大鼠慢性支气管炎模型白细胞L-选择素mRNA的表达及皮质激素的影响
大鼠慢性支气管炎模型白细胞L-选择素mRNA的表达及皮质激素的影响
马楠 崔德健 沈倍奋 胡美茹
关键词：大鼠；慢性支气管炎；白细胞L-选择素；皮质激素
细胞粘附分子(CAMS)是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互粘附的糖蛋白。 选择素主要介导白细胞与血管内皮细胞的最初粘附及沿血管壁滚动的过程。本实验采用原位 杂交法[1]，检测大鼠慢性支气管炎(慢支)模型支气管肺泡灌洗液(BALF)白细 胞L-选择素的表达，及皮质激素对其表达的影响。
材料与方法 大鼠慢支模型的制备及分组：雄性SD大鼠28 只，体重(220±30) g ，随机分为：(1)慢支模型组(慢支组)：7只，采用气管内注入脂多糖(LPS，200 μg/200 μl,Sigma公司)法制作慢支模型[2]。(2)健康对照组(对照组)： 7只，不做任何 干预，为空白对照。(3)生理盐水处理组(生理盐水组)：7只，按慢支组方法制备动物 模型，从第22天起每天给予超声雾化吸入生理盐水，20 min/d，共7 d。(4)地塞米松处理 组 (地塞米松组)：按慢支组方法制备动物模型，自第22天起每天给予超声雾化吸入地塞米 松(0.2 mg/ml)，20 min/d，共7 d。对各组大鼠进行以下实验：(1)BALF细胞计数及 分类： 各组大鼠于第22、22、28、28天用1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，对左肺组织用10 ml Hanks液分2次灌洗，作白细胞计数分类。(2)肺组织肿瘤坏 死因子α(TNF-α)含量 测定：取右下叶肺组织100 mg，加PBS 1 ml(pH7.4)冰浴下匀浆30 s，离心15 min(4℃ ，10 000 g)，取上清液 -70℃保存，采用ELISA法测定TNF-α含量(Endogen公司试剂盒)。(3)细胞甩片的制作及原位杂交：将采集的BALF离心、洗涤，调整细胞浓度至105/ml，制备细胞片。细胞片用4%多 聚 甲醛固定，加蛋白酶K(E.Merck公司) 置37℃恒温箱10 min，洗涤、4%多聚甲醛后固定， 乙 醇梯度脱水，加入含1 μg/ml L-选择素探针(军事医学科学院基础医学研究所沈倍奋教授 惠 赠)的杂交液(50 μl/片，杂交液需煮沸变性5 min)，42℃杂交6～18 h，洗涤后3%牛血 清白蛋白BSA封闭 ，加链亲和素胶体金，室温40 min，洗涤、显影、伊红复染，明胶封片镜检。系统阳性对照 为 已知阳性细胞株，系统阴性对照为空白探针杂交液。应用真彩色医学图像分析系统对原位杂 交结果进行相对定量分析，表达强度以平均光密度表示。
, 百拇医药
表1 各组大鼠BALF白细胞L-选择素表达 、BALF白细胞计数和分类及肺组织TNF-α含量比较(X±s)
组别
鼠数
BALF 白细胞 #
L-选择素表达
(平均吸光度)
肺组织★
TNF-α含量
(pg/mg pro ☆)
BALF白细胞计
, 百拇医药
数▲(×105/ml)
BALF细胞分类
AM
N
L
M
对照组
7
0.077 0±0.002 1
176±14
1.42±0.20
0.610±0.040
, 百拇医药
0.061±0.009
0.155±0.029
0.154±0.017
慢支组
7
0.156 1±0.006 0*
271±23*
8.10 ±1.90*
0.387±0.037*
0.395±0.064*
, 百拇医药
0.069±0.021
0.047±0.022
生理盐水组
7
0.151 3±0.008 1*
235±28*
9.10± 1.30*
0.476±0.069*
0.374±0.058*
0.041±0.014
, 百拇医药
0.106±0.022
地塞米松组
7
0.117 2±0.007 0*△
217±22*
3 .10±0 .40△
0.672±0.019△
0.049±0.016△
0.064±0.011
0 .220±0.026
, 百拇医药
注：#方差 分析，F＝31.55,P=0.000 1；与对照组相比，*P<0.05, 与慢支组 和生理盐水组相比，△P<0.05；★方差分析，F＝4.60,P=0.0126；与 对照组相比，*P<0.05，☆pro指蛋白 ，▲方差分析，F＝10.07,P=0.0002；与对照组相比，*P<0.001；与慢 支组及生理盐水组相比，△P<0.001；AM：肺泡巨噬细胞，N：中性粒细胞，L：淋巴细胞，M：单核细胞 实验数据采用SAS统计软件包进行统计学分析，包括方差 分析/SNK检验、直线相关与回归分析。
结果 BALF白细胞L-选择素mRNA的表达强度、BALF白细胞计数及分 类、肺组织匀浆液TN F-α含量见表1；慢支组、生理盐水组BALF中白细胞总数、中性粒细胞数显著高于对照组 ，而肺泡巨噬细胞所占构成比相对下降(P<0.001)；地塞米松组BALF白细胞总数及中性粒细胞 数显著低于慢支组及生理盐水组(P<0.001)。慢支组BALF白细胞计数与L-选择素 mRNA表 达强度之间呈显著正相关(r=0.939,P<0.001)，肺组织TNF-α含量与BALF白细 胞L-选择素表达之间呈显著正相关(r=0.936,P<0.01)。
, 百拇医药
讨论 1990年Ley等[3]将一组结构、功能相似，其分子N 末端具有117-120个氨基酸 且与C型凝集素同源(凝集素区)的家族称为选择素。选择素家族有3个成员：E-选择素，P -选择素和L-选择素，其中L-选择素仅在白细胞表面表达。Riise等[4]表明慢 性阻塞性肺疾 病(COPD)的患者肺血管内皮E-选择素、ICAM-1的表达升高。但关于L-选择素在COPD气 道炎症中的作用目前很少报道。
本实验结果显示，慢支组、生理盐水组BALF白细胞L-选择素mRNA表达强度显著高于 对照组，且与慢支组BALF白细胞计数呈显著正相关。表明气道内炎细胞聚集与白细胞表面 L-选择素的表达上调有关。循环血中的白细胞从血管内游出，至炎症部位聚集，首先是白 细 胞上的L-选择素与内皮细胞表面的E-选择素、P-选择素结合，使白细胞沿血 管内皮滚动，然 后通过粘附分子(CD11/CD18)与内皮细胞上的ICAM相互作用，介导白细胞与 内皮细胞的牢 固粘附并从血管内游出，最终在细胞因子和炎症介质的趋化、活化作用下，白细胞在炎症部 位聚集激活。由此可见，选择素介导的白细胞与内皮细胞的最初粘附是炎症反应的关键启动 步骤。我们的实验结果也表明L-选择素的表达上调，在慢支气道炎症的发生过程 中 具有重要作用。此外，本实验还显示，雾化吸入地塞米松后，慢支大鼠模型BALF白 细胞L-选择素表达显著弱于慢支组，但仍高于对照组，白细胞总数及中性粒细胞数也显 著 下降。提示糖皮质激素可以下调白细胞表面L-选择素的表达，从而抑制白细胞与内皮细胞 的 粘附及游出，使气道内聚集的白细胞数下降，减轻气道炎症。慢支组肺组织匀浆液TNF- α 的含量显著增高，并与BALF白细胞L-选择素的表达呈显著正相关，雾吸地塞米松后肺组织T NF-α含量无明显改变。表明TNF-α可能通过刺激白细胞上L-选择素的表达上调，促进白 细 胞与内皮细胞的粘附，而皮质激素不能降低TNF-α的生成，与Keatings等[5]报 道COPD患者吸入皮质激素不能降低痰中TNF-α含量的结果相符。因此推测皮质激素 不能完 全 抑制L-选择素的表达及白细胞在气道腔内的聚集，故雾化吸入皮质激素可能在一定程度上 减 轻慢支气道炎症，但不能完全阻断炎症反应。这可能是慢支对皮质激素的 反应与支气管哮喘不同之处。
, http://www.100md.com
作者单位: 马楠(100037 北京，解放军304医院呼吸科)
崔德健(100037 北京，解放军304医院呼吸科)
沈倍奋(军事医学科学院)
胡美茹(军事医学科学院)
参考文献
1，苏慧慈. 原位杂交. 北京：中国科学技术出版社，1994.115-150.
2，马楠,崔德健,梁延杰,等.气管内注入脂多糖法建立大鼠慢性支气管炎模 型.中华结核和呼吸杂志，1999，22：317.
3，Ley K, Gaehtgens P, Fennie C, et al. Lectin-like cell adhesio n molecule 1 m ediates leukocyte rolling in mesenteric venules in vivo.Blood, 1991, 77:2553-2 555.
, 百拇医药
4，Riise GC, Larsson S, Andersson BA, et al. Circulating cell adh esion molecules in bronchial lavage and serum in COPD patients with chronic bronchitis.Eur Res pir J, 1994, 7:1673-1677.
5，Keatings VM, Collins PD, Bernes PJ, et al. Differences in inte rleukin-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with ch ronic obstructiv e pulmonary disease or asthma.Am J Respir Crit Care Med, 1996, 153:530-534., http://www.100md.com
马楠 崔德健 沈倍奋 胡美茹
关键词：大鼠；慢性支气管炎；白细胞L-选择素；皮质激素
细胞粘附分子(CAMS)是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互粘附的糖蛋白。 选择素主要介导白细胞与血管内皮细胞的最初粘附及沿血管壁滚动的过程。本实验采用原位 杂交法[1]，检测大鼠慢性支气管炎(慢支)模型支气管肺泡灌洗液(BALF)白细 胞L-选择素的表达，及皮质激素对其表达的影响。
材料与方法 大鼠慢支模型的制备及分组：雄性SD大鼠28 只，体重(220±30) g ，随机分为：(1)慢支模型组(慢支组)：7只，采用气管内注入脂多糖(LPS，200 μg/200 μl,Sigma公司)法制作慢支模型[2]。(2)健康对照组(对照组)： 7只，不做任何 干预，为空白对照。(3)生理盐水处理组(生理盐水组)：7只，按慢支组方法制备动物 模型，从第22天起每天给予超声雾化吸入生理盐水，20 min/d，共7 d。(4)地塞米松处理 组 (地塞米松组)：按慢支组方法制备动物模型，自第22天起每天给予超声雾化吸入地塞米 松(0.2 mg/ml)，20 min/d，共7 d。对各组大鼠进行以下实验：(1)BALF细胞计数及 分类： 各组大鼠于第22、22、28、28天用1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，对左肺组织用10 ml Hanks液分2次灌洗，作白细胞计数分类。(2)肺组织肿瘤坏 死因子α(TNF-α)含量 测定：取右下叶肺组织100 mg，加PBS 1 ml(pH7.4)冰浴下匀浆30 s，离心15 min(4℃ ，10 000 g)，取上清液 -70℃保存，采用ELISA法测定TNF-α含量(Endogen公司试剂盒)。(3)细胞甩片的制作及原位杂交：将采集的BALF离心、洗涤，调整细胞浓度至105/ml，制备细胞片。细胞片用4%多 聚 甲醛固定，加蛋白酶K(E.Merck公司) 置37℃恒温箱10 min，洗涤、4%多聚甲醛后固定， 乙 醇梯度脱水，加入含1 μg/ml L-选择素探针(军事医学科学院基础医学研究所沈倍奋教授 惠 赠)的杂交液(50 μl/片，杂交液需煮沸变性5 min)，42℃杂交6～18 h，洗涤后3%牛血 清白蛋白BSA封闭 ，加链亲和素胶体金，室温40 min，洗涤、显影、伊红复染，明胶封片镜检。系统阳性对照 为 已知阳性细胞株，系统阴性对照为空白探针杂交液。应用真彩色医学图像分析系统对原位杂 交结果进行相对定量分析，表达强度以平均光密度表示。
, 百拇医药
表1 各组大鼠BALF白细胞L-选择素表达 、BALF白细胞计数和分类及肺组织TNF-α含量比较(X±s)
组别
鼠数
BALF 白细胞 #
L-选择素表达
(平均吸光度)
肺组织★
TNF-α含量
(pg/mg pro ☆)
BALF白细胞计
, 百拇医药
数▲(×105/ml)
BALF细胞分类
AM
N
L
M
对照组
7
0.077 0±0.002 1
176±14
1.42±0.20
0.610±0.040
, 百拇医药
0.061±0.009
0.155±0.029
0.154±0.017
慢支组
7
0.156 1±0.006 0*
271±23*
8.10 ±1.90*
0.387±0.037*
0.395±0.064*
, 百拇医药
0.069±0.021
0.047±0.022
生理盐水组
7
0.151 3±0.008 1*
235±28*
9.10± 1.30*
0.476±0.069*
0.374±0.058*
0.041±0.014
, 百拇医药
0.106±0.022
地塞米松组
7
0.117 2±0.007 0*△
217±22*
3 .10±0 .40△
0.672±0.019△
0.049±0.016△
0.064±0.011
0 .220±0.026
, 百拇医药
注：#方差 分析，F＝31.55,P=0.000 1；与对照组相比，*P<0.05, 与慢支组 和生理盐水组相比，△P<0.05；★方差分析，F＝4.60,P=0.0126；与 对照组相比，*P<0.05，☆pro指蛋白 ，▲方差分析，F＝10.07,P=0.0002；与对照组相比，*P<0.001；与慢 支组及生理盐水组相比，△P<0.001；AM：肺泡巨噬细胞，N：中性粒细胞，L：淋巴细胞，M：单核细胞 实验数据采用SAS统计软件包进行统计学分析，包括方差 分析/SNK检验、直线相关与回归分析。
结果 BALF白细胞L-选择素mRNA的表达强度、BALF白细胞计数及分 类、肺组织匀浆液TN F-α含量见表1；慢支组、生理盐水组BALF中白细胞总数、中性粒细胞数显著高于对照组 ，而肺泡巨噬细胞所占构成比相对下降(P<0.001)；地塞米松组BALF白细胞总数及中性粒细胞 数显著低于慢支组及生理盐水组(P<0.001)。慢支组BALF白细胞计数与L-选择素 mRNA表 达强度之间呈显著正相关(r=0.939,P<0.001)，肺组织TNF-α含量与BALF白细 胞L-选择素表达之间呈显著正相关(r=0.936,P<0.01)。
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讨论 1990年Ley等[3]将一组结构、功能相似，其分子N 末端具有117-120个氨基酸 且与C型凝集素同源(凝集素区)的家族称为选择素。选择素家族有3个成员：E-选择素，P -选择素和L-选择素，其中L-选择素仅在白细胞表面表达。Riise等[4]表明慢 性阻塞性肺疾 病(COPD)的患者肺血管内皮E-选择素、ICAM-1的表达升高。但关于L-选择素在COPD气 道炎症中的作用目前很少报道。
本实验结果显示，慢支组、生理盐水组BALF白细胞L-选择素mRNA表达强度显著高于 对照组，且与慢支组BALF白细胞计数呈显著正相关。表明气道内炎细胞聚集与白细胞表面 L-选择素的表达上调有关。循环血中的白细胞从血管内游出，至炎症部位聚集，首先是白 细 胞上的L-选择素与内皮细胞表面的E-选择素、P-选择素结合，使白细胞沿血 管内皮滚动，然 后通过粘附分子(CD11/CD18)与内皮细胞上的ICAM相互作用，介导白细胞与 内皮细胞的牢 固粘附并从血管内游出，最终在细胞因子和炎症介质的趋化、活化作用下，白细胞在炎症部 位聚集激活。由此可见，选择素介导的白细胞与内皮细胞的最初粘附是炎症反应的关键启动 步骤。我们的实验结果也表明L-选择素的表达上调，在慢支气道炎症的发生过程 中 具有重要作用。此外，本实验还显示，雾化吸入地塞米松后，慢支大鼠模型BALF白 细胞L-选择素表达显著弱于慢支组，但仍高于对照组，白细胞总数及中性粒细胞数也显 著 下降。提示糖皮质激素可以下调白细胞表面L-选择素的表达，从而抑制白细胞与内皮细胞 的 粘附及游出，使气道内聚集的白细胞数下降，减轻气道炎症。慢支组肺组织匀浆液TNF- α 的含量显著增高，并与BALF白细胞L-选择素的表达呈显著正相关，雾吸地塞米松后肺组织T NF-α含量无明显改变。表明TNF-α可能通过刺激白细胞上L-选择素的表达上调，促进白 细 胞与内皮细胞的粘附，而皮质激素不能降低TNF-α的生成，与Keatings等[5]报 道COPD患者吸入皮质激素不能降低痰中TNF-α含量的结果相符。因此推测皮质激素 不能完 全 抑制L-选择素的表达及白细胞在气道腔内的聚集，故雾化吸入皮质激素可能在一定程度上 减 轻慢支气道炎症，但不能完全阻断炎症反应。这可能是慢支对皮质激素的 反应与支气管哮喘不同之处。
, http://www.100md.com
作者单位: 马楠(100037 北京，解放军304医院呼吸科)
崔德健(100037 北京，解放军304医院呼吸科)
沈倍奋(军事医学科学院)
胡美茹(军事医学科学院)
参考文献
1，苏慧慈. 原位杂交. 北京：中国科学技术出版社，1994.115-150.
2，马楠,崔德健,梁延杰,等.气管内注入脂多糖法建立大鼠慢性支气管炎模 型.中华结核和呼吸杂志，1999，22：317.
3，Ley K, Gaehtgens P, Fennie C, et al. Lectin-like cell adhesio n molecule 1 m ediates leukocyte rolling in mesenteric venules in vivo.Blood, 1991, 77:2553-2 555.
, 百拇医药
4，Riise GC, Larsson S, Andersson BA, et al. Circulating cell adh esion molecules in bronchial lavage and serum in COPD patients with chronic bronchitis.Eur Res pir J, 1994, 7:1673-1677.
5，Keatings VM, Collins PD, Bernes PJ, et al. Differences in inte rleukin-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with ch ronic obstructiv e pulmonary disease or asthma.Am J Respir Crit Care Med, 1996, 153:530-534., http://www.100md.com