老年黄斑变性与氧化磷酸化功能的初步研究
老年黄斑变性与氧化磷酸化功能的初步研究
于健 吴乐正 徐林
关键词：老年黄斑变性(AMD)；氧化磷酸化 老年黄斑变性(AMD)是老年人主要的不可治愈性致盲眼病之一。最新研究表明年龄相关的老年变性疾病与机体氧化磷酸化功能衰退有关，表现为电子传递链(electron transport chain,ETC)酶复合物活性降低，组织ATP生成减少和代谢异常〔1,2〕 。我们于1995年9月至1997年3月检测AMD患者部分ETC酶复合物活性，分析AMD患者机体氧化磷酸化功能，以进一步探讨AMD发病机制中氧化损伤学说。
一、对象与方法
1.选择老年湿性AMD患者20例，年龄60～76岁，平均66.1岁;干性AMD患者7例，年龄61～80岁，平均66.6岁;另选健康对照者16例,年龄60～76岁，平均65.2岁。实验分成3个组，各组年龄经统计学检验差异无显著性意义(P>0.05)。入选AMD患者依据AMD临床诊断标准，均经过眼底荧光血管造影、Humphery视野计和视觉诱发电位检查确诊。
, 百拇医药
2.血小板酶蛋白的制备：采集新鲜外周静脉血10 ml，加入枸橼酸钠抗凝,离心后吸取含血小板血浆，再做超速离心，得到血小板沉淀，光镜下观察确认。采用超声粉碎(150 W，间隔5 s)血小板，4℃下离心20 000 r/min，30 min，然后将上清液加入密度梯度为25%～5 5%的蔗糖溶液做密度梯度离心，在35%～45%蔗糖密度梯度之间，吸取血小板线粒体酶蛋白溶液，用紫外分光光度法(Lowry法)进行蛋白质定量，并将酶制备液冻存于-70℃冰箱内保存待测。ETC酶复合物活性测定，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q(NADH-CoQ)脱氢酶和细胞色素C氧化酶的活性测定方法，分别参考Hatefi和Errede等法。统计学处理采用SPSS软件，数据取均值±标准差，各组间进行方差分析。
二、结果
1.NADH-CoQ脱氢酶活性:NADH-CoQ脱氢酶活性湿性AMD组、干性AMD组和对照组分别为(15.35±6.19)、(15.57±8.41)、(17.84±5.71)nmol.min-1.mg-1。经方差分析3组间均值差异无显著性意义(P>0.05)。
, 百拇医药
2.细胞色素C氧化酶活性：湿性AMD组为(71.91±25.78)nmol.min-1.mg-1，其中约2/3患者低于77.92 nmol.min-1.mg-1；干性AMD组为(90.35±37.33)nmol.min-1.mg-1；对照组为(96.90±33.32)nmol.min-1.mg-1。3组间差异 有显著性意义(P<0.05),两两比较,湿性AMD组与干性AMD组间差异有显著性意义(P<0.05)，干性AMD组与对照组间 差异无显著性意义(P>0.05)。
三、讨论
组织能量主要来源于有氧氧化，氧化磷酸化作用十分重要，特别对高耗氧量的视网膜组织。ETC酶复合物包括复合物Ⅰ～Ⅴ，其中，NADH-CoQ脱氢酶为复合物I，细胞色素C氧 化酶为复合物Ⅳ，是构成呼吸链的重要酶类。其表达由线粒体DNA和细胞核DNA共同编码和调控，氧化磷酸化缺陷与线粒体DNA突变有关〔3,4〕。有氧氧化过程中，伴有大量氧自由基的产生，线粒体内过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)的活性降低，可损伤线粒体与核DNA，并影响ETC酶复合物活性，降低氧化磷酸化功能〔5〕。
, 百拇医药
关于湿性AMD和干性AMD的病因与分型，临床上存在AMD干性转湿性的病例，以往认为干性属早期，非渗出型；湿性属于晚期，渗出型，是同一种疾病的不同阶段。但是，现在临床见到许多病例，其发病分属两种类型，即AMD开始发病可为典型的湿性型，另有一些干性AMD患者虽有数十年病史，却始终保持为干性，提示不同类型的AMD发病机制可能不同〔6〕。本实验结果提示，湿性AMD患者细胞色素C氧化酶活性较干性AMD组和健康老年对照组降低，湿性AMD患者表现为视网膜出现缺氧、脂质渗出、新生血管膜形成和出血，可能与组织细胞氧化磷酸化功能降低有联系，其原因可能是自由基损伤和线粒体基因突变的共同结果。
作者单位：于健(710038 西安市，第四军医大学唐都医院眼科)
吴乐正(中山医科大学中山眼科中心)
徐林(生物化学教研室)
, 百拇医药 参考文献
1，Graff C, Clayton DA, Larsson NG. Mitochondrial medicine recent advances. J Intern Med,1999,246:11-23.
2，于健，吴乐正. 线粒体基因遗传及相关性眼病. 国外医学眼科学分册, 1997,21:361-366.
3，Sadun A.Acquired mitochondrial impairment as a cause of optic nerve disease.Trans Am Ophthalmol Soc,1998,96:881-923.
4，于健，吴乐正，徐林. 老年黄斑变性线粒体DNA缺失的初步研究. 眼科学报，199 7,13:52-55.
5，Hanna MG, Nelson IP.Genetics and molecular pathogenesis of mitochondrial respiratory chain diseases. Cell Mol Life Sci, 1999, 55: 691-706.
6，吴乐正，于健，陈又昭,等. 老年黄斑变性与遗传因素. 中华老年医学杂志, 1998,17:270-272., 百拇医药
于健 吴乐正 徐林
关键词：老年黄斑变性(AMD)；氧化磷酸化 老年黄斑变性(AMD)是老年人主要的不可治愈性致盲眼病之一。最新研究表明年龄相关的老年变性疾病与机体氧化磷酸化功能衰退有关，表现为电子传递链(electron transport chain,ETC)酶复合物活性降低，组织ATP生成减少和代谢异常〔1,2〕 。我们于1995年9月至1997年3月检测AMD患者部分ETC酶复合物活性，分析AMD患者机体氧化磷酸化功能，以进一步探讨AMD发病机制中氧化损伤学说。
一、对象与方法
1.选择老年湿性AMD患者20例，年龄60～76岁，平均66.1岁;干性AMD患者7例，年龄61～80岁，平均66.6岁;另选健康对照者16例,年龄60～76岁，平均65.2岁。实验分成3个组，各组年龄经统计学检验差异无显著性意义(P>0.05)。入选AMD患者依据AMD临床诊断标准，均经过眼底荧光血管造影、Humphery视野计和视觉诱发电位检查确诊。
, 百拇医药
2.血小板酶蛋白的制备：采集新鲜外周静脉血10 ml，加入枸橼酸钠抗凝,离心后吸取含血小板血浆，再做超速离心，得到血小板沉淀，光镜下观察确认。采用超声粉碎(150 W，间隔5 s)血小板，4℃下离心20 000 r/min，30 min，然后将上清液加入密度梯度为25%～5 5%的蔗糖溶液做密度梯度离心，在35%～45%蔗糖密度梯度之间，吸取血小板线粒体酶蛋白溶液，用紫外分光光度法(Lowry法)进行蛋白质定量，并将酶制备液冻存于-70℃冰箱内保存待测。ETC酶复合物活性测定，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q(NADH-CoQ)脱氢酶和细胞色素C氧化酶的活性测定方法，分别参考Hatefi和Errede等法。统计学处理采用SPSS软件，数据取均值±标准差，各组间进行方差分析。
二、结果
1.NADH-CoQ脱氢酶活性:NADH-CoQ脱氢酶活性湿性AMD组、干性AMD组和对照组分别为(15.35±6.19)、(15.57±8.41)、(17.84±5.71)nmol.min-1.mg-1。经方差分析3组间均值差异无显著性意义(P>0.05)。
, 百拇医药
2.细胞色素C氧化酶活性：湿性AMD组为(71.91±25.78)nmol.min-1.mg-1，其中约2/3患者低于77.92 nmol.min-1.mg-1；干性AMD组为(90.35±37.33)nmol.min-1.mg-1；对照组为(96.90±33.32)nmol.min-1.mg-1。3组间差异 有显著性意义(P<0.05),两两比较,湿性AMD组与干性AMD组间差异有显著性意义(P<0.05)，干性AMD组与对照组间 差异无显著性意义(P>0.05)。
三、讨论
组织能量主要来源于有氧氧化，氧化磷酸化作用十分重要，特别对高耗氧量的视网膜组织。ETC酶复合物包括复合物Ⅰ～Ⅴ，其中，NADH-CoQ脱氢酶为复合物I，细胞色素C氧 化酶为复合物Ⅳ，是构成呼吸链的重要酶类。其表达由线粒体DNA和细胞核DNA共同编码和调控，氧化磷酸化缺陷与线粒体DNA突变有关〔3,4〕。有氧氧化过程中，伴有大量氧自由基的产生，线粒体内过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)的活性降低，可损伤线粒体与核DNA，并影响ETC酶复合物活性，降低氧化磷酸化功能〔5〕。
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关于湿性AMD和干性AMD的病因与分型，临床上存在AMD干性转湿性的病例，以往认为干性属早期，非渗出型；湿性属于晚期，渗出型，是同一种疾病的不同阶段。但是，现在临床见到许多病例，其发病分属两种类型，即AMD开始发病可为典型的湿性型，另有一些干性AMD患者虽有数十年病史，却始终保持为干性，提示不同类型的AMD发病机制可能不同〔6〕。本实验结果提示，湿性AMD患者细胞色素C氧化酶活性较干性AMD组和健康老年对照组降低，湿性AMD患者表现为视网膜出现缺氧、脂质渗出、新生血管膜形成和出血，可能与组织细胞氧化磷酸化功能降低有联系，其原因可能是自由基损伤和线粒体基因突变的共同结果。
作者单位：于健(710038 西安市，第四军医大学唐都医院眼科)
吴乐正(中山医科大学中山眼科中心)
徐林(生物化学教研室)
, 百拇医药 参考文献
1，Graff C, Clayton DA, Larsson NG. Mitochondrial medicine recent advances. J Intern Med,1999,246:11-23.
2，于健，吴乐正. 线粒体基因遗传及相关性眼病. 国外医学眼科学分册, 1997,21:361-366.
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4，于健，吴乐正，徐林. 老年黄斑变性线粒体DNA缺失的初步研究. 眼科学报，199 7,13:52-55.
5，Hanna MG, Nelson IP.Genetics and molecular pathogenesis of mitochondrial respiratory chain diseases. Cell Mol Life Sci, 1999, 55: 691-706.
6，吴乐正，于健，陈又昭,等. 老年黄斑变性与遗传因素. 中华老年医学杂志, 1998,17:270-272., 百拇医药