荧光聚合酶链反应检测肝豆状核变性基因突变
荧光聚合酶链反应检测肝豆状核变性基因突变
黄帆 梁秀龄 林正 徐评议 马少春 程钢
关键词：肝豆状核变性；Wilson病(WD)； 荧光聚合酶链反应 肝豆状核变性又称Wilson病(WD)，是一种常染色体隐性遗传病，胆汁排铜障碍引起金属铜离子沉积于体内多个器官，如肝、肾、大脑基底节和角膜等。为了达到早期诊断WD和检出症状前患者及携带者的目的，我们尝试采用荧光聚合酶链反应(PCR)方法检测中国人WD基因的突变热点Arg778Leu(2273G→T，位于8号外显子)，发现该方法简便易行、准确性高，便于临床推广应用。现报道如下。
一、材料和方法
1.一般资料：(1)研究对象：66例WD患者来自58个WD家系，男38例，女28例，平均年龄15.5岁。全部患者均经本院神经内科确诊为WD。(2)对照组：30例非神经系统遗传性疾病(包括脑血管意外、头晕、头痛等)，没有血缘关系的个体，男18例，女12例，平均年龄38.5岁。
, 百拇医药
2.研究方法：采用人DNA抽提药盒提取白细胞DNA，扩增WD基因8号外显子的引物序列为P1：5′-AACCCTTCACTGTCCTTGTC-3′；P2：5′-AGGCAGCTCTTTTCTGAAC-3′。荧光标记探针针对778密码子G→T突变设计合成，探针1(标记绿色荧光素，检测正常序列)：5′-(FAM)CAGCCACCGGCCCAGGG(TAMRA)-3′；探针2(标记红色荧光素，检测突变序列)：5′-(FAM)CAGCCACAGGCCCAGGG(TAMRA)-3′。反应总体积40 μl，5×buffer 8 μl，2 mMdNTP 4 μl，primer 1 1 μl，primer 2 1 μl，Taq酶1 μl，模板DNA 2 μl，探针1和探针2各0.3 μl。在7700型PCR荧光自动检测仪中先93℃预变性3 min，再按下列温度和时间反应40个循环：93℃45 s，66.5℃2 min。结果若红色荧光增长而绿色荧光无增长，表示突变纯合子；若绿色荧光增长而红色荧光无增长，表示778密码子不存在G→T突变；若红、绿色荧光同时增长，表示突变杂合子。
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3.DNA测序：随机抽取1例纯合子，1例杂合子和1例荧光PCR结果正常的对照个体进行DNA直接测序。
二、结果
1.非WD对照组的结果：全部正常。
2.WD患者的检验结果：66例WD患者中，有5例为Arg778Leu突变纯合子，占患者总数的7.58%；21例为Arg778Leu突变杂合子，占31.82%；其余40例正常。本试验的总检出率为39.4%。
3.DNA测序结果：纯合子双链均存在2273G→T，杂合子一条链存在2273G→T，非WD对照个体双链均无碱基突变，与荧光PCR结果一致。
三、讨论
迄今不少疾病均可采用基因诊断方法进行诊断，但因目前的基因诊断方法相对复杂耗时，昂贵而且效率低，因而需要寻求更好的基因诊断方法。过去检测WD患者基因突变的方法，主要有限制性多态性片断长度(RFLP)分析、微卫星DNA单倍体分析[1]等，这些方法检测的不是突变基因本身，需要先证者的完整家系进行分析，且先证者双亲必须是等位基因片段的杂合子，因而这些方法在临床上受到很大的限制。近年发展起来的其他方法还有SSCP分析、DNA测序、半巢式快速反应PCR[2]、PCR-酶切法[3]等，这些方法较以前的方法有了很大的进步，它们检测的是突变基因本身，而且不需要进行繁琐的家系连锁分析，因而诊断效率有了较大的提高。但这些方法仍然存在较多缺点：需要酶切位点的存在，酶切技术在操作上较为困难，往往由于酶切不完全导致假阳性结果；需要电泳和染色技术；对操作员和环境有害等。
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我们采用荧光PCR方法在66例WD患者中，检出5例Arg778Leu突变纯合子和21例突变杂合子，总检测率为39.4%，是目前该位点的最高检出率[4，5]，我们认为荧光PCR在WD家系的筛查、症状前患者和杂合子的检出中具有广泛的临床应用前景。但是WD基因的突变位点复杂多样，目前国内外已报道存在134种突变，因而只能选择某地区人群的1个或几个高频突变点(即突变热区)进行基因诊断，没有该位点突变也不能排除WD，还需其他基因诊断方法进行检测。
基金项目：卫生部临床学科重大项目基金(37091)；中山医科大学211工程基金项目(046)
作者单位：黄帆(510080 广州，中山医科大学附属第一医院神经内科)
梁秀龄(510080 广州，中山医科大学附属第一医院神经内科)
徐评议(510080 广州，中山医科大学附属第一医院神经内科)
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马少春(510080 广州，中山医科大学附属第一医院神经内科)
林正(中山医科大学生物技术研究所)
程钢(中山医科大学生物技术研究所)
参考文献
1，王丽娟，梁秀龄，徐评议，等. Wilson′s病与微卫星DNA的连锁分析. 中国神经精神疾病杂志，1998，4：205-207.
2，Maier-Dobeersberger T, Ferenci P, Polli C, et al. Detection of the His1069Gln mutation in Wilson′s disease by rapid polymerase chain reaction. Ann Intem Med, 1997, 127: 21-26.
3，马少春，梁秀龄，徐评议，等. 肝豆状核变性8，14号外显子基因突变的检测. 中山医科大学学报，1998，19：14-17.
4，Lie YS, Petropoulos CJ. Advances in quantitative PCR technology: 5′ nuclease assays. Curr Opin Biotechnol, 1998, 9:43-48.
5，许月芳，范玉新，余龙，等. PCR直接测序在wilson′s病基因第8外显子检出一个突变热点. 中华医学遗传学杂志，1998，15：284-287., http://www.100md.com
黄帆 梁秀龄 林正 徐评议 马少春 程钢
关键词：肝豆状核变性；Wilson病(WD)； 荧光聚合酶链反应 肝豆状核变性又称Wilson病(WD)，是一种常染色体隐性遗传病，胆汁排铜障碍引起金属铜离子沉积于体内多个器官，如肝、肾、大脑基底节和角膜等。为了达到早期诊断WD和检出症状前患者及携带者的目的，我们尝试采用荧光聚合酶链反应(PCR)方法检测中国人WD基因的突变热点Arg778Leu(2273G→T，位于8号外显子)，发现该方法简便易行、准确性高，便于临床推广应用。现报道如下。
一、材料和方法
1.一般资料：(1)研究对象：66例WD患者来自58个WD家系，男38例，女28例，平均年龄15.5岁。全部患者均经本院神经内科确诊为WD。(2)对照组：30例非神经系统遗传性疾病(包括脑血管意外、头晕、头痛等)，没有血缘关系的个体，男18例，女12例，平均年龄38.5岁。
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2.研究方法：采用人DNA抽提药盒提取白细胞DNA，扩增WD基因8号外显子的引物序列为P1：5′-AACCCTTCACTGTCCTTGTC-3′；P2：5′-AGGCAGCTCTTTTCTGAAC-3′。荧光标记探针针对778密码子G→T突变设计合成，探针1(标记绿色荧光素，检测正常序列)：5′-(FAM)CAGCCACCGGCCCAGGG(TAMRA)-3′；探针2(标记红色荧光素，检测突变序列)：5′-(FAM)CAGCCACAGGCCCAGGG(TAMRA)-3′。反应总体积40 μl，5×buffer 8 μl，2 mMdNTP 4 μl，primer 1 1 μl，primer 2 1 μl，Taq酶1 μl，模板DNA 2 μl，探针1和探针2各0.3 μl。在7700型PCR荧光自动检测仪中先93℃预变性3 min，再按下列温度和时间反应40个循环：93℃45 s，66.5℃2 min。结果若红色荧光增长而绿色荧光无增长，表示突变纯合子；若绿色荧光增长而红色荧光无增长，表示778密码子不存在G→T突变；若红、绿色荧光同时增长，表示突变杂合子。
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3.DNA测序：随机抽取1例纯合子，1例杂合子和1例荧光PCR结果正常的对照个体进行DNA直接测序。
二、结果
1.非WD对照组的结果：全部正常。
2.WD患者的检验结果：66例WD患者中，有5例为Arg778Leu突变纯合子，占患者总数的7.58%；21例为Arg778Leu突变杂合子，占31.82%；其余40例正常。本试验的总检出率为39.4%。
3.DNA测序结果：纯合子双链均存在2273G→T，杂合子一条链存在2273G→T，非WD对照个体双链均无碱基突变，与荧光PCR结果一致。
三、讨论
迄今不少疾病均可采用基因诊断方法进行诊断，但因目前的基因诊断方法相对复杂耗时，昂贵而且效率低，因而需要寻求更好的基因诊断方法。过去检测WD患者基因突变的方法，主要有限制性多态性片断长度(RFLP)分析、微卫星DNA单倍体分析[1]等，这些方法检测的不是突变基因本身，需要先证者的完整家系进行分析，且先证者双亲必须是等位基因片段的杂合子，因而这些方法在临床上受到很大的限制。近年发展起来的其他方法还有SSCP分析、DNA测序、半巢式快速反应PCR[2]、PCR-酶切法[3]等，这些方法较以前的方法有了很大的进步，它们检测的是突变基因本身，而且不需要进行繁琐的家系连锁分析，因而诊断效率有了较大的提高。但这些方法仍然存在较多缺点：需要酶切位点的存在，酶切技术在操作上较为困难，往往由于酶切不完全导致假阳性结果；需要电泳和染色技术；对操作员和环境有害等。
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我们采用荧光PCR方法在66例WD患者中，检出5例Arg778Leu突变纯合子和21例突变杂合子，总检测率为39.4%，是目前该位点的最高检出率[4，5]，我们认为荧光PCR在WD家系的筛查、症状前患者和杂合子的检出中具有广泛的临床应用前景。但是WD基因的突变位点复杂多样，目前国内外已报道存在134种突变，因而只能选择某地区人群的1个或几个高频突变点(即突变热区)进行基因诊断，没有该位点突变也不能排除WD，还需其他基因诊断方法进行检测。
基金项目：卫生部临床学科重大项目基金(37091)；中山医科大学211工程基金项目(046)
作者单位：黄帆(510080 广州，中山医科大学附属第一医院神经内科)
梁秀龄(510080 广州，中山医科大学附属第一医院神经内科)
徐评议(510080 广州，中山医科大学附属第一医院神经内科)
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马少春(510080 广州，中山医科大学附属第一医院神经内科)
林正(中山医科大学生物技术研究所)
程钢(中山医科大学生物技术研究所)
参考文献
1，王丽娟，梁秀龄，徐评议，等. Wilson′s病与微卫星DNA的连锁分析. 中国神经精神疾病杂志，1998，4：205-207.
2，Maier-Dobeersberger T, Ferenci P, Polli C, et al. Detection of the His1069Gln mutation in Wilson′s disease by rapid polymerase chain reaction. Ann Intem Med, 1997, 127: 21-26.
3，马少春，梁秀龄，徐评议，等. 肝豆状核变性8，14号外显子基因突变的检测. 中山医科大学学报，1998，19：14-17.
4，Lie YS, Petropoulos CJ. Advances in quantitative PCR technology: 5′ nuclease assays. Curr Opin Biotechnol, 1998, 9:43-48.
5，许月芳，范玉新，余龙，等. PCR直接测序在wilson′s病基因第8外显子检出一个突变热点. 中华医学遗传学杂志，1998，15：284-287., http://www.100md.com