性传播人乳头瘤病毒16型调查及L1区片段的序列分析
性传播人乳头瘤病毒16型调查及L1区片段的序列分析
董学君 张国荣 王少波 徐国强 叶飞 胡若愚
关键词：人；乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV) 人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是性传播疾病中常见的病原体。已记载的HPV有80多种型，其中HPV16型肯定与宫颈癌发生相关[1]。近年，HPV的感染率急剧上升，危害极大；而HPV至今还不能体外培养，分子生物学手段检测是当今最可靠的方法。本研究选最常用的L1区引物行聚合酶链反应(PCR)并将其产物测序，以调查性传播HPV16型及其变异情况。
一、材料与方法
1.标本来源：本院就诊的性病患者中，经确诊为HPV感染者共276例(男性55，女性221)。年龄3～61岁。
, 百拇医药
2.酶及化学试剂：TaqDNA聚合酶(Promega公司产品)。引物由GIBCO-BRL公司合成，序列为：P1：5′-AATGCTA-GTGCTTAT-GCAGC-3′，P2： 5′-ATTTACTGCAACATTGGGTAC- 3′，产物片段153 bp。
3.标本处理及PCR扩增：参照说明书。
4.PCR产物电泳及结果鉴定 ：产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，DNA分子量为对照。紫外分析仪上观察结果。出现特定条带者为阳性。
5.DNA序列测定：ALF自动测序仪上进行，测序反应参照说明书。
6.探针标记及Southern杂交：探针标记和Southern杂交参照说明书进行。
二、结果
, 百拇医药
1.HPV16型感染率：276例中，HPV16型22例，占7.97 %(22/276)；其中男性3例，女性19例；女性的19例中有3例为无症状感染。
2.HPV16型扩增产物测序：对全部HPV16型阳性的扩增产物测序，碱基序列经国际联网BLAST检索，结果有3例同源性为99%，均为一个碱基插入；其余的同源性为100%。
3.Southern杂交分析：用α-32P-dCTP标记的已测序列为特异性探针,对HPV16-PCR产物行Southern杂交分析，结果均见杂交斑。证明PCR产物是预期的特异性片段。
三、讨论
HPV16感染为整合型感染,它与宫颈癌的发生、发展密切相关[2]。近年HPV16致癌机理的研究表明：HPV16的E6蛋白能特异性地与野生型P53结合并在E6相关蛋白参与下，通过依赖于辅酶的蛋白水解系统致P53降解、灭活，HPV16还可经插入方式整合到染色体的某一位点致P53突变[3]；目前认为以上作用是HPV16致癌的关键步骤。由于HPV16系致癌高危型，因此早期诊治十分重要。据魏军等[4]报道，用微孔板杂交分型法检测宫颈活检刮片，HPV16的阳性率为67.5%(27/40)。无症状的HPV16感染不易被觉察，因此危害性更大；本组HPV16型阳性的女性中有15.8%(3/19)为无症状，提示HPV感染的实验室诊断并分型对诊治和预防癌变有较大的意义和价值。
, 百拇医药
本研究发现HPV16型L1区有一新的变异，即第526～527位碱基间插入碱基C，经国际联网检索查新，系至今尚未见报告的变异。L1基因编码的是主要衣壳蛋白，该蛋白能刺激机体产生保护性抗体。该变异可能会导致其蛋白的免疫原性变化，因此，本结果对基因工程疫苗的制备具有较大的参考价值。
作者单位：董学君(312000浙江省绍兴市人民医院中心实验室)
叶飞(312000浙江省绍兴市人民医院中心实验室)
胡若愚(312000浙江省绍兴市人民医院中心实验室)
张国荣(312000浙江省绍兴市人民医院妇产科)
王少波(312000浙江省绍兴市人民医院泌尿科)
徐国强(312000浙江省绍兴市人民医院泌尿科)
, http://www.100md.com
参考文献
1，Zur Hausen H. Human papillomaviruses in the pathogenesis of anogenital cancer.Virology，1991，184:9-13.
2，Lowy D R, Kirnbauer R,Schiller J T. Genital human papillomavirus infection. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:2436-2440.
3，笪冀平，胡益云，陈乐真，等. 肺癌人乳头瘤病毒感染与P53基因突变的研究.中华肿瘤杂志,1996,18:27.
4，魏军，张正. 人乳头瘤病毒PCR产物酶标-微孔板杂交分型. 中华医学检验杂志，1998，21：170-172., 百拇医药
董学君 张国荣 王少波 徐国强 叶飞 胡若愚
关键词：人；乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV) 人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是性传播疾病中常见的病原体。已记载的HPV有80多种型，其中HPV16型肯定与宫颈癌发生相关[1]。近年，HPV的感染率急剧上升，危害极大；而HPV至今还不能体外培养，分子生物学手段检测是当今最可靠的方法。本研究选最常用的L1区引物行聚合酶链反应(PCR)并将其产物测序，以调查性传播HPV16型及其变异情况。
一、材料与方法
1.标本来源：本院就诊的性病患者中，经确诊为HPV感染者共276例(男性55，女性221)。年龄3～61岁。
, 百拇医药
2.酶及化学试剂：TaqDNA聚合酶(Promega公司产品)。引物由GIBCO-BRL公司合成，序列为：P1：5′-AATGCTA-GTGCTTAT-GCAGC-3′，P2： 5′-ATTTACTGCAACATTGGGTAC- 3′，产物片段153 bp。
3.标本处理及PCR扩增：参照说明书。
4.PCR产物电泳及结果鉴定 ：产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，DNA分子量为对照。紫外分析仪上观察结果。出现特定条带者为阳性。
5.DNA序列测定：ALF自动测序仪上进行，测序反应参照说明书。
6.探针标记及Southern杂交：探针标记和Southern杂交参照说明书进行。
二、结果
, 百拇医药
1.HPV16型感染率：276例中，HPV16型22例，占7.97 %(22/276)；其中男性3例，女性19例；女性的19例中有3例为无症状感染。
2.HPV16型扩增产物测序：对全部HPV16型阳性的扩增产物测序，碱基序列经国际联网BLAST检索，结果有3例同源性为99%，均为一个碱基插入；其余的同源性为100%。
3.Southern杂交分析：用α-32P-dCTP标记的已测序列为特异性探针,对HPV16-PCR产物行Southern杂交分析，结果均见杂交斑。证明PCR产物是预期的特异性片段。
三、讨论
HPV16感染为整合型感染,它与宫颈癌的发生、发展密切相关[2]。近年HPV16致癌机理的研究表明：HPV16的E6蛋白能特异性地与野生型P53结合并在E6相关蛋白参与下，通过依赖于辅酶的蛋白水解系统致P53降解、灭活，HPV16还可经插入方式整合到染色体的某一位点致P53突变[3]；目前认为以上作用是HPV16致癌的关键步骤。由于HPV16系致癌高危型，因此早期诊治十分重要。据魏军等[4]报道，用微孔板杂交分型法检测宫颈活检刮片，HPV16的阳性率为67.5%(27/40)。无症状的HPV16感染不易被觉察，因此危害性更大；本组HPV16型阳性的女性中有15.8%(3/19)为无症状，提示HPV感染的实验室诊断并分型对诊治和预防癌变有较大的意义和价值。
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本研究发现HPV16型L1区有一新的变异，即第526～527位碱基间插入碱基C，经国际联网检索查新，系至今尚未见报告的变异。L1基因编码的是主要衣壳蛋白，该蛋白能刺激机体产生保护性抗体。该变异可能会导致其蛋白的免疫原性变化，因此，本结果对基因工程疫苗的制备具有较大的参考价值。
作者单位：董学君(312000浙江省绍兴市人民医院中心实验室)
叶飞(312000浙江省绍兴市人民医院中心实验室)
胡若愚(312000浙江省绍兴市人民医院中心实验室)
张国荣(312000浙江省绍兴市人民医院妇产科)
王少波(312000浙江省绍兴市人民医院泌尿科)
徐国强(312000浙江省绍兴市人民医院泌尿科)
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参考文献
1，Zur Hausen H. Human papillomaviruses in the pathogenesis of anogenital cancer.Virology，1991，184:9-13.
2，Lowy D R, Kirnbauer R,Schiller J T. Genital human papillomavirus infection. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:2436-2440.
3，笪冀平，胡益云，陈乐真，等. 肺癌人乳头瘤病毒感染与P53基因突变的研究.中华肿瘤杂志,1996,18:27.
4，魏军，张正. 人乳头瘤病毒PCR产物酶标-微孔板杂交分型. 中华医学检验杂志，1998，21：170-172., 百拇医药