老年2型糖尿病患者胰岛素启动子的检测
老年2型糖尿病患者胰岛素启动子的检测
詹晓蓉 阴慧清 石晓丽 刘晓民 段滨红 崔丽娟
关键词：老年人；2型糖尿病；胰岛素；启动子 近年研究表明，胰岛素抵抗是引起2型糖尿病发生的重要危险因素〔1〕，但引起胰岛素抵抗的分子生物学基础还不十分清楚，有学者推测胰岛素启动子的变异是胰岛素抵抗产生的原因之一〔2〕，我们就此进行了检测。
一、对象与方法
1.对象：89例2型糖尿病患者(均为1997年1月至1998年1月在本院就诊的黑龙江地区汉族患者 )，符合WHO糖尿病诊断标准，男58例，女31例，年龄60～70岁，平均63.4岁，未经胰岛素治疗，血浆胰岛素(22.6±3.3)mIU/L。无糖尿病家族史的健康对照组50例，男28例，女22例，年龄60～70岁，平均61.6岁，血浆胰岛素(11.9±5.8)mIU/L。
, 百拇医药
2.研究方法：胰岛素启动子扩增:酚-氯仿法抽提外周血白细胞DNA,以5'-TCTGGGGACAGCAGCGCAAAGAG-3'为上游引物,5'-CTGGGCCCCCGCTGGCTTTATAG-3'为下游引物(TaKaRa大连分公司合成)。行PCR,扩增出胰岛素启动子(扩增片断长度为363个碱基)，产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实。同位素单链构象多态性(SSCP)筛选变异体：配制8%聚丙烯酰胺凝胶，取PCR产物5 μl，加变性上样液5 μl，置90℃水浴10 min，迅移至冰上5 min，在室温下以8 V/cm电泳约1.5 h。后银染，顺序为10%乙醇10 min、10%硝酸10 min、0.012 mol/L硝酸银30 min、0.28 mol/L碳酸钠5 min,以10%冰醋酸中止反应，透气膜封装。人胰岛素基因启动子序列的测定：AB1 PRISMTM 377 DNA Seque全自动序列分析仪对PCR产物直接进行测序。
二、结果
, 百拇医药 1.胰岛素启动子的PCR扩增：糖尿病组及对照组共139例，其PCR产物行1%的琼脂糖凝胶电泳，扩增出一条约363 bp的DNA带，与理论上的胰岛素启动子DNA片段相符，所有样本结果一致，均未发现异常电泳带。见图1。
1、2为健康对照者，3～7为2型糖尿病患者，M为标准分子量
图1 胰岛素启动子扩增片段琼脂糖电泳
2.胰岛素启动子PCR-SSCP分析结果：行分辨率较高的聚丙烯酰胺凝脂电泳，对139例样本进行分析，亦未发现异常泳动变位。见图2。
1～7为2型糖尿病患者，8～9为健康对照，M为标准分子量
图2 胰岛素启动子PCR-SSCP分析结果
3.胰岛素启动子序列的测定:随机抽取的8例2型糖尿病患者胰岛素启动子的PCR产物进行测序,结果其序列与健康对照组胰岛素启动子序列完全相同。
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三、讨论
部分2型糖尿病患者体内存在变异的胰岛素，1992年Olansky等〔2〕对40例美国黑人2型糖尿病患者胰岛素启动子进行检测，发现2例变异，将变异的胰岛素启动子在真核细胞里表达，发现启动子活性降低，从而推测变异的启动子与2型糖尿病发病有关。我们检测89例有遗传史的2型糖尿病患者，未发现一例变异，故推测黑龙江地区的汉族人胰岛素启动子突变的发生率极低或与糖尿病不存在关联。此研究所选的患者均存在明显胰岛素抵抗，且样本量远超过Olansky的报道，而我们采用的PCR-SSCP银染技术对单基因的突变检测有高度敏感性，为进一步证实所得结果，我们又把胰岛素启动子 基因克隆到质粒载体中随机抽取8例进行了测序，其核酸排列顺序与健康人的完全一致。因此，我们推测2型糖尿病患者异常胰岛素可能来自结构基因(即编码区的突变)，而胰岛素的启动子作为调节基因的一部分在参与2型糖尿病的发病方面可能存在种族或地域的异质性。
基金项目：黑龙江省自然基金资助(编号9509)
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作者单位：詹晓蓉(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
阴慧清(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
石晓丽(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
刘晓民(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
段滨红(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
崔丽娟(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
参考文献1，Groop LC.Insulin resistance:the fundamental trigger of type 2 diabetes.Obesity & Metabolism,1999,1:2-9.
2，Olansky L,Cris W, Stephen G,et al.Variability of the insulin gene in Am erican blacks with NIDDM.Diabetes,1992,41:742-749., 百拇医药
詹晓蓉 阴慧清 石晓丽 刘晓民 段滨红 崔丽娟
关键词：老年人；2型糖尿病；胰岛素；启动子 近年研究表明，胰岛素抵抗是引起2型糖尿病发生的重要危险因素〔1〕，但引起胰岛素抵抗的分子生物学基础还不十分清楚，有学者推测胰岛素启动子的变异是胰岛素抵抗产生的原因之一〔2〕，我们就此进行了检测。
一、对象与方法
1.对象：89例2型糖尿病患者(均为1997年1月至1998年1月在本院就诊的黑龙江地区汉族患者 )，符合WHO糖尿病诊断标准，男58例，女31例，年龄60～70岁，平均63.4岁，未经胰岛素治疗，血浆胰岛素(22.6±3.3)mIU/L。无糖尿病家族史的健康对照组50例，男28例，女22例，年龄60～70岁，平均61.6岁，血浆胰岛素(11.9±5.8)mIU/L。
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2.研究方法：胰岛素启动子扩增:酚-氯仿法抽提外周血白细胞DNA,以5'-TCTGGGGACAGCAGCGCAAAGAG-3'为上游引物,5'-CTGGGCCCCCGCTGGCTTTATAG-3'为下游引物(TaKaRa大连分公司合成)。行PCR,扩增出胰岛素启动子(扩增片断长度为363个碱基)，产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实。同位素单链构象多态性(SSCP)筛选变异体：配制8%聚丙烯酰胺凝胶，取PCR产物5 μl，加变性上样液5 μl，置90℃水浴10 min，迅移至冰上5 min，在室温下以8 V/cm电泳约1.5 h。后银染，顺序为10%乙醇10 min、10%硝酸10 min、0.012 mol/L硝酸银30 min、0.28 mol/L碳酸钠5 min,以10%冰醋酸中止反应，透气膜封装。人胰岛素基因启动子序列的测定：AB1 PRISMTM 377 DNA Seque全自动序列分析仪对PCR产物直接进行测序。
二、结果
, 百拇医药 1.胰岛素启动子的PCR扩增：糖尿病组及对照组共139例，其PCR产物行1%的琼脂糖凝胶电泳，扩增出一条约363 bp的DNA带，与理论上的胰岛素启动子DNA片段相符，所有样本结果一致，均未发现异常电泳带。见图1。
1、2为健康对照者，3～7为2型糖尿病患者，M为标准分子量
图1 胰岛素启动子扩增片段琼脂糖电泳
2.胰岛素启动子PCR-SSCP分析结果：行分辨率较高的聚丙烯酰胺凝脂电泳，对139例样本进行分析，亦未发现异常泳动变位。见图2。
1～7为2型糖尿病患者，8～9为健康对照，M为标准分子量
图2 胰岛素启动子PCR-SSCP分析结果
3.胰岛素启动子序列的测定:随机抽取的8例2型糖尿病患者胰岛素启动子的PCR产物进行测序,结果其序列与健康对照组胰岛素启动子序列完全相同。
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三、讨论
部分2型糖尿病患者体内存在变异的胰岛素，1992年Olansky等〔2〕对40例美国黑人2型糖尿病患者胰岛素启动子进行检测，发现2例变异，将变异的胰岛素启动子在真核细胞里表达，发现启动子活性降低，从而推测变异的启动子与2型糖尿病发病有关。我们检测89例有遗传史的2型糖尿病患者，未发现一例变异，故推测黑龙江地区的汉族人胰岛素启动子突变的发生率极低或与糖尿病不存在关联。此研究所选的患者均存在明显胰岛素抵抗，且样本量远超过Olansky的报道，而我们采用的PCR-SSCP银染技术对单基因的突变检测有高度敏感性，为进一步证实所得结果，我们又把胰岛素启动子 基因克隆到质粒载体中随机抽取8例进行了测序，其核酸排列顺序与健康人的完全一致。因此，我们推测2型糖尿病患者异常胰岛素可能来自结构基因(即编码区的突变)，而胰岛素的启动子作为调节基因的一部分在参与2型糖尿病的发病方面可能存在种族或地域的异质性。
基金项目：黑龙江省自然基金资助(编号9509)
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作者单位：詹晓蓉(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
阴慧清(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
石晓丽(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
刘晓民(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
段滨红(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
崔丽娟(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科)
参考文献1，Groop LC.Insulin resistance:the fundamental trigger of type 2 diabetes.Obesity & Metabolism,1999,1:2-9.
2，Olansky L,Cris W, Stephen G,et al.Variability of the insulin gene in Am erican blacks with NIDDM.Diabetes,1992,41:742-749., 百拇医药