去松果体对β-淀粉样蛋白神经毒性的影响
去松果体对β-淀粉样蛋白神经毒性的影响
徐斌 陈俊抛 林煜 张泓 高曲文 杨卫红
摘 要 目的 探讨松果体功能减退致褪黑素(MT)分泌减少对β-淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性的影响及其初步机制。 方法 将SD 6周大鼠随机分为2组，实验组摘除松果体，对照组给假手术，2组均在术后40 d给予Aβ1-40 10 μg右侧海马注射,7 d后标本用Nissl、HE、改进甲醇刚果红染色，TUNEL原位标记方法检测海马神经元病理变化。 结果 以图像分析仪测量Nissl染色神经细胞带丢失情况，发现实验组丢失长度〔(694.63±81.09)μm〕明显多于对照组〔(406.57±92.38)μm,P<0.01〕；细胞凋亡数在HE染色(16.37±5.30)个和TUNEL法(38.92±8.81)个均比对照组相应显色方法增多〔分别为(7.29±2.50)个、(20.63±5.28)个，均为P<0.01〕；Aβ1-40注射周围的胶质细胞浸润数(276.37±36.33)个也明显多于对照组〔(187.93±21.81)个，P<0.01〕。 结论 大鼠松果体摘除可以加重Aβ神经毒性作用，其机制可能是加重了炎症反应。
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关键词：松果体；褪黑激素；淀粉样β蛋白；神经变性
目前，关于阿尔茨海默病(AD)的病因和发病机制仍不清，但多数学者认为家族遗传及各种环境因素的交织构成AD发病的复杂病因谱，β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积可能是所有因素导致AD发病的共同途径。1995年Maurizi〔1〕提出褪黑素(MT)减少是引起AD的病因，其理由为：(1)AD患者中MT明显减少；(2)MT可以显著清除羟自由基；(3)AD患者脑细胞中线粒体DNA损伤与羟自由基损害作用一致。Pappolla等〔2〕通过神经母细胞瘤细胞(N2a)、嗜铬细胞瘤细胞(P12)培养，发现MT可以抑制Aβ诱导细胞凋亡。我们也发现MT于在体水平可以抑制Aβ诱导海马细胞凋亡及其神经毒性作用〔3〕。但目前尚无MT减少与Aβ神经毒性关系的报道，我们于1999年1～9月通过摘除大鼠松果体制成MT缺失模型，然后给海马微量注射Aβ1-40，观察Aβ神经毒性变化情况，初步探讨MT减少和Aβ神经毒性的关系。
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材料与方法
一、药品及试剂
Aβ1-40购自美国Sigma公司，注射前用无菌生理盐水将Aβ1-40稀释成10 μg/μl，37℃下孵育1周备用。TUNEL原位标记试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。
二、实验动物及MT缺失模型的制备
雄性SD大鼠16只，由第一军医大学实验动物中心提供，体重190～210 g，鼠龄6周，随机分为2组，实验组和对照组各8只，置隔音环境中，室温18～22℃，11 h光照(8∶30～19∶30)，13 h黑暗(19∶30～8∶30)，自由摄食、饮水，适应3 d后行手术。实验组行松果体摘除术，参考文献〔4〕方法进行，对照组行假手术，手术均在19∶30～22∶30进行，每次手术做实验组和对照组大鼠各1只，术后单独饲养，7 d后实验组和对照组大鼠分别放一起。继续饲养33 d后，实验组和对照组均给予Aβ1-40右侧海马注射。首先用10%水合氯醛腹腔注射(0.4 ml/100 g体重)麻醉大鼠，头部固定在立体定向仪上，剪毛消毒，在头背中部纵向切口，暴露颅骨，参照《大鼠脑立体定位图谱》〔5〕，选右侧海马为注射区，定位坐标：前囟后3.0 mm，右侧旁开2.2 mm，硬膜下2.9 mm。在坐标点周围用牙科钻环行钻开颅骨并分离暴露硬脑膜，缓慢垂直进针，注射Aβ1-40溶液1 μl(10 μg)，注射时间5 min，留针5 min，然后缓慢撤针。
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三、组织切片制备
Aβ1-40注射后7 d，将大鼠再次麻醉(10%水合氯醛0.6 ml/100 g体重腹腔注射)，暴露心脏，通过左心室插管至主动脉，生理盐水100～150 ml冲洗，10%中性缓冲甲醛溶液150 ml快速灌注，250 ml慢滴，2 h后取脑，检查实验组松果体摘除是否完全，淘汰松果体去除不完全者，对松果体摘除完全者以及对照组取标本(标本选在注射部前后1.5 mm处，标本厚3 mm)，后固定3 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，切片厚度6 μm，脑组织出现损伤时取片，每隔30张(间隔距离180 μm)取4张平片，直到损伤消失。一套用做甲苯胺蓝Nissl染色,一套HE染色,另抽数张切片做改进甲醇刚果红染色，最后一套用于TUNEL原位标记法。
四、组化及TUNEL法标记DNA片段
Nissl染色用于观察海马神经元丢失情况，HE染色用于观察注射周围胶质细胞反应及神经元凋亡。改进甲醇刚果红染色用于观察Aβ沉积及Aβ周围胶质细胞浸润情况，对周围神经元损伤也可显示。其操作如下：(1)石蜡切片，常规二甲苯、乙醇下行脱蜡至水；(2)Harris苏木素染色5 min,自来水冲洗数分钟；(3)1%盐酸酒精分化数秒，温水显蓝；(4)甲醇刚果红染色15 min，自来水冲洗数分钟；(5)0.2%碱性酒精液分化数秒，自来水冲洗；(6)常规脱水、透明、封片。TUNEL原位标记DNA片段检测凋亡细胞，操作步骤按试剂盒说明书进行。
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五、海马神经元病理改变的观察
神经元变性体积计算参照Morimoto等〔6〕的方法。在Leica Diaplan显微镜及Leica Quantimet 500+图像分析仪上，测量Nissl染色组织切片海马CA1～4以及齿状回神经元细胞带变性、坏死、细胞丢失的程度。由于海马细胞带的宽度是一定的，海马神经元变性、坏死、细胞丢失的体积V=∫∑ayidx，yi(μm)：海马CA1～4以及齿状回神经细胞带病理改变的长度；a(μm)：海马细胞带的宽度；dx(μm)：组织切片间隔距离，即180 μm。由于a、dx是恒定的，V只与yi有关，所以我们仅以神经元损害的长度作指标来反映海马神经元损害程度。炎症改变情况以40倍物镜下HE染色组织切片上Aβ1-40沉积部周围浸润胶质细胞数(每张切片选择3个相近视野，取平均值)反映炎症变化情况。凋亡细胞计数可在HE染色或在TUNEL原位标记法上进行，方法同胶质细胞计数，部位选在海马神经元病理改变明显处。
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六、统计方法
组间均数比较用SPSS 8.0 for windows进行非配对t检验。
结 果
一、海马神经元变性、坏死、丢失情况
正常海马细胞由神经细胞和胶质细胞组成，主要的神经细胞规则地排列，使海马结构非常清楚，如CA1～3锥体细胞和齿状回颗粒细胞。假手术组Aβ1-40注射7 d后，海马神经元病理改变仅限于CA1注射针道和齿状回Aβ1-40沉积局部的神经元，表现为锥体细胞带和颗粒细胞带紊乱、变稀、中断，高倍镜下见到神经元胞膜破裂、细胞萎缩、胞核变小(图1)，但距齿状回较远处很少有或仅有很轻病理改变。松果体摘除组Aβ1-40注射，不仅CA1注射针道和Aβ1-40沉积局部有较明显形态学改变，而且距Aβ1-40沉积较远处神经元也有病理改变，表现为CA1注射针道明显增宽，锥体细胞带和颗粒细胞带病变更明显，可见很长齿状回颗粒细胞带消失(图2)，齿状回背、腹部颗粒细胞带均受累。松果体摘除组CA1～4和齿状回神经细胞带损害长度〔(694.63±81.09)μm〕比对照组〔(406.57±92.38)μm〕明显增加(P<0.01)。
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图1 对照组大鼠Aβ沉积局部齿状回背侧细胞带的颗粒神经元受损，较远的细胞带无变化 Nissl染色 ×33
图2 实验组大鼠齿状回背侧及腹侧细胞带的神经元受损，较远的细胞带也受到影响 Nissl染色 ×33
图3 对照组大鼠Aβ沉积局部有胶质细胞浸润 HE ×165
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图4 实验组大鼠Aβ沉积局部则有大量胶质细胞浸润，较对照组大鼠明显 HE ×165
二、胶质细胞浸润情况
HE染色观察正常小胶质细胞，细胞小，胞核也较小，呈圆形、椭圆形或长方形，核仁染色明显，胞体可伸出数个纤细突起；星形胶质细胞比小胶质细胞大，但比海马神经元小，胞核呈圆形、椭圆形，核仁染色淡，与神经元区别主要是Nissl染色时星形胶质细胞不显色。实验组Aβ1-40沉积局部有弥漫性胶质细胞浸润，胶质细胞数(276.37±36.33)个，较远处也能见胶质细胞聚集。对照组Aβ1-40沉积局部也有胶质细胞浸润，胶质细胞数(187.93±21.81)个，但没有实验组明显，较远处无胶质细胞聚集，两组比较P<0.01。见图3、4。
三、海马神经元凋亡情况
HE染色凋亡细胞表现为细胞极度萎缩，胞核固缩、碎裂，胞浆嗜酸性改变，染成红色，可有凋亡小体形成，见图5、6。TUNEL法染色显示凋亡细胞核呈棕黄色，典型凋亡细胞为指环样结构，由于细胞凋亡时细胞核的DNA可渗透到胞浆，所以部分凋亡细胞胞浆也着色，见图7、8。实验组海马凋亡细胞数在HE染色、TUNEL法均比对照组明显增多(均为P<0.01)，表明细胞凋亡参与海马神经元丢失，松果体摘除加重上述现象,见表1。
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表1 HE染色和TUNEL原位标记法海马神经元
凋亡数比较(个，X±s)
组别
大鼠数
(只)
HE染色
TUNEL法
对照组
8
7.29±2.50
20.63±5.28
实验组
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8
16.37±5.30
38.92±8.81
注：t检验；与对照组比较，P<0.01
图5 对照组大鼠齿状回背侧细胞带的颗粒神经元凋亡 HE ×165
图6 实验组大鼠整条齿状回背侧细胞带神经元变性、坏死、凋亡，病变程度明显比对照组大鼠严重 HE ×165
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图7 对照组大鼠齿状回颗粒神经元凋亡 TUNEL原位标记法 ×165
图8 实验组大鼠齿状回颗粒神经元凋亡，程度比对照组严重 TUNEL原位标记法 ×165
图9 对照组大鼠Aβ周围胶质细胞浸润 正常甲醇刚果红染色 ×165
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图10 实验组大鼠Aβ周围胶质细胞浸润比对照组大鼠明显，Aβ染色与背景对比更加明显 改进甲醇刚果红染色 ×165
四、改进甲醇刚果红染色
Aβ染成淡红色，周围胶质细胞和损伤神经元染成蓝色，对照组为正常甲醇刚果红染色(图9)，实验组为改进后的甲醇刚果红染色(图10)，后者的Aβ染色与背景对比更加明显。实验组Aβ周围胶质细胞浸润比对照组明显。
讨 论
近年来在体和离体实验研究发现，MT可以抑制分泌型β淀粉样肽前体(sAPP)的产生〔7〕；抑制Aβ组氨酸残基(His+)和天冬氨酸残基(Asp)的盐键形成，破坏Aβ的β折叠，使β折叠结构变成无规则线圈样结构，后者易于被机体清除〔8〕；此外，MT还可通过抗自由基及抗Aβ诱发脂质过氧化物形成〔9〕，抑制Aβ的神经毒性作用。临床研究发现，AD患者MT减少并伴有分泌节律消失〔10〕，提示MT减少在AD发病中起某种作用。Maurizi〔11〕提出MT减少是引起AD的原因，其解释为：由于脑室液中MT减少，使羟自由基增多，损害大多数活跃神经元的线粒体，从而引起细胞凋亡等细胞损害。大鼠松果体摘除是目前国内外研究MT减少的成熟模型，我们选用此模型造成血中MT缺失，并于模型鼠海马注射聚集态的Aβ1-40，以探讨MT对Aβ神经毒性的影响。结果表明，实验组Aβ周围胶质细胞浸润明显，细胞数也明显多于对照组，说明实验组炎症反应明显强于对照组。此外，我们还发现MT缺失可以加重Aβ的神经毒性作用，其标志是实验组的神经细胞丢失增多以及神经元凋亡数增多。
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本实验结果有助于解释临床上许多正常老年人及颅脑外伤等患者脑组织中虽然可以见到Aβ沉积，但没有AD临床表现和典型病理改变；而AD患者Aβ沉积后却逐渐出现智力障碍、记忆力下降等症状以及典型病理改变等现象。推测AD患者MT减少促进脑内弥漫性老年斑(DP)中β-淀粉样蛋白前体(APP)分解生成Aβ以及非纤维状Aβ变成纤维状Aβ，后者促使自由基(特别是羟自由基)产生，造成Aβ沉积周围自由基增多，进而破坏神经元的膜结构，导致大量细胞外Ca2+进入神经细胞内，致使细胞内产生更多的自由基，使线粒体等细胞器损伤加剧以至引起细胞死亡。增多的自由基还可以激活胶质细胞，加重炎症反应，使DP变成神经炎斑(NP)，这些均加重神经元变性、坏死和凋亡。
此外，本实验对常规甲醇刚果红染色进行了改进，得到了较为理想的Aβ染色效果。主要是将正常甲醇刚果红染色顺序颠倒，避免了盐酸酒精分化时造成刚果红脱色，使Aβ染色与背景对比更清晰。
作者单位：徐斌(510282 广州市，第一军医大学附属珠江医院神经内科)
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陈俊抛(510282 广州市，第一军医大学附属珠江医院神经内科)
杨卫红(510282 广州市，第一军医大学附属珠江医院神经内科)
张泓(附属南方医院外科实验室)
林煜(解放军海军第四二一医院)
高曲文(广州军区总医院老年四科)
参 考 文 献
1，Maurizi CP. The myster of Alzheimer's disease and its prevention by melatonin. Med Hypotheses,1995,45:339-340.
2，Pappolla MA, Sos M, Omar RA, et al. Melatonin prevents death of neuroblastoma cells exposed to Alzheimer amyloid peptide. J Neurosci, 1997,1:1683-1690.
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3，高曲文，陈俊抛，田时雨，等. β淀粉样蛋白诱导海马神经元凋亡及褪黑素保护作用. 中华神经科杂志,2000,1:1-5.
4，Kuazak J,Rodin MA. New technique of pinealectomy for adult rats. Experientia,1977,33:283-284.
5，包新民，舒斯云. 大鼠脑立体定位图谱. 第1版. 北京:人民卫生出版社，1991.40-45.
6，Morimoto K, Yoshimi K, Tonohiro T, et al. Co-injection of β-amyloid with ibotenic acid induces synergistic loss of rat hippocampal neurons. Neurosci,1998,84:479-487.
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7，Song W, Lahir DK. Melatonin alters the metabolism of the beta-amyloid precursor protein in the neuroendocrine cell line PC12. J Mol Neurosci,1997,9:75-92.
8，Pappolla MA,Bozner P, Soto C,et al. Inhibition of Alzheimer β-fibrillogenesis by melatonin. J Biol Chem,1998,273:7185-7188.
9，Reiter RJ. Oxidative damage in the central nervous system: protection by melatonin. Prog Neurobio, 1998,56:359-384.
10，Uohida K, Okamoto N, Ohara K, et al. Daily rhythm of serum melatonin in patients with dementia of the degenerate. Brain Research,1996,717:154-159.
11，Maurizi CP. Loss of intraventricular fluid melatonin can explain the neuropathology of Alzheimer's disease. Med Hypotheses, 1997, 49: 153-158., 百拇医药
徐斌 陈俊抛 林煜 张泓 高曲文 杨卫红
摘 要 目的 探讨松果体功能减退致褪黑素(MT)分泌减少对β-淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性的影响及其初步机制。 方法 将SD 6周大鼠随机分为2组，实验组摘除松果体，对照组给假手术，2组均在术后40 d给予Aβ1-40 10 μg右侧海马注射,7 d后标本用Nissl、HE、改进甲醇刚果红染色，TUNEL原位标记方法检测海马神经元病理变化。 结果 以图像分析仪测量Nissl染色神经细胞带丢失情况，发现实验组丢失长度〔(694.63±81.09)μm〕明显多于对照组〔(406.57±92.38)μm,P<0.01〕；细胞凋亡数在HE染色(16.37±5.30)个和TUNEL法(38.92±8.81)个均比对照组相应显色方法增多〔分别为(7.29±2.50)个、(20.63±5.28)个，均为P<0.01〕；Aβ1-40注射周围的胶质细胞浸润数(276.37±36.33)个也明显多于对照组〔(187.93±21.81)个，P<0.01〕。 结论 大鼠松果体摘除可以加重Aβ神经毒性作用，其机制可能是加重了炎症反应。
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关键词：松果体；褪黑激素；淀粉样β蛋白；神经变性
目前，关于阿尔茨海默病(AD)的病因和发病机制仍不清，但多数学者认为家族遗传及各种环境因素的交织构成AD发病的复杂病因谱，β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积可能是所有因素导致AD发病的共同途径。1995年Maurizi〔1〕提出褪黑素(MT)减少是引起AD的病因，其理由为：(1)AD患者中MT明显减少；(2)MT可以显著清除羟自由基；(3)AD患者脑细胞中线粒体DNA损伤与羟自由基损害作用一致。Pappolla等〔2〕通过神经母细胞瘤细胞(N2a)、嗜铬细胞瘤细胞(P12)培养，发现MT可以抑制Aβ诱导细胞凋亡。我们也发现MT于在体水平可以抑制Aβ诱导海马细胞凋亡及其神经毒性作用〔3〕。但目前尚无MT减少与Aβ神经毒性关系的报道，我们于1999年1～9月通过摘除大鼠松果体制成MT缺失模型，然后给海马微量注射Aβ1-40，观察Aβ神经毒性变化情况，初步探讨MT减少和Aβ神经毒性的关系。
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材料与方法
一、药品及试剂
Aβ1-40购自美国Sigma公司，注射前用无菌生理盐水将Aβ1-40稀释成10 μg/μl，37℃下孵育1周备用。TUNEL原位标记试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。
二、实验动物及MT缺失模型的制备
雄性SD大鼠16只，由第一军医大学实验动物中心提供，体重190～210 g，鼠龄6周，随机分为2组，实验组和对照组各8只，置隔音环境中，室温18～22℃，11 h光照(8∶30～19∶30)，13 h黑暗(19∶30～8∶30)，自由摄食、饮水，适应3 d后行手术。实验组行松果体摘除术，参考文献〔4〕方法进行，对照组行假手术，手术均在19∶30～22∶30进行，每次手术做实验组和对照组大鼠各1只，术后单独饲养，7 d后实验组和对照组大鼠分别放一起。继续饲养33 d后，实验组和对照组均给予Aβ1-40右侧海马注射。首先用10%水合氯醛腹腔注射(0.4 ml/100 g体重)麻醉大鼠，头部固定在立体定向仪上，剪毛消毒，在头背中部纵向切口，暴露颅骨，参照《大鼠脑立体定位图谱》〔5〕，选右侧海马为注射区，定位坐标：前囟后3.0 mm，右侧旁开2.2 mm，硬膜下2.9 mm。在坐标点周围用牙科钻环行钻开颅骨并分离暴露硬脑膜，缓慢垂直进针，注射Aβ1-40溶液1 μl(10 μg)，注射时间5 min，留针5 min，然后缓慢撤针。
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三、组织切片制备
Aβ1-40注射后7 d，将大鼠再次麻醉(10%水合氯醛0.6 ml/100 g体重腹腔注射)，暴露心脏，通过左心室插管至主动脉，生理盐水100～150 ml冲洗，10%中性缓冲甲醛溶液150 ml快速灌注，250 ml慢滴，2 h后取脑，检查实验组松果体摘除是否完全，淘汰松果体去除不完全者，对松果体摘除完全者以及对照组取标本(标本选在注射部前后1.5 mm处，标本厚3 mm)，后固定3 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，切片厚度6 μm，脑组织出现损伤时取片，每隔30张(间隔距离180 μm)取4张平片，直到损伤消失。一套用做甲苯胺蓝Nissl染色,一套HE染色,另抽数张切片做改进甲醇刚果红染色，最后一套用于TUNEL原位标记法。
四、组化及TUNEL法标记DNA片段
Nissl染色用于观察海马神经元丢失情况，HE染色用于观察注射周围胶质细胞反应及神经元凋亡。改进甲醇刚果红染色用于观察Aβ沉积及Aβ周围胶质细胞浸润情况，对周围神经元损伤也可显示。其操作如下：(1)石蜡切片，常规二甲苯、乙醇下行脱蜡至水；(2)Harris苏木素染色5 min,自来水冲洗数分钟；(3)1%盐酸酒精分化数秒，温水显蓝；(4)甲醇刚果红染色15 min，自来水冲洗数分钟；(5)0.2%碱性酒精液分化数秒，自来水冲洗；(6)常规脱水、透明、封片。TUNEL原位标记DNA片段检测凋亡细胞，操作步骤按试剂盒说明书进行。
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五、海马神经元病理改变的观察
神经元变性体积计算参照Morimoto等〔6〕的方法。在Leica Diaplan显微镜及Leica Quantimet 500+图像分析仪上，测量Nissl染色组织切片海马CA1～4以及齿状回神经元细胞带变性、坏死、细胞丢失的程度。由于海马细胞带的宽度是一定的，海马神经元变性、坏死、细胞丢失的体积V=∫∑ayidx，yi(μm)：海马CA1～4以及齿状回神经细胞带病理改变的长度；a(μm)：海马细胞带的宽度；dx(μm)：组织切片间隔距离，即180 μm。由于a、dx是恒定的，V只与yi有关，所以我们仅以神经元损害的长度作指标来反映海马神经元损害程度。炎症改变情况以40倍物镜下HE染色组织切片上Aβ1-40沉积部周围浸润胶质细胞数(每张切片选择3个相近视野，取平均值)反映炎症变化情况。凋亡细胞计数可在HE染色或在TUNEL原位标记法上进行，方法同胶质细胞计数，部位选在海马神经元病理改变明显处。
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六、统计方法
组间均数比较用SPSS 8.0 for windows进行非配对t检验。
结 果
一、海马神经元变性、坏死、丢失情况
正常海马细胞由神经细胞和胶质细胞组成，主要的神经细胞规则地排列，使海马结构非常清楚，如CA1～3锥体细胞和齿状回颗粒细胞。假手术组Aβ1-40注射7 d后，海马神经元病理改变仅限于CA1注射针道和齿状回Aβ1-40沉积局部的神经元，表现为锥体细胞带和颗粒细胞带紊乱、变稀、中断，高倍镜下见到神经元胞膜破裂、细胞萎缩、胞核变小(图1)，但距齿状回较远处很少有或仅有很轻病理改变。松果体摘除组Aβ1-40注射，不仅CA1注射针道和Aβ1-40沉积局部有较明显形态学改变，而且距Aβ1-40沉积较远处神经元也有病理改变，表现为CA1注射针道明显增宽，锥体细胞带和颗粒细胞带病变更明显，可见很长齿状回颗粒细胞带消失(图2)，齿状回背、腹部颗粒细胞带均受累。松果体摘除组CA1～4和齿状回神经细胞带损害长度〔(694.63±81.09)μm〕比对照组〔(406.57±92.38)μm〕明显增加(P<0.01)。
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图1 对照组大鼠Aβ沉积局部齿状回背侧细胞带的颗粒神经元受损，较远的细胞带无变化 Nissl染色 ×33
图2 实验组大鼠齿状回背侧及腹侧细胞带的神经元受损，较远的细胞带也受到影响 Nissl染色 ×33
图3 对照组大鼠Aβ沉积局部有胶质细胞浸润 HE ×165
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图4 实验组大鼠Aβ沉积局部则有大量胶质细胞浸润，较对照组大鼠明显 HE ×165
二、胶质细胞浸润情况
HE染色观察正常小胶质细胞，细胞小，胞核也较小，呈圆形、椭圆形或长方形，核仁染色明显，胞体可伸出数个纤细突起；星形胶质细胞比小胶质细胞大，但比海马神经元小，胞核呈圆形、椭圆形，核仁染色淡，与神经元区别主要是Nissl染色时星形胶质细胞不显色。实验组Aβ1-40沉积局部有弥漫性胶质细胞浸润，胶质细胞数(276.37±36.33)个，较远处也能见胶质细胞聚集。对照组Aβ1-40沉积局部也有胶质细胞浸润，胶质细胞数(187.93±21.81)个，但没有实验组明显，较远处无胶质细胞聚集，两组比较P<0.01。见图3、4。
三、海马神经元凋亡情况
HE染色凋亡细胞表现为细胞极度萎缩，胞核固缩、碎裂，胞浆嗜酸性改变，染成红色，可有凋亡小体形成，见图5、6。TUNEL法染色显示凋亡细胞核呈棕黄色，典型凋亡细胞为指环样结构，由于细胞凋亡时细胞核的DNA可渗透到胞浆，所以部分凋亡细胞胞浆也着色，见图7、8。实验组海马凋亡细胞数在HE染色、TUNEL法均比对照组明显增多(均为P<0.01)，表明细胞凋亡参与海马神经元丢失，松果体摘除加重上述现象,见表1。
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表1 HE染色和TUNEL原位标记法海马神经元
凋亡数比较(个，X±s)
组别
大鼠数
(只)
HE染色
TUNEL法
对照组
8
7.29±2.50
20.63±5.28
实验组
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8
16.37±5.30
38.92±8.81
注：t检验；与对照组比较，P<0.01
图5 对照组大鼠齿状回背侧细胞带的颗粒神经元凋亡 HE ×165
图6 实验组大鼠整条齿状回背侧细胞带神经元变性、坏死、凋亡，病变程度明显比对照组大鼠严重 HE ×165
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图7 对照组大鼠齿状回颗粒神经元凋亡 TUNEL原位标记法 ×165
图8 实验组大鼠齿状回颗粒神经元凋亡，程度比对照组严重 TUNEL原位标记法 ×165
图9 对照组大鼠Aβ周围胶质细胞浸润 正常甲醇刚果红染色 ×165
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图10 实验组大鼠Aβ周围胶质细胞浸润比对照组大鼠明显，Aβ染色与背景对比更加明显 改进甲醇刚果红染色 ×165
四、改进甲醇刚果红染色
Aβ染成淡红色，周围胶质细胞和损伤神经元染成蓝色，对照组为正常甲醇刚果红染色(图9)，实验组为改进后的甲醇刚果红染色(图10)，后者的Aβ染色与背景对比更加明显。实验组Aβ周围胶质细胞浸润比对照组明显。
讨 论
近年来在体和离体实验研究发现，MT可以抑制分泌型β淀粉样肽前体(sAPP)的产生〔7〕；抑制Aβ组氨酸残基(His+)和天冬氨酸残基(Asp)的盐键形成，破坏Aβ的β折叠，使β折叠结构变成无规则线圈样结构，后者易于被机体清除〔8〕；此外，MT还可通过抗自由基及抗Aβ诱发脂质过氧化物形成〔9〕，抑制Aβ的神经毒性作用。临床研究发现，AD患者MT减少并伴有分泌节律消失〔10〕，提示MT减少在AD发病中起某种作用。Maurizi〔11〕提出MT减少是引起AD的原因，其解释为：由于脑室液中MT减少，使羟自由基增多，损害大多数活跃神经元的线粒体，从而引起细胞凋亡等细胞损害。大鼠松果体摘除是目前国内外研究MT减少的成熟模型，我们选用此模型造成血中MT缺失，并于模型鼠海马注射聚集态的Aβ1-40，以探讨MT对Aβ神经毒性的影响。结果表明，实验组Aβ周围胶质细胞浸润明显，细胞数也明显多于对照组，说明实验组炎症反应明显强于对照组。此外，我们还发现MT缺失可以加重Aβ的神经毒性作用，其标志是实验组的神经细胞丢失增多以及神经元凋亡数增多。
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本实验结果有助于解释临床上许多正常老年人及颅脑外伤等患者脑组织中虽然可以见到Aβ沉积，但没有AD临床表现和典型病理改变；而AD患者Aβ沉积后却逐渐出现智力障碍、记忆力下降等症状以及典型病理改变等现象。推测AD患者MT减少促进脑内弥漫性老年斑(DP)中β-淀粉样蛋白前体(APP)分解生成Aβ以及非纤维状Aβ变成纤维状Aβ，后者促使自由基(特别是羟自由基)产生，造成Aβ沉积周围自由基增多，进而破坏神经元的膜结构，导致大量细胞外Ca2+进入神经细胞内，致使细胞内产生更多的自由基，使线粒体等细胞器损伤加剧以至引起细胞死亡。增多的自由基还可以激活胶质细胞，加重炎症反应，使DP变成神经炎斑(NP)，这些均加重神经元变性、坏死和凋亡。
此外，本实验对常规甲醇刚果红染色进行了改进，得到了较为理想的Aβ染色效果。主要是将正常甲醇刚果红染色顺序颠倒，避免了盐酸酒精分化时造成刚果红脱色，使Aβ染色与背景对比更清晰。
作者单位：徐斌(510282 广州市，第一军医大学附属珠江医院神经内科)
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陈俊抛(510282 广州市，第一军医大学附属珠江医院神经内科)
杨卫红(510282 广州市，第一军医大学附属珠江医院神经内科)
张泓(附属南方医院外科实验室)
林煜(解放军海军第四二一医院)
高曲文(广州军区总医院老年四科)
参 考 文 献
1，Maurizi CP. The myster of Alzheimer's disease and its prevention by melatonin. Med Hypotheses,1995,45:339-340.
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3，高曲文，陈俊抛，田时雨，等. β淀粉样蛋白诱导海马神经元凋亡及褪黑素保护作用. 中华神经科杂志,2000,1:1-5.
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11，Maurizi CP. Loss of intraventricular fluid melatonin can explain the neuropathology of Alzheimer's disease. Med Hypotheses, 1997, 49: 153-158., 百拇医药