胃癌前病变不同转归中p53、bcl-2基因的表达以及细胞增殖活性的研究
胃癌前病变不同转归中p53、bcl-2基因的表达以及细胞增殖活性的研究
伍银桥 王孟薇 尤纬缔 祝庆孚
摘 要 目的 探讨p53、bcl-2基因和增殖细胞核抗原(PCNA)等生物学 指标在胃癌前病变不同转归中的作用。 方法 采用免疫组化(LSAB)法 检测52例胃癌患者胃癌及癌前病变组织标本及56例非胃癌患者癌前病变〔胃黏膜中度以上肠 上皮化生和(或)异型增生〕组织标本的p53、bcl-2和PCNA的表达。 结果 (1)在癌前病变中，p53、bcl-2在癌组与非癌组之间的表达差异无 显著性(P>0.05)，PCNA标记指数(PCNA LI)在癌组表达明显高于非癌组，差异有显著 性(P <0.01)；(2)p53、bcl-2和PCNA表达在胃癌组织均显著高于癌变前组织(P<0.01)； (3)在肠型胃癌 ，癌前p53、bcl-2阳性者到癌时仍全为阳性，无1例转阴；在弥漫型胃癌，癌前bcl-2 阳性者到癌时有1例转阴。 结论 在肠型胃癌发生发展过程中，p53、bcl-2蛋白表达起重要 作用，且发生癌变前细胞增殖活性已明显升高。
, 百拇医药
关键词：胃肿瘤；癌前状态；基因，p53；基因，bcl-2；增殖细胞核抗原
在胃癌的发生过程中，胃黏膜的肠上皮化生和异型增生是重要的癌前病变，但并非所有的肠上皮化生和异型增生均演变为癌。研究显示，肿瘤是一种基因异常变化的疾病，癌变过程的每一阶段都存在癌基因和抑癌基因的一系列变化〔1〕。为此，我们检测p53、bcl-2基因以及增殖细胞核抗原(PCNA)在发生和不发生癌变的肠上皮化生及异型增生标本中的表达，以探讨各指标在胃癌前病变不同转归中的作用。
资料与方法
一、材料
1.胃癌组标本:1984年1月至1996年6月间，经胃镜黏膜活检和(或)手术切除胃标本病理检查诊断为癌、资料完整的病例共52例，均为男性，年龄62～82岁，平均70.1岁。Lauren分型:肠型胃癌40例，弥漫型胃癌12例。将该组根据不同阶段再分为两个部分：(1)胃癌标本：即经胃镜黏膜活检或手术切除病理诊断为胃癌的标本；(2)癌前病变标本：在诊断胃癌之前，与癌发生部位相同的黏膜活检病理诊断为中度以上肠上皮化生(18例)或异型增生(34例)的标本。癌前病变时年龄为60～79岁(平均67.3岁)，随访时间为1年～11年5个月(平均为3年8个月)。
, 百拇医药
2.非癌组标本:所有标本均取自与胃癌组同期检查的患者，其间诊断为中度或中度以上肠上皮化生和(或)异型增生的病例共489例，进一步筛选出第一次诊断之后有连续随访结果、且随访时间在1年以上而未发生癌变、与胃癌组年龄相当的病例共56例作为非癌组，其中肠上皮化生36例，异型增生20例，均为男性，年龄为60～82岁(平均67.0岁)，随访时间为1年10个月至11年11个月(平均6年10个月)，明显长于胃癌组。
二、方法
p53、bcl-2蛋白表达及PCNA均采用免疫组化LSAB法检测。抗p53单克隆抗体(DO-1)和抗bcl-2单克隆抗体购于北京中山生物技术有限公司，PCNA单克隆抗体和LSAB试剂盒为DAKO公司(日本)产品。实验步骤按试剂盒说明书进行。阳性对照为已知阳性组织切片在同一条件下反应，阴性对照以正常兔血清代替第一抗体。
三、结果判断：
, 百拇医药
p53、bcl-2结果按如下方法进行评分:(1)阳性着色程度:无着色为0，浅着色为1，深着色为2；(2)阳性着色范围:无着色为0，着色小于1/3为1，着色大于1/3为2，弥漫性着色为3。然后将以上两项相加为最后结果:大于或等于3为阳性病例。 PCNA计数用PCNA标记指数(PCNA LI): LI=PCNA阳性细胞数/计数细胞总数×100%。
四、统计学处理
所得数据采用χ2检验、t检验。
结 果
一、胃癌癌变前后p53、bcl-2表达的比较
见表1，2。在肠型胃癌中，癌前p53、bcl-2阳性者到癌变时一直均为阳性，无1例转阴。在弥漫型胃癌，由癌前发展到癌时bcl-2有1例转为阴性。p53阳性着色位于细胞核，呈棕黄色颗粒状(图1)；bcl-2阳性着色位于细胞浆，呈棕黄色(图2)。各切片显色分布不均，以片状和局灶性为主，少数为弥漫性分布。
, 百拇医药
表1 52例胃癌癌变前后的p53表达的自身对照(例数)
癌前病变
例数
肠型胃癌
弥漫型胃癌
+
-
+
-
+
18
16
0
, http://www.100md.com
2
0
-
34
11
13
1
9
合计
52
27
13
3
9
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表2 52例胃癌癌变前后的bcl-2表达的自身对照(例数)
癌前病变
例数
肠型胃癌
弥漫型胃癌
+
-
+
-
+
23
20
0
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2
1
-
29
9
11
3
6
合计
52
29
11
5
7
, 百拇医药
图1 p53免疫组化阳性片 细胞核着色DAB显色 ×400
图2 bcl-2免疫组化阳性片，细胞浆着色DAB显色 ×400
图3 PCNA免疫组化阳性片 细胞核着色DAB显色 ×400
二、PCNA在胃癌癌变前后的变化
见表3。在肠型胃癌，PCNA LI在癌时较癌前明显增加(P<0.01)；而在弥漫型胃癌，虽然癌变时PCNA较癌前增高，但差异无显著性。PCNA阳性着色位于细胞核，呈棕黄色细颗粒状(图3)。
, http://www.100md.com
表3 52例胃癌癌变前后的PCNA LI的比较(X±s)
组 别
肠型胃癌
弥漫型胃癌
癌前病变
43.94±11.21
46.43±10.20
胃癌组织
54.03±11.59
49.23±12.75
前后差值
10.09±14.59
, http://www.100md.com
2.08±14.04
t值
3.975
0.690
三、p53、bcl-2及PCNA在癌组和非癌组中的表达
见表4。p53、bcl-2阳性率在胃癌组癌前病变与非癌组间差异无显著性，但在胃癌组织中p53、bcl-2阳性率显著高于癌前病变及非癌组。胃癌组癌前病变中PCNA LI高于非癌组，而低于胃癌组织，差异均有极显著性。表4 p53、bcl-2及PCNA在癌组和非癌组中的表达
组 别
例数
p53阳性
, http://www.100md.com
例数
bcl-2阳性
例数
PCNA LI
X±s
非癌组
56
16(28.5)
20(35.7)
34.06±11.63
胃癌组
癌前病变
52
, 百拇医药
18(34.6)
23(44.2)
45.60±10.87△
胃癌组织
52
30(57.7)
34(65.4)
52.96±11.90
注：括号内为百分构成比(%)； 与非癌组和胃癌癌前病变组比较，P<0.05；与非癌组及胃癌组织组比较，△P<0.01讨 论
, 百拇医药
p53基因是抑癌基因，可使细胞分裂停滞于G1期，并诱导细胞发生凋亡。对因DNA损伤而诱发的细胞凋亡来说，p53的表达必不可少〔2〕。而突变型p53不能制止细胞增殖并导向凋亡。野生型p53蛋白半衰期短，而突变后的p53蛋白半衰期明显延长，因而p53蛋白水平明显升高，通过免疫组化检测出的p53蛋白一般为突变型〔3〕。研究显示，p53基因异常不仅存在肿瘤中，也存在于胃癌前病变，尤其是异型增生〔4，5〕。我们的结果提示胃癌组织p53蛋白表达阳性率显著高于癌前病变；而在胃癌组与非癌组的癌前病变中，p53蛋白表达阳性率差异不显著。对52例患者癌变前后的自身对照发现，癌前病变p53阳性者18例到胃癌时仍全部为阳性，癌前病变p53阴性发展为胃癌时出现阳性者12例，主要为肠型胃癌；而没有1例癌前病变p53阳性者在胃癌时转阴。发展为弥漫型胃癌者在癌前阴性到癌时基本上仍为阴性(9/10)。提示从癌前病变到癌的整个发生发展过程中，p53基因的表达起着重要的作用,且直接相关，特别是在肠型胃癌的发展过程中，p53的作用尤其突出。而在弥漫型胃癌，p53的作用显得并不重要，可以持续为阴性。
, 百拇医药
bcl-2是在t(14，18)染色体易位断点处发现的一种癌基因，可抑制细胞凋亡，延长细胞的寿命〔6〕。bcl-2蛋白表达在胃黏膜上皮不典型增生中为81%，在慢性萎缩性胃炎伴肠化生中为65%，而罕见于正常胃黏膜〔7〕。本实验显示在胃癌组中胃癌组织bcl-2阳性率为65.4%，癌前病变组织为44.2%；非癌组癌前病变为35.7%。后两者差异无显著性。对癌变前后bcl-2表达的自身对照发现：在肠型胃癌，癌变前bcl-2阳性者发展为胃癌时仍持续阳性，没有1例转阴，而癌前阴性者癌变时有9例转阳性。提示bcl-2表达与从癌前病变到癌的发展过程直接相关。而在弥漫型胃癌，癌前病变bcl-2阳性者到胃癌时有1例转阴性，癌前病变阴性者发展到胃癌时仅有3例转为阳性，提示在弥漫型胃癌的发生发展过程中，与bcl-2基因关系不大。
PCNA是反映细胞增殖活性的重要生物学指标〔8〕。我们对胃癌组和非癌组癌前病变标本PCNA测定结果进行比较，发现前者PCNA LI显著高于后者。说明胃癌患者在不典型增生和肠化生阶段PCNA增殖活性已明显升高。在胃癌和癌前病变PCNA的自身对照中可以看出，发展为肠型胃癌者胃癌组织中的PCNA LI显著高于癌前病变组织；而发展为弥漫型胃癌者，在癌变前后差异不显著。
, 百拇医药
胃癌前病变的不同转归是一个多因素参与的过程。在本实验中，p53、bcl-2基因表达在其不同转归中差异无显著性，但发生癌变者其增殖活性明显高于尚未发生癌变者；在肠型胃癌，p53、bcl-2癌前阳性者到胃癌时仍全部阳性，与肠型胃癌恶变关系密切。通过监测这些指标有助于早期诊断胃癌。
作者单位：伍银桥(100853 北京市，解放军总医院南楼消化科)
王孟薇(100853 北京市，解放军总医院南楼消化科)
尤纬缔(100853 北京市，解放军总医院南楼消化科)
祝庆孚(100853 北京市，解放军总医院病理科)
参考文献
1，Tahara E. Genetic alterations in human gastrointestinal cancers. The application to molecular diagnosis.Cancer,1995,75:1410-1417.
, http://www.100md.com
2，Clarke AR, Purdie CA, Harrison DJ, et al. Thymocyte apoptosis induced by p53-de pendent and independent pathway. Nature,1993,362:849-852.
3，Sarkis AS, Dalbagni G, Gordon Cardo C, et al. Nuclear over-expression of p53 pr ot ein in transitional cell bladder carcinoma: a marker for disease progression. J Natl Cancer Inst, 1993,85:53-59.
4，Craanen ME, Blok P, Dekker W, et al. Chronology of p53 protein accumulation in g astric carcinogenesis. Gut,1995,36:848-852.
, http://www.100md.com
5，Joypaul BV, Newman EL, Hopwood D, et al. Expression of p53 protein in normal,dys p lastic, and malignant gastric mucosa: an immunohistochemical study.J Pathol,199 3,170:279-283.
6，Miyashita T, Krajewski S, Krajewska M, et al. Tumor suppressor p53 is a regulato r of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo. Oncogene,1994,9:1799-1 805.
7，Lauwers GY, Scott GV, Hendricks J, et al. Immunohistochemical evidence of aberra nt bcl-2 protein expression in gastric epithelial dysplasia. Cancer,1994,73:2900-2904.
8，Hall PA,Levison DA,Woods AL,et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) i mmunolocalization in paraffin sections: an index of cell proliferating with evid ence of deregulated expression in some neoplasms. J Pathol,1990,162:285-294., 百拇医药
伍银桥 王孟薇 尤纬缔 祝庆孚
摘 要 目的 探讨p53、bcl-2基因和增殖细胞核抗原(PCNA)等生物学 指标在胃癌前病变不同转归中的作用。 方法 采用免疫组化(LSAB)法 检测52例胃癌患者胃癌及癌前病变组织标本及56例非胃癌患者癌前病变〔胃黏膜中度以上肠 上皮化生和(或)异型增生〕组织标本的p53、bcl-2和PCNA的表达。 结果 (1)在癌前病变中，p53、bcl-2在癌组与非癌组之间的表达差异无 显著性(P>0.05)，PCNA标记指数(PCNA LI)在癌组表达明显高于非癌组，差异有显著 性(P <0.01)；(2)p53、bcl-2和PCNA表达在胃癌组织均显著高于癌变前组织(P<0.01)； (3)在肠型胃癌 ，癌前p53、bcl-2阳性者到癌时仍全为阳性，无1例转阴；在弥漫型胃癌，癌前bcl-2 阳性者到癌时有1例转阴。 结论 在肠型胃癌发生发展过程中，p53、bcl-2蛋白表达起重要 作用，且发生癌变前细胞增殖活性已明显升高。
, 百拇医药
关键词：胃肿瘤；癌前状态；基因，p53；基因，bcl-2；增殖细胞核抗原
在胃癌的发生过程中，胃黏膜的肠上皮化生和异型增生是重要的癌前病变，但并非所有的肠上皮化生和异型增生均演变为癌。研究显示，肿瘤是一种基因异常变化的疾病，癌变过程的每一阶段都存在癌基因和抑癌基因的一系列变化〔1〕。为此，我们检测p53、bcl-2基因以及增殖细胞核抗原(PCNA)在发生和不发生癌变的肠上皮化生及异型增生标本中的表达，以探讨各指标在胃癌前病变不同转归中的作用。
资料与方法
一、材料
1.胃癌组标本:1984年1月至1996年6月间，经胃镜黏膜活检和(或)手术切除胃标本病理检查诊断为癌、资料完整的病例共52例，均为男性，年龄62～82岁，平均70.1岁。Lauren分型:肠型胃癌40例，弥漫型胃癌12例。将该组根据不同阶段再分为两个部分：(1)胃癌标本：即经胃镜黏膜活检或手术切除病理诊断为胃癌的标本；(2)癌前病变标本：在诊断胃癌之前，与癌发生部位相同的黏膜活检病理诊断为中度以上肠上皮化生(18例)或异型增生(34例)的标本。癌前病变时年龄为60～79岁(平均67.3岁)，随访时间为1年～11年5个月(平均为3年8个月)。
, 百拇医药
2.非癌组标本:所有标本均取自与胃癌组同期检查的患者，其间诊断为中度或中度以上肠上皮化生和(或)异型增生的病例共489例，进一步筛选出第一次诊断之后有连续随访结果、且随访时间在1年以上而未发生癌变、与胃癌组年龄相当的病例共56例作为非癌组，其中肠上皮化生36例，异型增生20例，均为男性，年龄为60～82岁(平均67.0岁)，随访时间为1年10个月至11年11个月(平均6年10个月)，明显长于胃癌组。
二、方法
p53、bcl-2蛋白表达及PCNA均采用免疫组化LSAB法检测。抗p53单克隆抗体(DO-1)和抗bcl-2单克隆抗体购于北京中山生物技术有限公司，PCNA单克隆抗体和LSAB试剂盒为DAKO公司(日本)产品。实验步骤按试剂盒说明书进行。阳性对照为已知阳性组织切片在同一条件下反应，阴性对照以正常兔血清代替第一抗体。
三、结果判断：
, 百拇医药
p53、bcl-2结果按如下方法进行评分:(1)阳性着色程度:无着色为0，浅着色为1，深着色为2；(2)阳性着色范围:无着色为0，着色小于1/3为1，着色大于1/3为2，弥漫性着色为3。然后将以上两项相加为最后结果:大于或等于3为阳性病例。 PCNA计数用PCNA标记指数(PCNA LI): LI=PCNA阳性细胞数/计数细胞总数×100%。
四、统计学处理
所得数据采用χ2检验、t检验。
结 果
一、胃癌癌变前后p53、bcl-2表达的比较
见表1，2。在肠型胃癌中，癌前p53、bcl-2阳性者到癌变时一直均为阳性，无1例转阴。在弥漫型胃癌，由癌前发展到癌时bcl-2有1例转为阴性。p53阳性着色位于细胞核，呈棕黄色颗粒状(图1)；bcl-2阳性着色位于细胞浆，呈棕黄色(图2)。各切片显色分布不均，以片状和局灶性为主，少数为弥漫性分布。
, 百拇医药
表1 52例胃癌癌变前后的p53表达的自身对照(例数)
癌前病变
例数
肠型胃癌
弥漫型胃癌
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合计
52
27
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表2 52例胃癌癌变前后的bcl-2表达的自身对照(例数)
癌前病变
例数
肠型胃癌
弥漫型胃癌
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图1 p53免疫组化阳性片 细胞核着色DAB显色 ×400
图2 bcl-2免疫组化阳性片，细胞浆着色DAB显色 ×400
图3 PCNA免疫组化阳性片 细胞核着色DAB显色 ×400
二、PCNA在胃癌癌变前后的变化
见表3。在肠型胃癌，PCNA LI在癌时较癌前明显增加(P<0.01)；而在弥漫型胃癌，虽然癌变时PCNA较癌前增高，但差异无显著性。PCNA阳性着色位于细胞核，呈棕黄色细颗粒状(图3)。
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表3 52例胃癌癌变前后的PCNA LI的比较(X±s)
组 别
肠型胃癌
弥漫型胃癌
癌前病变
43.94±11.21
46.43±10.20
胃癌组织
54.03±11.59
49.23±12.75
前后差值
10.09±14.59
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2.08±14.04
t值
3.975
0.690
三、p53、bcl-2及PCNA在癌组和非癌组中的表达
见表4。p53、bcl-2阳性率在胃癌组癌前病变与非癌组间差异无显著性，但在胃癌组织中p53、bcl-2阳性率显著高于癌前病变及非癌组。胃癌组癌前病变中PCNA LI高于非癌组，而低于胃癌组织，差异均有极显著性。表4 p53、bcl-2及PCNA在癌组和非癌组中的表达
组 别
例数
p53阳性
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例数
bcl-2阳性
例数
PCNA LI
X±s
非癌组
56
16(28.5)
20(35.7)
34.06±11.63
胃癌组
癌前病变
52
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18(34.6)
23(44.2)
45.60±10.87△
胃癌组织
52
30(57.7)
34(65.4)
52.96±11.90
注：括号内为百分构成比(%)； 与非癌组和胃癌癌前病变组比较，P<0.05；与非癌组及胃癌组织组比较，△P<0.01讨 论
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p53基因是抑癌基因，可使细胞分裂停滞于G1期，并诱导细胞发生凋亡。对因DNA损伤而诱发的细胞凋亡来说，p53的表达必不可少〔2〕。而突变型p53不能制止细胞增殖并导向凋亡。野生型p53蛋白半衰期短，而突变后的p53蛋白半衰期明显延长，因而p53蛋白水平明显升高，通过免疫组化检测出的p53蛋白一般为突变型〔3〕。研究显示，p53基因异常不仅存在肿瘤中，也存在于胃癌前病变，尤其是异型增生〔4，5〕。我们的结果提示胃癌组织p53蛋白表达阳性率显著高于癌前病变；而在胃癌组与非癌组的癌前病变中，p53蛋白表达阳性率差异不显著。对52例患者癌变前后的自身对照发现，癌前病变p53阳性者18例到胃癌时仍全部为阳性，癌前病变p53阴性发展为胃癌时出现阳性者12例，主要为肠型胃癌；而没有1例癌前病变p53阳性者在胃癌时转阴。发展为弥漫型胃癌者在癌前阴性到癌时基本上仍为阴性(9/10)。提示从癌前病变到癌的整个发生发展过程中，p53基因的表达起着重要的作用,且直接相关，特别是在肠型胃癌的发展过程中，p53的作用尤其突出。而在弥漫型胃癌，p53的作用显得并不重要，可以持续为阴性。
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bcl-2是在t(14，18)染色体易位断点处发现的一种癌基因，可抑制细胞凋亡，延长细胞的寿命〔6〕。bcl-2蛋白表达在胃黏膜上皮不典型增生中为81%，在慢性萎缩性胃炎伴肠化生中为65%，而罕见于正常胃黏膜〔7〕。本实验显示在胃癌组中胃癌组织bcl-2阳性率为65.4%，癌前病变组织为44.2%；非癌组癌前病变为35.7%。后两者差异无显著性。对癌变前后bcl-2表达的自身对照发现：在肠型胃癌，癌变前bcl-2阳性者发展为胃癌时仍持续阳性，没有1例转阴，而癌前阴性者癌变时有9例转阳性。提示bcl-2表达与从癌前病变到癌的发展过程直接相关。而在弥漫型胃癌，癌前病变bcl-2阳性者到胃癌时有1例转阴性，癌前病变阴性者发展到胃癌时仅有3例转为阳性，提示在弥漫型胃癌的发生发展过程中，与bcl-2基因关系不大。
PCNA是反映细胞增殖活性的重要生物学指标〔8〕。我们对胃癌组和非癌组癌前病变标本PCNA测定结果进行比较，发现前者PCNA LI显著高于后者。说明胃癌患者在不典型增生和肠化生阶段PCNA增殖活性已明显升高。在胃癌和癌前病变PCNA的自身对照中可以看出，发展为肠型胃癌者胃癌组织中的PCNA LI显著高于癌前病变组织；而发展为弥漫型胃癌者，在癌变前后差异不显著。
, 百拇医药
胃癌前病变的不同转归是一个多因素参与的过程。在本实验中，p53、bcl-2基因表达在其不同转归中差异无显著性，但发生癌变者其增殖活性明显高于尚未发生癌变者；在肠型胃癌，p53、bcl-2癌前阳性者到胃癌时仍全部阳性，与肠型胃癌恶变关系密切。通过监测这些指标有助于早期诊断胃癌。
作者单位：伍银桥(100853 北京市，解放军总医院南楼消化科)
王孟薇(100853 北京市，解放军总医院南楼消化科)
尤纬缔(100853 北京市，解放军总医院南楼消化科)
祝庆孚(100853 北京市，解放军总医院病理科)
参考文献
1，Tahara E. Genetic alterations in human gastrointestinal cancers. The application to molecular diagnosis.Cancer,1995,75:1410-1417.
, http://www.100md.com
2，Clarke AR, Purdie CA, Harrison DJ, et al. Thymocyte apoptosis induced by p53-de pendent and independent pathway. Nature,1993,362:849-852.
3，Sarkis AS, Dalbagni G, Gordon Cardo C, et al. Nuclear over-expression of p53 pr ot ein in transitional cell bladder carcinoma: a marker for disease progression. J Natl Cancer Inst, 1993,85:53-59.
4，Craanen ME, Blok P, Dekker W, et al. Chronology of p53 protein accumulation in g astric carcinogenesis. Gut,1995,36:848-852.
, http://www.100md.com
5，Joypaul BV, Newman EL, Hopwood D, et al. Expression of p53 protein in normal,dys p lastic, and malignant gastric mucosa: an immunohistochemical study.J Pathol,199 3,170:279-283.
6，Miyashita T, Krajewski S, Krajewska M, et al. Tumor suppressor p53 is a regulato r of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo. Oncogene,1994,9:1799-1 805.
7，Lauwers GY, Scott GV, Hendricks J, et al. Immunohistochemical evidence of aberra nt bcl-2 protein expression in gastric epithelial dysplasia. Cancer,1994,73:2900-2904.
8，Hall PA,Levison DA,Woods AL,et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) i mmunolocalization in paraffin sections: an index of cell proliferating with evid ence of deregulated expression in some neoplasms. J Pathol,1990,162:285-294., 百拇医药