂志，1996，6:8-9.
3，Michea-Hamzehpour M,Kahr A,Pechere JC. In vitro stepwise selection of resistance to quinolones,β-lactams and amikacin in nosocomial Gram-negative bacilli. Infection,1994, Suppl 2:105.
, 百拇医药
4，Bebear CM,Bove JM,Bebear C,et al. Characterization of Mycoplasma hominis mutations involved in resistance to fluoroquinolones. Antimicrob Agents Chemother,1997,41:269-273.
5，Breines DM, Ouabdesselam S, Ng EY, et al. Quinolone resistance locus nfxD of Escherichia coli is a mutant allele of the parE gene encoding a subunit of topoisomerase Ⅳ. Antimicrob Agents Chemother,1997,41:175-179., 百拇医药