组合靶基因自动检测仪快速检测人乳头瘤病毒
组合靶基因自动检测仪快速检测人乳头瘤病毒
汪江华 府伟灵 王颖莹 朱前勇
摘 要 目的 探讨检测尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒(HPV)的方法。方法 将基因芯片与压电传感器技术相结合，对复发型尖锐湿疣及相应的原发病例组织标本各22份，利用HPV6、11、16、18 4种型特异寡核苷酸探针，进行HPV检测，并与常规的聚合酶链反应(PCR)和斑点杂交方法比较。结果 用压电基因传感器芯片技术检测，原发型组织标本22份全部为HPV阳性，其中HPV6 17份(77.3%)，HPV11 3份(13.6%)，HPV16 2份(9.1%)，HPV18未检出；复发型组织标本22份中，21份阳性，其中HPV6检出15份(68.2%)，HPV11检出2份(9.1%)，HPV16检出4份(18.2%)，HPV18未检出，全部操作仅需10 min。用PCR方法检测结果全部阳性，PCR扩增的产物经斑点杂交分型，结果与其基本一致。结论 压电基因传感器芯片技术用于检测HPV，具有准确、快速、灵敏的优点。
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关键词：乳头状瘤病毒，人；基因芯片；生物传感器
将基因芯片(gene chip)与压电传感器(piezo-electric biosensor)技术结合应用，是我们研制的组合靶基因自动检测仪的主要特色。由于准确检测人乳头瘤病毒(HPV)及其感染分型对临床生殖道疾病复发尖锐湿疣的预测、感染的预后和判断有无新的感染具有重大意义[1]，因此我们应用压电基因传感器芯片技术对临床原发及复发尖锐湿疣患者标本各22份进行检测，并与常规的聚合酶链反应(PCR)、斑点杂交方法进行比较，现将结果报告如下。
材料和方法
一、标本收集与处理
标本采自重庆市3所医院的皮肤科22例门诊复发尖锐湿疣患者。各取其原发及复发型尖锐湿疣组织约0.05～0.20 g，并按小量组织DNA抽提试剂盒操作步骤提取组织DNA，-20℃储存备用。
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二、主要材料
1.寡聚核苷酸探针[2]：上海细胞生物学研究所合成，部分经地高辛标记。HPV6：CATCCGTAACTA-CATCTTCC；HPV11：TCTGTGTCTAAATCTGCTAC，HPV16：CATACACCTCCAGCACCTAA，HPV18：TCT-ACACAGTCTCCTGTACC。
2.PCR引物[2]：上海细胞所合成，L1通用引物：P1：GCACAGGGTCATAACAATGG，P2：CGTCCAA-GGACACTGATC。
3.主要仪器：(1)组合靶基因自动检测仪(本单位自行研制)：该检测仪由压电晶体、振荡电路、频率记数仪以及个人电脑组成。在具有一定切型的石英晶体片2面加上适当的金属电极(金或银)，即形成石英晶体谐振器。石英晶体片夹在2片金或银电极之间，成为夹心形。组合靶基因自动检测仪检测系统一般设置2个振荡电路，一个是晶体检测振荡电路，一个是晶体的参比振荡电路。参比电路是为校正温度、气压、粘度、缓冲体系以及其他一些干扰的影响而设置的，用以消除误差。压电晶体的谐振频率以及频率的改变由频率计数仪完成，再由电脑进行数据分析和结果报告。(2)组合靶基因芯片板(本单位自行研制)：用AT切、10 MHz的石英晶体作为固定探针以及检测的反应场所，并制成12孔阵列式芯片板。每一芯片板上设有一参照孔消除误差，其余为样品检测孔。我们设有2种芯片板：Ⅰ型芯片板每孔混合固定了4种寡核苷酸探针用于筛选被4型HPV感染的标本；Ⅱ型芯片板每孔只固定1种寡核苷酸探针，可用于确定感染的HPV亚型。(3)PCR仪-PE2400。
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三、组合靶基因自动检测仪检测
将组合靶基因自动检测仪检测程序启动。组织DNA标本用BamHⅠ内切酶消化后置于反应缓冲液中，启动加样程序加样于芯片板上进行检测，每孔加样体积为25 μl。
四、PCR扩增及斑点杂交[3]
按照常规方法操作。
结果
一、组合靶基因自动检测仪检测结果
芯片板中均有一孔为阴性对照，即在测试时此孔加入正常组织DNA BamHⅠ酶切产物。测试调零后，振荡频率降低值大于20 Hz为阳性标本。
1.组合靶基因芯片板Ⅰ型检测结果：22例患者标本中，除第18例标本复发型为阴性结果外，其余标本检测全为阳性结果，其频率变化均在48(±5) Hz。
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2.组合靶基因芯片板Ⅱ型检测结果：22份原发型标本检测结果为：HPV6检出17份(77.3%)，HPV11检出3份(13.6%)，HPV16检出2份(9.1%)，HPV18未检出；22份复发型标本检测结果为：HPV6检出15份(68.2%)HPV11检出2份(9.1%)，HPV16检出4份(18.2%)，HPV18未检出，另1份(4.5%)为阴性结果。
二、PCR+斑点杂交结果
所有标本PCR检测结果均为阳性，可见1份标本复发型的检测结果与芯片板Ⅰ型不同；斑点杂交分型结果与芯片板Ⅱ型完全一致。
讨论
组合靶基因自动检测仪的基本工作原理，是利用压电石英晶体对表面微质量变化敏感的特性，将探针分子固定于镀有金或银膜层的石英晶体支持物上，由于探针与靶分子的杂交与否会产生晶体表面微质量的改变，导致石英晶体谐振频率的改变(即下降)，通过检测石英晶体谐振频率的变化值即可判断样品有无靶分子以及数量多少。压电晶体具有一定的谐振频率，如9MHz、27MHz等。最常用的为石英晶体，按AT方式切割。由于石英晶体属于各向异性材料，在不同方向上的压电性能是不同的，AT切石英晶体是所发现的第一个零温度系数的切型(Y切族，=35°15′)，因其具有众多优良性能，目前已成为通讯和传感器技术应用最广泛的一种切型。
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尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒感染引起的，是最常见的病毒性性传播疾病。生殖道HPV感染有几十种型别，其中HPV6/11被视为低危性病毒，由于HPV16/18易使细胞产生恶变倾向，故被视为高危性病毒。在HPV感染病例中约有4.1%的病例在5～20年内发生原位癌[4]，因此准确检测HPV及其感染分型对临床生殖道疾病复发尖锐湿疣的预测感染的预后和判断有无新的感染及治疗对象范围具有重大意义。在HPV感染诊断中，以往常用的方法为斑点杂交、Southern blot杂交、PCR以及原位杂交。 本工作通过与PCR+斑点杂交方法检测结果的对比，证明了压电基因传感器芯片技术能准确地检测HPV DNA并对其分型。由于全部操作从加样至报告结果仅需10 min就可以完成，并且其检测下限可达10-18 mol/L，即约10-12 g靶DNA分子，因此它具有快速准确及操作简便等优点，其灵敏度、特异性与目前所用标记检测技术相当[5，6]，因而具有广阔的推广应用前景。
, http://www.100md.com 实验中2种不同方法的检测结果，仅第18例复发型标本有所不同，但并不矛盾。该标本经PCR检测为阳性，说明有HPV感染，但斑点杂交为阴性，说明感染的HPV为6、11、16、18以外的型别。由于组合靶基因芯片板Ⅰ型用于初筛，仅固定有此4种型别的探针，故而结果为阴性(为假阴性报告)，组合靶基因芯片板Ⅱ型用于分型亦为阴性。可见，随着人们对基因的进一步确认，我们只要获得特异的基因序列(即其他型别的探针)，就可以使用此压电基因传感器芯片技术对多种细菌、病毒同时进行快速、准确的检测。
基金项目：1998国家自然科学基金(39870831)；国家“九五”科学仪器攻关项目(96-A23-04-04)
作者单位：汪江华(400038 重庆，第三军医大学西南医院基因诊断与治疗中心)
府伟灵(400038 重庆，第三军医大学西南医院基因诊断与治疗中心)
, http://www.100md.com 王颖莹(400038 重庆，第三军医大学西南医院基因诊断与治疗中心)
朱前勇(400038 重庆，第三军医大学西南医院基因诊断与治疗中心)
参考文献
1，郭华阳，李文维，谭骏. 尖锐湿疣复发的病因学研究概况. 国外医学临床生物化学与检验学分册，1995，16 Suppl:1-3.
2，朱平，主编. PCR基因扩增实验操作手册. 北京：中国科学技术出版社，1992. 426.
3，谭骏，王燕，郭华阳，等. 重组DNA技术. 第三军医大学博士硕士生试用教材, 1993.12-13.
4，Syrijanen K, Vayrynen M,Saarikoski S,et al. Natural history of cervical HPV infections based on prospective follow-up. Br J Obstet Gynecol, 1985,92:1086.
, http://www.100md.com
5，Caruso F, Rodda E, Neil FD, et al. Quartz crystal microbalance study of DNA immobilization and hybridization for nucleic acid sensor development. Anal Chem, 1997, 69: 2043-2049.
6，Okahata Y, Kawase M, Niikura K, et al. Kinetic measurements of DNA hybridization on an oligonucleotide-immobilized 27-MHz quartz crystal microbalance. Anal Chem, 1998, 70:1288-1296., http://www.100md.com
汪江华 府伟灵 王颖莹 朱前勇
摘 要 目的 探讨检测尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒(HPV)的方法。方法 将基因芯片与压电传感器技术相结合，对复发型尖锐湿疣及相应的原发病例组织标本各22份，利用HPV6、11、16、18 4种型特异寡核苷酸探针，进行HPV检测，并与常规的聚合酶链反应(PCR)和斑点杂交方法比较。结果 用压电基因传感器芯片技术检测，原发型组织标本22份全部为HPV阳性，其中HPV6 17份(77.3%)，HPV11 3份(13.6%)，HPV16 2份(9.1%)，HPV18未检出；复发型组织标本22份中，21份阳性，其中HPV6检出15份(68.2%)，HPV11检出2份(9.1%)，HPV16检出4份(18.2%)，HPV18未检出，全部操作仅需10 min。用PCR方法检测结果全部阳性，PCR扩增的产物经斑点杂交分型，结果与其基本一致。结论 压电基因传感器芯片技术用于检测HPV，具有准确、快速、灵敏的优点。
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关键词：乳头状瘤病毒，人；基因芯片；生物传感器
将基因芯片(gene chip)与压电传感器(piezo-electric biosensor)技术结合应用，是我们研制的组合靶基因自动检测仪的主要特色。由于准确检测人乳头瘤病毒(HPV)及其感染分型对临床生殖道疾病复发尖锐湿疣的预测、感染的预后和判断有无新的感染具有重大意义[1]，因此我们应用压电基因传感器芯片技术对临床原发及复发尖锐湿疣患者标本各22份进行检测，并与常规的聚合酶链反应(PCR)、斑点杂交方法进行比较，现将结果报告如下。
材料和方法
一、标本收集与处理
标本采自重庆市3所医院的皮肤科22例门诊复发尖锐湿疣患者。各取其原发及复发型尖锐湿疣组织约0.05～0.20 g，并按小量组织DNA抽提试剂盒操作步骤提取组织DNA，-20℃储存备用。
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二、主要材料
1.寡聚核苷酸探针[2]：上海细胞生物学研究所合成，部分经地高辛标记。HPV6：CATCCGTAACTA-CATCTTCC；HPV11：TCTGTGTCTAAATCTGCTAC，HPV16：CATACACCTCCAGCACCTAA，HPV18：TCT-ACACAGTCTCCTGTACC。
2.PCR引物[2]：上海细胞所合成，L1通用引物：P1：GCACAGGGTCATAACAATGG，P2：CGTCCAA-GGACACTGATC。
3.主要仪器：(1)组合靶基因自动检测仪(本单位自行研制)：该检测仪由压电晶体、振荡电路、频率记数仪以及个人电脑组成。在具有一定切型的石英晶体片2面加上适当的金属电极(金或银)，即形成石英晶体谐振器。石英晶体片夹在2片金或银电极之间，成为夹心形。组合靶基因自动检测仪检测系统一般设置2个振荡电路，一个是晶体检测振荡电路，一个是晶体的参比振荡电路。参比电路是为校正温度、气压、粘度、缓冲体系以及其他一些干扰的影响而设置的，用以消除误差。压电晶体的谐振频率以及频率的改变由频率计数仪完成，再由电脑进行数据分析和结果报告。(2)组合靶基因芯片板(本单位自行研制)：用AT切、10 MHz的石英晶体作为固定探针以及检测的反应场所，并制成12孔阵列式芯片板。每一芯片板上设有一参照孔消除误差，其余为样品检测孔。我们设有2种芯片板：Ⅰ型芯片板每孔混合固定了4种寡核苷酸探针用于筛选被4型HPV感染的标本；Ⅱ型芯片板每孔只固定1种寡核苷酸探针，可用于确定感染的HPV亚型。(3)PCR仪-PE2400。
, http://www.100md.com
三、组合靶基因自动检测仪检测
将组合靶基因自动检测仪检测程序启动。组织DNA标本用BamHⅠ内切酶消化后置于反应缓冲液中，启动加样程序加样于芯片板上进行检测，每孔加样体积为25 μl。
四、PCR扩增及斑点杂交[3]
按照常规方法操作。
结果
一、组合靶基因自动检测仪检测结果
芯片板中均有一孔为阴性对照，即在测试时此孔加入正常组织DNA BamHⅠ酶切产物。测试调零后，振荡频率降低值大于20 Hz为阳性标本。
1.组合靶基因芯片板Ⅰ型检测结果：22例患者标本中，除第18例标本复发型为阴性结果外，其余标本检测全为阳性结果，其频率变化均在48(±5) Hz。
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2.组合靶基因芯片板Ⅱ型检测结果：22份原发型标本检测结果为：HPV6检出17份(77.3%)，HPV11检出3份(13.6%)，HPV16检出2份(9.1%)，HPV18未检出；22份复发型标本检测结果为：HPV6检出15份(68.2%)HPV11检出2份(9.1%)，HPV16检出4份(18.2%)，HPV18未检出，另1份(4.5%)为阴性结果。
二、PCR+斑点杂交结果
所有标本PCR检测结果均为阳性，可见1份标本复发型的检测结果与芯片板Ⅰ型不同；斑点杂交分型结果与芯片板Ⅱ型完全一致。
讨论
组合靶基因自动检测仪的基本工作原理，是利用压电石英晶体对表面微质量变化敏感的特性，将探针分子固定于镀有金或银膜层的石英晶体支持物上，由于探针与靶分子的杂交与否会产生晶体表面微质量的改变，导致石英晶体谐振频率的改变(即下降)，通过检测石英晶体谐振频率的变化值即可判断样品有无靶分子以及数量多少。压电晶体具有一定的谐振频率，如9MHz、27MHz等。最常用的为石英晶体，按AT方式切割。由于石英晶体属于各向异性材料，在不同方向上的压电性能是不同的，AT切石英晶体是所发现的第一个零温度系数的切型(Y切族，=35°15′)，因其具有众多优良性能，目前已成为通讯和传感器技术应用最广泛的一种切型。
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尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒感染引起的，是最常见的病毒性性传播疾病。生殖道HPV感染有几十种型别，其中HPV6/11被视为低危性病毒，由于HPV16/18易使细胞产生恶变倾向，故被视为高危性病毒。在HPV感染病例中约有4.1%的病例在5～20年内发生原位癌[4]，因此准确检测HPV及其感染分型对临床生殖道疾病复发尖锐湿疣的预测感染的预后和判断有无新的感染及治疗对象范围具有重大意义。在HPV感染诊断中，以往常用的方法为斑点杂交、Southern blot杂交、PCR以及原位杂交。 本工作通过与PCR+斑点杂交方法检测结果的对比，证明了压电基因传感器芯片技术能准确地检测HPV DNA并对其分型。由于全部操作从加样至报告结果仅需10 min就可以完成，并且其检测下限可达10-18 mol/L，即约10-12 g靶DNA分子，因此它具有快速准确及操作简便等优点，其灵敏度、特异性与目前所用标记检测技术相当[5，6]，因而具有广阔的推广应用前景。
, http://www.100md.com 实验中2种不同方法的检测结果，仅第18例复发型标本有所不同，但并不矛盾。该标本经PCR检测为阳性，说明有HPV感染，但斑点杂交为阴性，说明感染的HPV为6、11、16、18以外的型别。由于组合靶基因芯片板Ⅰ型用于初筛，仅固定有此4种型别的探针，故而结果为阴性(为假阴性报告)，组合靶基因芯片板Ⅱ型用于分型亦为阴性。可见，随着人们对基因的进一步确认，我们只要获得特异的基因序列(即其他型别的探针)，就可以使用此压电基因传感器芯片技术对多种细菌、病毒同时进行快速、准确的检测。
基金项目：1998国家自然科学基金(39870831)；国家“九五”科学仪器攻关项目(96-A23-04-04)
作者单位：汪江华(400038 重庆，第三军医大学西南医院基因诊断与治疗中心)
府伟灵(400038 重庆，第三军医大学西南医院基因诊断与治疗中心)
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朱前勇(400038 重庆，第三军医大学西南医院基因诊断与治疗中心)
参考文献
1，郭华阳，李文维，谭骏. 尖锐湿疣复发的病因学研究概况. 国外医学临床生物化学与检验学分册，1995，16 Suppl:1-3.
2，朱平，主编. PCR基因扩增实验操作手册. 北京：中国科学技术出版社，1992. 426.
3，谭骏，王燕，郭华阳，等. 重组DNA技术. 第三军医大学博士硕士生试用教材, 1993.12-13.
4，Syrijanen K, Vayrynen M,Saarikoski S,et al. Natural history of cervical HPV infections based on prospective follow-up. Br J Obstet Gynecol, 1985,92:1086.
, http://www.100md.com
5，Caruso F, Rodda E, Neil FD, et al. Quartz crystal microbalance study of DNA immobilization and hybridization for nucleic acid sensor development. Anal Chem, 1997, 69: 2043-2049.
6，Okahata Y, Kawase M, Niikura K, et al. Kinetic measurements of DNA hybridization on an oligonucleotide-immobilized 27-MHz quartz crystal microbalance. Anal Chem, 1998, 70:1288-1296., http://www.100md.com