荧光探针定量聚合酶链反应检测孕妇生殖道解脲脲原体
荧光探针定量聚合酶链反应检测孕妇生殖道解脲脲原体
朱庆义 李连青 张邦骤 周向红 刘建萍 杨国福 何蕴韶
关键词：荧光探针定量聚合酶链反应；孕妇；生殖道；解脲脲原体 解脲脲原体(ureaplasma urealyticum, UU)是非淋菌性尿道炎的重要病原体，常寄居在妇女生殖道，通常无症状。在孕期UU感染率明显增高，可达40%～80%，约有20%可引起孕期各种并发症，也可在宫内通过胎盘或分娩时经产道传播给胎儿或新生儿，引起各种围产儿异常[1-3]。我们对太原地区孕妇UU感染状况及其检测方法作了比较分析，报告如下。
一、材料和方法
1.标本来源：自1998年1月～1999年12月在山西省妇幼保健院妇产科门诊和住院的孕妇749名，年龄21～42岁。用无菌棉拭子取宫颈分泌物，于2 ml生理盐水中， 立即送检，做UU培养和PCR检测。
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2.UU培养：用RPMI-1640培养基，加20%小牛血清，0.02%尿素，1.0% PVA(多粘菌素B 2 500U，万古霉素10 mg，两性霉素B 2 mg，H2O 10 ml)，将分泌物拭子直接种入培养基中，37℃孵育24 h，观察结果。
3.PCR试验：(1)定性PCR试验：根据UU尿素酶基因片段自行设计一对引物(U1：5′-AAATACTGGTGACCGTCC-3′，U2：5′-GTCTCCTGGTTCAAAACG-3′，扩增片段为172 bp，操作按本室常规方法进行。(2)PCR-杂交梳(PCR-hyb)：PCR与探针杂交相结合，试剂盒由上海复星实业有限公司提供，操作方法按试剂盒说明。(3)荧光探针定量PCR(FQ-PCR)：PCR技术与荧光素标记探针结合，在单一反应管中进行DNA扩增。 试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心提供，操作方法按试剂盒说明，扩增仪为PE 5700 SDS自动荧光检测仪，试验结果由电脑自动分析计算出UU-DNA量。
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二、结果
1.孕妇UU 感染4种方法检测结果：749份孕妇宫颈分泌物，采用培养、PCR、PCR-hyb、FQ-PCR法检测UU，其阳性率分别为40.6%(304/749)，46.5%(348/749)，51.0%(51/100)，64.0%(64/100)。4种检测方法比较，以FQ-PCR阳性检出率最高，其UU-DNA量为3.5×105～9.0×107 cp/μl，经统计学分析，P<0.05， 差异有显著性。
2.UU培养与FQ-PCR结果比较：100份孕妇分泌物标本，于未经培养和经24、48 h培养后，分别做FQ-PCR试验。结果：经24和48 h培养UU阳性者分别为41份和46份；FQ-PCR法未培养标本UU阳性者43份，24和48 h培养后均为64份(其DNA量为3.5×105～9.0×107 cp/ul和4.0×106～1.0×108 cp/μl)；其中2份48 h培养UU阳性而FQ-PCR为阴性，细菌学鉴定证明其为细菌污染所致。因此，UU培养以24 h观察结果为宜。
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3.3种PCR方法检测UU-DNA结果比较：100份标本经UU培养鉴定阳性为64份，阴性36份，用3 种PCR试验作比较分析。结果：FQ-PCR、PCR-hyb和PCR阳性者分别为64、57和54份。经Lenke计算方法统计分析[4]，其准确性分别为100%、92.9%和89.8%，FQ-PCR法敏感性和特异性为100%，未发现假阳性和假阴性；PCR-hyb法敏感性和特异性为89.1%和100%，假阴性10.9%；PCR法敏感性和特异性为84.4%，和94.4%，假阳性和假阴性为5.6%和15.6%。
三、讨论
对于UU感染的病原学诊断，通常可用简便的培养法筛查，但阳性率偏低。近年来应用PCR检测UU-DNA，提高了UU检出率。但鉴于目前国内尚无标准诊断试剂盒和实验操作技术不规范，因PCR污染所造成的假阳性，给临床诊断造成混乱。荧光探针定量PCR用于病原学诊断，是PCR技术领域的一项创新。我们采用中山医科大学达安基因诊断中心研制的UU-DNA检测试剂盒，并与UU培养、PCR、PCR-杂交梳作了比较研究。结果表明，FQ-PCR具有良好的敏感性和特异性，并可定量检测临床标本中UU-DNA。对于孕期UU感染的诊断，及其围生儿并发症的诊断，在科研工作方面应用具有一定的价值。
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基金项目：1996年度卫生部科研基金和优秀青年人才基金项目(96-2-261)
作者单位：朱庆义(030013 太原，山西省儿童医院分子微生物室)
李连青(030013 太原，山西省儿童医院分子微生物室)
周向红(030013 太原，山西省儿童医院分子微生物室)
刘建萍(030013 太原，山西省儿童医院分子微生物室)
张邦骤(中山医科大学达安基因诊断中心)
杨国福(中山医科大学达安基因诊断中心)
何蕴韶(中山医科大学达安基因诊断中心)
, http://www.100md.com 参考文献
1，Abele-Hern M, Wolff C, Dressel P, et al. Association of Ureaplasma urealyticum biovars with clinical outcome for neonates, obstetric patients, and gynecological patients with pelvic inflammatory disease. J Clin Microbiol, 1997，35:1199-1201.
2，Tang K , Li M, Yu W, et al. Compareson of PCR with culture for detection of Ureaplasma urealyticum in clinical samples from patients with urogenital infections. J Clin Microbiol, 1994, 32:2332-2234.
3，Wang XP, Zhu QY. Detection of genes for Ureaplasma urealyticum in clinical samples from women with genitourinary infection by PCR. US Chin Heal Hyg J, 1999，2:60-64.
4，Lenke RR. The efficacy of the nitrite test and microscopic urinelysis in predicting urine culture results. Am J Obstet Gynecol, 1981,140:427-430., 百拇医药
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关键词：荧光探针定量聚合酶链反应；孕妇；生殖道；解脲脲原体 解脲脲原体(ureaplasma urealyticum, UU)是非淋菌性尿道炎的重要病原体，常寄居在妇女生殖道，通常无症状。在孕期UU感染率明显增高，可达40%～80%，约有20%可引起孕期各种并发症，也可在宫内通过胎盘或分娩时经产道传播给胎儿或新生儿，引起各种围产儿异常[1-3]。我们对太原地区孕妇UU感染状况及其检测方法作了比较分析，报告如下。
一、材料和方法
1.标本来源：自1998年1月～1999年12月在山西省妇幼保健院妇产科门诊和住院的孕妇749名，年龄21～42岁。用无菌棉拭子取宫颈分泌物，于2 ml生理盐水中， 立即送检，做UU培养和PCR检测。
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2.UU培养：用RPMI-1640培养基，加20%小牛血清，0.02%尿素，1.0% PVA(多粘菌素B 2 500U，万古霉素10 mg，两性霉素B 2 mg，H2O 10 ml)，将分泌物拭子直接种入培养基中，37℃孵育24 h，观察结果。
3.PCR试验：(1)定性PCR试验：根据UU尿素酶基因片段自行设计一对引物(U1：5′-AAATACTGGTGACCGTCC-3′，U2：5′-GTCTCCTGGTTCAAAACG-3′，扩增片段为172 bp，操作按本室常规方法进行。(2)PCR-杂交梳(PCR-hyb)：PCR与探针杂交相结合，试剂盒由上海复星实业有限公司提供，操作方法按试剂盒说明。(3)荧光探针定量PCR(FQ-PCR)：PCR技术与荧光素标记探针结合，在单一反应管中进行DNA扩增。 试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心提供，操作方法按试剂盒说明，扩增仪为PE 5700 SDS自动荧光检测仪，试验结果由电脑自动分析计算出UU-DNA量。
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二、结果
1.孕妇UU 感染4种方法检测结果：749份孕妇宫颈分泌物，采用培养、PCR、PCR-hyb、FQ-PCR法检测UU，其阳性率分别为40.6%(304/749)，46.5%(348/749)，51.0%(51/100)，64.0%(64/100)。4种检测方法比较，以FQ-PCR阳性检出率最高，其UU-DNA量为3.5×105～9.0×107 cp/μl，经统计学分析，P<0.05， 差异有显著性。
2.UU培养与FQ-PCR结果比较：100份孕妇分泌物标本，于未经培养和经24、48 h培养后，分别做FQ-PCR试验。结果：经24和48 h培养UU阳性者分别为41份和46份；FQ-PCR法未培养标本UU阳性者43份，24和48 h培养后均为64份(其DNA量为3.5×105～9.0×107 cp/ul和4.0×106～1.0×108 cp/μl)；其中2份48 h培养UU阳性而FQ-PCR为阴性，细菌学鉴定证明其为细菌污染所致。因此，UU培养以24 h观察结果为宜。
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3.3种PCR方法检测UU-DNA结果比较：100份标本经UU培养鉴定阳性为64份，阴性36份，用3 种PCR试验作比较分析。结果：FQ-PCR、PCR-hyb和PCR阳性者分别为64、57和54份。经Lenke计算方法统计分析[4]，其准确性分别为100%、92.9%和89.8%，FQ-PCR法敏感性和特异性为100%，未发现假阳性和假阴性；PCR-hyb法敏感性和特异性为89.1%和100%，假阴性10.9%；PCR法敏感性和特异性为84.4%，和94.4%，假阳性和假阴性为5.6%和15.6%。
三、讨论
对于UU感染的病原学诊断，通常可用简便的培养法筛查，但阳性率偏低。近年来应用PCR检测UU-DNA，提高了UU检出率。但鉴于目前国内尚无标准诊断试剂盒和实验操作技术不规范，因PCR污染所造成的假阳性，给临床诊断造成混乱。荧光探针定量PCR用于病原学诊断，是PCR技术领域的一项创新。我们采用中山医科大学达安基因诊断中心研制的UU-DNA检测试剂盒，并与UU培养、PCR、PCR-杂交梳作了比较研究。结果表明，FQ-PCR具有良好的敏感性和特异性，并可定量检测临床标本中UU-DNA。对于孕期UU感染的诊断，及其围生儿并发症的诊断，在科研工作方面应用具有一定的价值。
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基金项目：1996年度卫生部科研基金和优秀青年人才基金项目(96-2-261)
作者单位：朱庆义(030013 太原，山西省儿童医院分子微生物室)
李连青(030013 太原，山西省儿童医院分子微生物室)
周向红(030013 太原，山西省儿童医院分子微生物室)
刘建萍(030013 太原，山西省儿童医院分子微生物室)
张邦骤(中山医科大学达安基因诊断中心)
杨国福(中山医科大学达安基因诊断中心)
何蕴韶(中山医科大学达安基因诊断中心)
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1，Abele-Hern M, Wolff C, Dressel P, et al. Association of Ureaplasma urealyticum biovars with clinical outcome for neonates, obstetric patients, and gynecological patients with pelvic inflammatory disease. J Clin Microbiol, 1997，35:1199-1201.
2，Tang K , Li M, Yu W, et al. Compareson of PCR with culture for detection of Ureaplasma urealyticum in clinical samples from patients with urogenital infections. J Clin Microbiol, 1994, 32:2332-2234.
3，Wang XP, Zhu QY. Detection of genes for Ureaplasma urealyticum in clinical samples from women with genitourinary infection by PCR. US Chin Heal Hyg J, 1999，2:60-64.
4，Lenke RR. The efficacy of the nitrite test and microscopic urinelysis in predicting urine culture results. Am J Obstet Gynecol, 1981,140:427-430., 百拇医药