高能震波治疗骨不连接的实验研究
高能震波治疗骨不连接的实验研究
李晓林 余楠生 杜靖远 饶振玉 朱通伯
摘 要 目的 观察高能震波( high energy shock waves, HESW)对骨愈合的影响,探讨促进骨折愈合的新方法。 方法 手术造成50只家兔双侧胫骨中段6 mm骨缺损后用外固定器固定。12周后选择经X线片检查证实的68侧胫骨骨不连接，随机分成两组进行研究。治疗组34侧，对其胫骨骨折部施以 HESW治疗(14.5 kV, 2 000次)；对照组34侧，不加任何治疗。术后2，6，12 周进行摄片、组织学及透射电镜检查。 结果 对照侧均为骨不连接,治疗组除5只仍为萎缩性骨不连接外,均获得骨愈合(P<0.01)。 结论 HESW能够刺激骨痂形成，促进骨折愈合，可望成为一种可靠的、非手术治疗骨不连接和骨折延迟愈合的新方法。
关键词：骨折，不愈合；高能震波；碎石术
, 百拇医药
骨折后骨不连接、骨折延迟愈合的治疗是骨科临床的重要课题。许多种治疗方法被提出并加以研究，其中非手术治疗方法有电刺激、脉冲电磁场和超声波刺激等，但这些治疗方法均因其疗效不稳定而未得到广泛的临床应用[1]。为了寻找促进骨折愈合的新途径,国外学者在实验研究中观察了高能震波(high energy shock waves, HESW)对骨愈合的影响,结果发现HESW可以促进骨折愈合[2-4]。为了进一步研究HESW 对骨折愈合的影响,笔者进行了本项研究,以观察HESW 对骨不连接的治疗效果。
材料与方法
1. 骨不连接动物模型建立及分组：选用雄性健康家兔50只,造成双侧胫骨中段长6 mm骨缺损(连同骨膜一起仔细切除, 骨折断端髓腔用骨蜡封闭)[[5],然后用外固定装置固定,保持骨折断端间距6 mm,冲净碎骨末后缝合伤口。12周后摄X线片观察,证实有68侧胫骨骨不连接(骨折线存在,骨折端间隙最小0.5 mm, 最大 3 mm ,平均1.5 mm。骨端硬化,无桥接骨痂)，其中肥大型骨不连接53侧,萎缩型15侧。将这68侧胫骨骨不连接随机分成两组进行研究。治疗组34侧，其中萎缩型8侧；对照组34侧，其中萎缩型7侧。外固定支架不调整，保持骨折端间隙不做处理；实验动物肢体允许自由负重、活动。
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2. 高能震波治疗实验: 采用北京 700厂生产的 ESWL-I/ZM 体外震波碎石机进行治疗实验。工作电压为14.5 kV,能量为 0.54 mJ/mm2，震波频率为 100次/min,震波剂量为2 000次。家兔用质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠静脉注射麻醉(1 mg/kg)后,固定于碎石机架上。治疗组胫骨浸入水槽中,第2焦点分别对准近、远侧骨折端各施1 000次HESW。对照组不做任何治疗。
3. X线摄片检查:分别于治疗后2，6，12周时,摄X 线片观察骨折愈合情况。
4. 组织学检查:于HESW治疗后2，6，12周时,分别处死家兔, 取骨痂标本做石蜡切片,HE染色后行光镜检查。
5. 透射电镜检查：取HESW治疗后2周骨痂标本,用质量浓度为20 g/L的戊二醛前固定, 用质量浓度为10 g/L的锇酸后固定,逐级酒精脱水,环氧丙烷过渡,环氧树脂包埋,制成超薄切片, 在日立H-500透射电镜下观察。
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6. 统计学处理：采用χ2检验。
结果
1. X线检查结果(表1):表1所示,HESW治疗后6周，X线片示治疗组28侧中23侧骨折端可见骨痂形成，其中有6侧可见到有连续骨痂通过骨折线；12周后治疗组22侧中17侧骨折愈合(骨折线消失，有连续骨痂通过骨折端)， 5侧未愈合(均为萎缩型骨不连)。而对照组无一侧骨愈合。经χ2检验，P<0.01，差异有非常显著性意义。
表1 HESW治疗后X线片观察结果
组别
侧数
时间
(周)
, 百拇医药
骨痂量
无
少量
大量
连续
治疗组
34
2
34
0
0
0
对照组
34
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2
34
0
0
0
治疗组
28
6
5
4
13
6
对照组
28
, 百拇医药
6
28
0
0
0
治疗组
22
12
2**
3
0
17
对照组
, 百拇医药 22
12
22
0
0
0
与对照组比较：**P<0.01 2. 组织学观察结果: HESW治疗 2周,组织切片观察见治疗组在骨膜外、骨折端周围有间充质细胞增殖，新生骨小梁产生，骨折断端中央缺损处纤维组织及软骨组织充填。而对照组未见到间充质细胞增殖反应。6周时切片观察治疗组有大量外骨痂形成,并可见到软骨骨化。对照组均未见骨痂形成及骨化现象。12周时治疗组除5侧未发生骨性连接外,其余均骨愈合。对照组骨折处仍为纤维组织、软骨组织充填。
3. 透射电镜观察: HESW治疗2周后, 骨痂超薄切片透射电镜观察发现，治疗组骨痂中有大量功能活跃的成骨细胞,细胞呈卵圆形,核也呈卵圆形,细胞质内有极丰富的粗面内质网和大量线粒体及高尔基体。成骨细胞分泌典型胶原纤维,其长轴上有6.4 nm周期性横纹 (图1, 2 )。而在对照组骨痂中见大量成纤维细胞,呈狭长形,粗面内质网膨大呈圆形,细胞排列杂乱,细胞周围的胶原纤丝排列杂乱。另外, 还可见到大量变性的软骨细胞,细胞可见膨大的粗面内质网、空泡和大小不等的脂滴,间质内胶原纤丝杂乱排列，无周期性横纹 (图3, 4 )。 结果提示治疗组出现成骨活动，而对照组仍停留在纤维愈合阶段。
, 百拇医药
图1 HESW治疗后第2周，骨痂内见大量功能活跃的成骨细胞，分泌合成大量胶原纤维 ×5 000
图2 HESW治疗后第2周，骨痂内成骨细胞分泌合成大量胶原纤维，排列整齐，可见典型6.4 nm周期性横纹 ×15 000
图3 第2周对照组骨痂内见大量成纤维细胞，间质纤维排列紊乱，无周期性横纹 ×5 000
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图4 第2周对照组骨痂内见大量变性的软骨细胞，间质纤维排列紊乱，无周期性横纹 ×5 000
讨论
1. HESW治疗骨不连接的机制: HESW治疗骨不连接、骨折延迟愈合的机制目前还处于探索和研究阶段。Johannes等[1]认为,HESW可以击碎硬化的骨端并使其产生微裂隙,这些刺激可以增加骨折局部的血供。另外, HESW 所产生的大量碎骨片可以刺激成骨而使骨折愈合。Scheberger等[4]则认为, HESW治疗骨不连接是由于HESW具有骨诱导的生物学效应,从而使骨折端间软组织被骨组织所取代, 产生骨愈合。本实验证实了HESW的这种骨诱导效应。HESW作为一种机械刺激,可以造成骨折局部组织细胞损伤,产生微骨折和大量细小碎骨片。这种再次损伤性刺激,使本来已愈合的组织再次发生反应,释放大量成骨活性物质，尤其是使骨折部位诱导成骨效应及骨形态发生蛋白(BMP)的浓度大大增加[6],从而使纤维组织逐步被骨组织取代,获得骨性愈合。
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2. HESW治疗的能量和剂量选择:实验研究表明,HESW对组织细胞的损伤效应随着HESW 的能量水平和震波次数(剂量)的增加而呈剂量依赖性增加[7]。Haupt等[2，8]认为，低能量密度的HESW可以刺激骨折和伤口的愈合,而较高能量密度的震波则有抑制作用。HESW 治疗的能量强度和剂量的最佳参数目前还没有明确的结论。Kaulesar等[9]在体外研究了不同剂量和能量的HESW对兔皮质骨作用效应,发现高能量的HESW(21.1 kV, 0.6 mJ/mm2)可以造成皮质骨的严重破坏,甚至发生完全性骨折。而当能量在14.5 kV， 0.54 mJ/mm2水平以下时,可见剥脱皮质骨、骨碎片(直径 0.1～3 mm ),但未见更严重的骨破坏和完全性骨折。他们还发现，施以HESW 1 000～2 000次时开始见到损伤效应发生,而当震波次数超过5 000次以上则不会发生更多的改变。说明HESW的效应是剂量依赖性的和可饱和性的。
, 百拇医药
通过以上实验结果可以推论, 高能震波可改善骨折局部血供,刺激骨痂形成,使骨折部位纤维、软骨组织骨化,获得骨折愈合。HESW可望成为一种可靠的非手术治疗骨不连接、 骨折延迟愈合的新方法。
基金项目：广东省卫生厅资助项目(B1998059)
作者单位：李晓林(510120 广州医学院第一附属医院骨科)
余楠生(510120 广州医学院第一附属医院骨科)
杜靖远(同济医科大学附属协和医院骨科)
饶振玉(同济医科大学附属协和医院骨科)
朱通伯(同济医科大学附属协和医院骨科)
参考文献
, 百拇医药
1，Johannes EJ, Kaulesar Sukul DMSK, Mature E. High energy shock waves for treatment of nonunions: an experiment on dogs. J Surg Res,1994,57:246-252.
2，Haupt G. Use of extracorporeal shock waves in the treatment of pseudarthrosis, tendinopathy and other orthopedic diseases. J Urol, 1997, 158:4-11.
3，Vogel J, Hopf C, Eysel P, et al. Application of extracorporeal shockwaves in the treatment of pseudarthrosis of the lower extremity. Preliminary results. Arch Orthop Trauma Surg, 1997,116:480-483.
, 百拇医药
4，Scheberger R, Senge T. Non-invasive treatment of long-bone pseudarthrosis by shock waves. Arch Orthop Trauma Surg, 1992,111:224-227.
5，Tiedeman JJ, Conolly JF, Strates BS, et al. Treatment of nonunion by percutaneous injection of bone marrow and demineralized bone matrix. Clin Orthop, 1991,(268):294-299.
6，李晓林，余楠生, 杜靖远，等.高能震波对骨痂中骨形成蛋白表达的影响.中华骨科杂志,1999,19:295-298.
7，Kohn K. Cytocidal effect of high energy shock waves on tumor cells. Urol Res, 1990,18:101-104.
8，Haupt G, Chvapil M. Effect of high energy shock waves on the healing of partial thickness wounds in piglets. J Surg Res, 1990,49:45-49.
9，Kaulesar SD, Johannes EJ, Pieric EGJM, et al. The effect of high energy shock waves focused on cortical bone: an in vitro study. J Surg Res, 1993,54:46-51., 百拇医药
李晓林 余楠生 杜靖远 饶振玉 朱通伯
摘 要 目的 观察高能震波( high energy shock waves, HESW)对骨愈合的影响,探讨促进骨折愈合的新方法。 方法 手术造成50只家兔双侧胫骨中段6 mm骨缺损后用外固定器固定。12周后选择经X线片检查证实的68侧胫骨骨不连接，随机分成两组进行研究。治疗组34侧，对其胫骨骨折部施以 HESW治疗(14.5 kV, 2 000次)；对照组34侧，不加任何治疗。术后2，6，12 周进行摄片、组织学及透射电镜检查。 结果 对照侧均为骨不连接,治疗组除5只仍为萎缩性骨不连接外,均获得骨愈合(P<0.01)。 结论 HESW能够刺激骨痂形成，促进骨折愈合，可望成为一种可靠的、非手术治疗骨不连接和骨折延迟愈合的新方法。
关键词：骨折，不愈合；高能震波；碎石术
, 百拇医药
骨折后骨不连接、骨折延迟愈合的治疗是骨科临床的重要课题。许多种治疗方法被提出并加以研究，其中非手术治疗方法有电刺激、脉冲电磁场和超声波刺激等，但这些治疗方法均因其疗效不稳定而未得到广泛的临床应用[1]。为了寻找促进骨折愈合的新途径,国外学者在实验研究中观察了高能震波(high energy shock waves, HESW)对骨愈合的影响,结果发现HESW可以促进骨折愈合[2-4]。为了进一步研究HESW 对骨折愈合的影响,笔者进行了本项研究,以观察HESW 对骨不连接的治疗效果。
材料与方法
1. 骨不连接动物模型建立及分组：选用雄性健康家兔50只,造成双侧胫骨中段长6 mm骨缺损(连同骨膜一起仔细切除, 骨折断端髓腔用骨蜡封闭)[[5],然后用外固定装置固定,保持骨折断端间距6 mm,冲净碎骨末后缝合伤口。12周后摄X线片观察,证实有68侧胫骨骨不连接(骨折线存在,骨折端间隙最小0.5 mm, 最大 3 mm ,平均1.5 mm。骨端硬化,无桥接骨痂)，其中肥大型骨不连接53侧,萎缩型15侧。将这68侧胫骨骨不连接随机分成两组进行研究。治疗组34侧，其中萎缩型8侧；对照组34侧，其中萎缩型7侧。外固定支架不调整，保持骨折端间隙不做处理；实验动物肢体允许自由负重、活动。
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2. 高能震波治疗实验: 采用北京 700厂生产的 ESWL-I/ZM 体外震波碎石机进行治疗实验。工作电压为14.5 kV,能量为 0.54 mJ/mm2，震波频率为 100次/min,震波剂量为2 000次。家兔用质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠静脉注射麻醉(1 mg/kg)后,固定于碎石机架上。治疗组胫骨浸入水槽中,第2焦点分别对准近、远侧骨折端各施1 000次HESW。对照组不做任何治疗。
3. X线摄片检查:分别于治疗后2，6，12周时,摄X 线片观察骨折愈合情况。
4. 组织学检查:于HESW治疗后2，6，12周时,分别处死家兔, 取骨痂标本做石蜡切片,HE染色后行光镜检查。
5. 透射电镜检查：取HESW治疗后2周骨痂标本,用质量浓度为20 g/L的戊二醛前固定, 用质量浓度为10 g/L的锇酸后固定,逐级酒精脱水,环氧丙烷过渡,环氧树脂包埋,制成超薄切片, 在日立H-500透射电镜下观察。
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6. 统计学处理：采用χ2检验。
结果
1. X线检查结果(表1):表1所示,HESW治疗后6周，X线片示治疗组28侧中23侧骨折端可见骨痂形成，其中有6侧可见到有连续骨痂通过骨折线；12周后治疗组22侧中17侧骨折愈合(骨折线消失，有连续骨痂通过骨折端)， 5侧未愈合(均为萎缩型骨不连)。而对照组无一侧骨愈合。经χ2检验，P<0.01，差异有非常显著性意义。
表1 HESW治疗后X线片观察结果
组别
侧数
时间
(周)
, 百拇医药
骨痂量
无
少量
大量
连续
治疗组
34
2
34
0
0
0
对照组
34
, http://www.100md.com
2
34
0
0
0
治疗组
28
6
5
4
13
6
对照组
28
, 百拇医药
6
28
0
0
0
治疗组
22
12
2**
3
0
17
对照组
, 百拇医药 22
12
22
0
0
0
与对照组比较：**P<0.01 2. 组织学观察结果: HESW治疗 2周,组织切片观察见治疗组在骨膜外、骨折端周围有间充质细胞增殖，新生骨小梁产生，骨折断端中央缺损处纤维组织及软骨组织充填。而对照组未见到间充质细胞增殖反应。6周时切片观察治疗组有大量外骨痂形成,并可见到软骨骨化。对照组均未见骨痂形成及骨化现象。12周时治疗组除5侧未发生骨性连接外,其余均骨愈合。对照组骨折处仍为纤维组织、软骨组织充填。
3. 透射电镜观察: HESW治疗2周后, 骨痂超薄切片透射电镜观察发现，治疗组骨痂中有大量功能活跃的成骨细胞,细胞呈卵圆形,核也呈卵圆形,细胞质内有极丰富的粗面内质网和大量线粒体及高尔基体。成骨细胞分泌典型胶原纤维,其长轴上有6.4 nm周期性横纹 (图1, 2 )。而在对照组骨痂中见大量成纤维细胞,呈狭长形,粗面内质网膨大呈圆形,细胞排列杂乱,细胞周围的胶原纤丝排列杂乱。另外, 还可见到大量变性的软骨细胞,细胞可见膨大的粗面内质网、空泡和大小不等的脂滴,间质内胶原纤丝杂乱排列，无周期性横纹 (图3, 4 )。 结果提示治疗组出现成骨活动，而对照组仍停留在纤维愈合阶段。
, 百拇医药
图1 HESW治疗后第2周，骨痂内见大量功能活跃的成骨细胞，分泌合成大量胶原纤维 ×5 000
图2 HESW治疗后第2周，骨痂内成骨细胞分泌合成大量胶原纤维，排列整齐，可见典型6.4 nm周期性横纹 ×15 000
图3 第2周对照组骨痂内见大量成纤维细胞，间质纤维排列紊乱，无周期性横纹 ×5 000
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图4 第2周对照组骨痂内见大量变性的软骨细胞，间质纤维排列紊乱，无周期性横纹 ×5 000
讨论
1. HESW治疗骨不连接的机制: HESW治疗骨不连接、骨折延迟愈合的机制目前还处于探索和研究阶段。Johannes等[1]认为,HESW可以击碎硬化的骨端并使其产生微裂隙,这些刺激可以增加骨折局部的血供。另外, HESW 所产生的大量碎骨片可以刺激成骨而使骨折愈合。Scheberger等[4]则认为, HESW治疗骨不连接是由于HESW具有骨诱导的生物学效应,从而使骨折端间软组织被骨组织所取代, 产生骨愈合。本实验证实了HESW的这种骨诱导效应。HESW作为一种机械刺激,可以造成骨折局部组织细胞损伤,产生微骨折和大量细小碎骨片。这种再次损伤性刺激,使本来已愈合的组织再次发生反应,释放大量成骨活性物质，尤其是使骨折部位诱导成骨效应及骨形态发生蛋白(BMP)的浓度大大增加[6],从而使纤维组织逐步被骨组织取代,获得骨性愈合。
, http://www.100md.com
2. HESW治疗的能量和剂量选择:实验研究表明,HESW对组织细胞的损伤效应随着HESW 的能量水平和震波次数(剂量)的增加而呈剂量依赖性增加[7]。Haupt等[2，8]认为，低能量密度的HESW可以刺激骨折和伤口的愈合,而较高能量密度的震波则有抑制作用。HESW 治疗的能量强度和剂量的最佳参数目前还没有明确的结论。Kaulesar等[9]在体外研究了不同剂量和能量的HESW对兔皮质骨作用效应,发现高能量的HESW(21.1 kV, 0.6 mJ/mm2)可以造成皮质骨的严重破坏,甚至发生完全性骨折。而当能量在14.5 kV， 0.54 mJ/mm2水平以下时,可见剥脱皮质骨、骨碎片(直径 0.1～3 mm ),但未见更严重的骨破坏和完全性骨折。他们还发现，施以HESW 1 000～2 000次时开始见到损伤效应发生,而当震波次数超过5 000次以上则不会发生更多的改变。说明HESW的效应是剂量依赖性的和可饱和性的。
, 百拇医药
通过以上实验结果可以推论, 高能震波可改善骨折局部血供,刺激骨痂形成,使骨折部位纤维、软骨组织骨化,获得骨折愈合。HESW可望成为一种可靠的非手术治疗骨不连接、 骨折延迟愈合的新方法。
基金项目：广东省卫生厅资助项目(B1998059)
作者单位：李晓林(510120 广州医学院第一附属医院骨科)
余楠生(510120 广州医学院第一附属医院骨科)
杜靖远(同济医科大学附属协和医院骨科)
饶振玉(同济医科大学附属协和医院骨科)
朱通伯(同济医科大学附属协和医院骨科)
参考文献
, 百拇医药
1，Johannes EJ, Kaulesar Sukul DMSK, Mature E. High energy shock waves for treatment of nonunions: an experiment on dogs. J Surg Res,1994,57:246-252.
2，Haupt G. Use of extracorporeal shock waves in the treatment of pseudarthrosis, tendinopathy and other orthopedic diseases. J Urol, 1997, 158:4-11.
3，Vogel J, Hopf C, Eysel P, et al. Application of extracorporeal shockwaves in the treatment of pseudarthrosis of the lower extremity. Preliminary results. Arch Orthop Trauma Surg, 1997,116:480-483.
, 百拇医药
4，Scheberger R, Senge T. Non-invasive treatment of long-bone pseudarthrosis by shock waves. Arch Orthop Trauma Surg, 1992,111:224-227.
5，Tiedeman JJ, Conolly JF, Strates BS, et al. Treatment of nonunion by percutaneous injection of bone marrow and demineralized bone matrix. Clin Orthop, 1991,(268):294-299.
6，李晓林，余楠生, 杜靖远，等.高能震波对骨痂中骨形成蛋白表达的影响.中华骨科杂志,1999,19:295-298.
7，Kohn K. Cytocidal effect of high energy shock waves on tumor cells. Urol Res, 1990,18:101-104.
8，Haupt G, Chvapil M. Effect of high energy shock waves on the healing of partial thickness wounds in piglets. J Surg Res, 1990,49:45-49.
9，Kaulesar SD, Johannes EJ, Pieric EGJM, et al. The effect of high energy shock waves focused on cortical bone: an in vitro study. J Surg Res, 1993,54:46-51., 百拇医药