半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体
半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体
杨婧 张正
摘 要 目的 建立半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法(半巢式PCR-MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体(Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记，经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后，扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获，经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应，经过酶底物显色，通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感。半巢式PCR-MPH法特异性强，检测敏感性高，比半巢式PCR产物酶切后电泳法高10倍；该法重复性好，批内CV值<10%，批间CV值<15%；该法在包被浓度为4 mg/L、产物1∶20稀释、与微孔板结合20 min后加入10 pmol/ml探针杂交30 min，用1∶3 000稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、特异性好、敏感性高、结果判断客观，无放射性和EB染料污染，便于大量临床样本的常规检测。
, 百拇医药
关键词：沙眼衣原体；聚合酶链反应；杂交；限制性内切酶
沙眼衣原体(Ct)除引起沙眼外，目前已成为性传播疾病的重要病原体而日益引起人们的重视。但Ct感染常无症状或无特异症状而容易被人们所忽视，所以建立一种快速、敏感、特异的检测方法就显得非常重要。我们比较了Ct质粒和omp1基因引物的敏感性，建立了半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法进行Ct检测，现将结果报告如下。
材料和方法
一、材料
1.标本来源：临床标本共114份，其中44份泌尿生殖道感染患者分泌物标本及30份不育男性精液标本，均取自东直门外医院性病门诊；40份宫颈拭子取自本院产科门诊。
2.主要试剂与仪器：Ct L2/434/Bu标准株由协和医院检验科倪安平老师惠赠。TaqDNA聚合酶为Promega产品，dNTP为Pharmasia产品，链霉亲和素、辣根酶标记的抗荧光素抗体、四甲基联苯胺(TMB)均为Boehring Mznnheim产品，酶标板为丹麦Nunc产品。DNA扩增仪100TM型为美国PE公司产品。
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二、方法
1.引物和寡核苷酸探针：根据文献[1，2]，分别选取质粒和omp1基因中的保守序列作为引物。质粒引物由上海生物工程公司合成，序列为：上游引物KL1 5′TCCGGAGCGAGTTACGAAGA3′，下游引物 KL2 5′AATCAATGCCCGGGATTGGT 3′，预期合成片段为241 bp，内含HindⅢ切点，酶切后片段为167和74 bp。omp1基因引物序列为：上游引物P1 5′GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCCTC3′，下游引物P2 5′GTCGAAAACAAAGTCACCATAGTA3′，下游引物P3 5′CCAAGTGGTGCAAGGATCGCA3′，P3 5′端标记生物素。用P1和P2进行第1轮PCR，预期合成片段为180 bp，内含EcoRI切点，酶切后片段为77和103 bp；用P1和P3进行第2轮半巢式PCR，预期合成片段为129 bp，内含EcoRI切点，酶切后片段为77和52 bp。寡核苷酸探针5′端标记荧光素，序列为5′T-CCTTGCAAGCTCTGCCTGTGGGGAATCCT3′。omp1基因引物及寡核苷酸探针均由美国Synbercen公司合成。
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2.PCR模板制备 按文献[1]制备，第1轮PCR取制备好的模板4 μl，第2轮半巢式PCR取2 μl第1轮PCR产物作为模板。
3.PCR条件：50 μl反应体系中含10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，每种dNTP 200 μmol/L，两条引物浓度各为0.2 μmol/L，1.5 U TaqDNA聚合酶。循环参数如下：94℃4 min变性，然后94℃ 45 s，55℃1 min，72℃1 min，共35个循环后72℃延伸4 min。
4.微孔板杂交：参考文献[3]，将链霉亲和素以5 mg/L、200 μl/孔包被微孔板，4℃过夜。然后加入封闭剂100 μl/孔，4℃过夜。弃去孔内液体后真空抽干，-20℃待用。取PCR产物经稀释后以100 μl/孔加入微孔板中，37℃45 min以捕获PCR产物。用洗液洗板后，加150 mmol/L的NaOH溶液100 μl，室温10 min使产物变性并以单链形式结合在微孔板上。洗板后加入含荧光素标记探针的杂交液100 μl/孔进行杂交反应。杂交液为50%去离子甲酰胺、5×SSC、1×FPG、25 mmol/L磷酸盐、2 g/LSDS、50 g/L硫酸葡聚糖。洗板后加入稀释的标记有辣根过氧化物酶的Anti-FITC-抗体100 μl/孔，37℃45 min。酶稀释液为100 mmol/L Tris-HCl pH7.5、150 mmol/L NaCl、10 g/L BSA。充分洗板后加入底物100 μl/孔，37℃显色，2mol/L H2SO4 50 μl终止反应。酶标仪450 nm波长测吸光度A值。每批检测有标准株对照。
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结果
1.不同引物间敏感性的比较：将标准株总DNA用紫外分光光度计定量后做10倍系列稀释加入扩增体系中，分别应用质粒及外膜蛋白基因引物扩增并比较它们之间的敏感性。结果：行单次PCR，质粒引物较外膜蛋白基因引物敏感1 000倍，但通过半巢式PCR可提高外膜蛋白基因引物的敏感性，并且较质粒引物敏感10倍。
2.微孔板杂交特异性试验：选择沙眼衣原体及泌尿生殖道常见的解脲脲原体、淋病奈瑟菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肠球菌提取的模板进行PCR-MPH。结果显示，只有沙眼衣原体的半巢式扩增产物与探针发生特异性杂交，而其余几种模板均未见扩增产物的杂交反应。说明杂交特异性强。
3.微孔板杂交灵敏度试验：将标准株培养物收获的总DNA稀释成10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg和1 fg 8个浓度分别进行扩增，然后用酶切后聚丙烯酰胺凝胶电泳和杂交分别检测产物。随着模板浓度的增加，杂交信号也随之增加，最少模板量可至100 fg，而电泳只能检测到1 pg。
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4.重复性试验：分别取测量范围内的高浓度(强阳性结果)、中浓度(阳性)、低浓度(阴性)样品的PCR产物进行MPH，批内重复性试验每个浓度重复测定10份，确定其重复性及稳定性，见表1。
5.微孔板杂交体系的优化：随着包被浓度的提高，A值在不断增加，但包被浓度在4 μg/ml以上时，A值增加不明显；随产物结合时间的增加，A值变化不大，在20 min时信噪比最大；产物稀释度在1∶160前，A值变化不大，之后，随稀释倍数的增加，A值在不断下降；随探针浓度增大，A值不断增大，但增加到10 pmol/ml后，本底也有增大的趋势；随杂交时间增加，本底有增加的趋势，在30 min时信噪比最大；随着酶浓度的提高，阳性产物A值在增大。但当酶浓度提高到1∶3 000倍稀释后，阳性产物A值变化不大，但阴性产物A值急剧增大导致本底升高，信噪比越来越小。综合考虑后，杂交体系确定为：以4 μg/ml链霉亲和素包被微孔板，4℃过夜，次日弃去包被液，用洗液洗板3次，加封闭液4℃过夜封闭后，洗板4次，冷冻干燥备用。将扩增产物1∶20稀释后，加入微孔板中，37℃孵育20 min后，洗板3次。加入10 pmol/ml的荧光素标记探针37℃杂交30 min，洗板3次。加入1∶3 000稀释的酶标抗荧光素抗体，37℃作用10 min后洗板6次，加入TMB底物显色5～10 min，加入2 mol/L 硫酸终止反应，450 nm比色，读取A值。
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6.临床标本检测：利用新建立的半巢式PCR-MPH与酶切后聚丙烯酰胺凝胶电泳法对临床114份标本进行了检测，结果见表2。
表1 批内、批间重复性试验
组别
样本数
X±s*
CV(%)
低浓度
10
0.083±0.006
7.470
批内
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中浓度
10
1.103±0.027
2.430
高浓度
10
1.961±0.042
2.160
低浓度
9
0.082±0.009
11.550
批间
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中浓度
9
1.086±0.049
4.530
高浓度
9
1.744±0.158
9.080
*为吸光度A值表2 微孔板杂交法与聚丙烯酰胺凝胶电泳法
对114份临床标本检测结果
标本
份数
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聚丙烯酰胺凝胶
电泳法阳性
微孔板杂
交法阳性
泌尿生殖系统感染者分泌物
44
21
23
孕妇宫颈拭子
40
9
10
男性不育者精液
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30
8
8
讨论
我们选用Ct的质粒引物KL1/KL2和主要外膜蛋白基因的一对引物P1/P2进行PCR，目的扩增片段分别为241 bp和180 bp。PCR产物经酶切后聚丙烯酰胺凝胶电泳观察，两种引物的敏感性有明显差异，质粒引物PCR较omp1引物PCR敏感1 000倍，与Mahony等[2]报道一致。这可解释为每个细胞中质粒的拷贝数有7～10个，而染色体基因只有一个拷贝。但在又增加一条omp1引物P3做半巢式PCR后(目的扩增片段为129 bp)，omp1引物的敏感性大大提高，比质粒引物PCR还要敏感10倍，说明通过进行半巢式PCR，不但有助于增强特异性，而且提高了敏感性。
本试验将P3用生物素标记，扩增后产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获，变性后与特异性探针进行杂交。由于下游引物P3 5′端标记了生物素，探针5′端标记了荧光素。于是，只有与扩增产物杂交的探针才能结合在微孔板上，同时也只有与特异性探针杂交的产物才能带有荧光素标记。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应，经过底物显色，在酶标仪上读取结果。我们对各种试验条件进行了优化，使方法更具可操作性。本研究表明，半巢式PCR-微孔板杂交法具有较好的特异性和稳定性，需时短，杂交灵敏度明显高于PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，与文献报道一致[4]。
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利用新建立的方法对临床114份标本进行检测，共检出41份阳性，而半巢式PCR后酶切电泳检出38份阳性。对3份酶切阴性而微孔板杂交阳性的标本重复3次仍为阳性。有学者认为，对于这类不一致的结果应增加其他检测方法扩大金标准范围进行确证[4]，故而用华美公司生产的沙眼衣原体核酸杂交检测试剂盒重复，结果均为阳性。考虑是由于标本中模板量较低，而电泳检测的灵敏度低于本法所致。本研究结果表明：泌尿生殖系统感染者、孕妇及男性不育患者Ct的感染率分别为52.3%、25%和26.7%，泌尿生殖系统感染者的检出率最高，与文献报道一致。
常规的电泳法判断结果可能存在非特异条带的影响。我们用限制性内切酶切割产物，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳观察结果，可以增强判断的特异性。但由于电泳法判断结果的敏感性低，如果目的DNA量很少，仍有漏检的可能，且有EB 污染、不适合大批量标本等不足；而我们建立的PCR-MPH法，结合了PCR的高敏感性和杂交的特异性，可提高检出的阳性率，便于临床及早诊断及治疗，而且适合于大批量标本的操作，判断结果客观，有助于实现检测的自动化，为临床诊断 Ct感染提供了一个很好的试验方法。
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作者单位：杨婧(100044 北京大学人民医院检验科)
张正(100044 北京大学人民医院检验科)
参考文献
1，Roosendaal R, Walboomers JM, Veltman OR, et al. Comparison of different primer sets for detection of Chlamydia trachomatis by the polymerase chain reaction. J Med Microbiol, 1993, 38:426-433.
2，Mahony JB, Luinstra KE, Sellors JW, et al. Confirmatory polymerase chain reaction testing for chlamydia trachomatis in First-void urine from asymptomatic and symptomatic men. J Clin Microbiol, 1992, 30:2241-2245.
3，仝文斌，张春英，费然，等. 酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物. 中华医学检验杂志, 1998，21:88-91.
4，Morse SA. 性病实验室诊断的新进展. 1996年全国性病学术研讨会论文集, 1996:48-67., 百拇医药
杨婧 张正
摘 要 目的 建立半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法(半巢式PCR-MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体(Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记，经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后，扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获，经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应，经过酶底物显色，通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感。半巢式PCR-MPH法特异性强，检测敏感性高，比半巢式PCR产物酶切后电泳法高10倍；该法重复性好，批内CV值<10%，批间CV值<15%；该法在包被浓度为4 mg/L、产物1∶20稀释、与微孔板结合20 min后加入10 pmol/ml探针杂交30 min，用1∶3 000稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、特异性好、敏感性高、结果判断客观，无放射性和EB染料污染，便于大量临床样本的常规检测。
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关键词：沙眼衣原体；聚合酶链反应；杂交；限制性内切酶
沙眼衣原体(Ct)除引起沙眼外，目前已成为性传播疾病的重要病原体而日益引起人们的重视。但Ct感染常无症状或无特异症状而容易被人们所忽视，所以建立一种快速、敏感、特异的检测方法就显得非常重要。我们比较了Ct质粒和omp1基因引物的敏感性，建立了半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法进行Ct检测，现将结果报告如下。
材料和方法
一、材料
1.标本来源：临床标本共114份，其中44份泌尿生殖道感染患者分泌物标本及30份不育男性精液标本，均取自东直门外医院性病门诊；40份宫颈拭子取自本院产科门诊。
2.主要试剂与仪器：Ct L2/434/Bu标准株由协和医院检验科倪安平老师惠赠。TaqDNA聚合酶为Promega产品，dNTP为Pharmasia产品，链霉亲和素、辣根酶标记的抗荧光素抗体、四甲基联苯胺(TMB)均为Boehring Mznnheim产品，酶标板为丹麦Nunc产品。DNA扩增仪100TM型为美国PE公司产品。
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二、方法
1.引物和寡核苷酸探针：根据文献[1，2]，分别选取质粒和omp1基因中的保守序列作为引物。质粒引物由上海生物工程公司合成，序列为：上游引物KL1 5′TCCGGAGCGAGTTACGAAGA3′，下游引物 KL2 5′AATCAATGCCCGGGATTGGT 3′，预期合成片段为241 bp，内含HindⅢ切点，酶切后片段为167和74 bp。omp1基因引物序列为：上游引物P1 5′GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCCTC3′，下游引物P2 5′GTCGAAAACAAAGTCACCATAGTA3′，下游引物P3 5′CCAAGTGGTGCAAGGATCGCA3′，P3 5′端标记生物素。用P1和P2进行第1轮PCR，预期合成片段为180 bp，内含EcoRI切点，酶切后片段为77和103 bp；用P1和P3进行第2轮半巢式PCR，预期合成片段为129 bp，内含EcoRI切点，酶切后片段为77和52 bp。寡核苷酸探针5′端标记荧光素，序列为5′T-CCTTGCAAGCTCTGCCTGTGGGGAATCCT3′。omp1基因引物及寡核苷酸探针均由美国Synbercen公司合成。
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2.PCR模板制备 按文献[1]制备，第1轮PCR取制备好的模板4 μl，第2轮半巢式PCR取2 μl第1轮PCR产物作为模板。
3.PCR条件：50 μl反应体系中含10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，每种dNTP 200 μmol/L，两条引物浓度各为0.2 μmol/L，1.5 U TaqDNA聚合酶。循环参数如下：94℃4 min变性，然后94℃ 45 s，55℃1 min，72℃1 min，共35个循环后72℃延伸4 min。
4.微孔板杂交：参考文献[3]，将链霉亲和素以5 mg/L、200 μl/孔包被微孔板，4℃过夜。然后加入封闭剂100 μl/孔，4℃过夜。弃去孔内液体后真空抽干，-20℃待用。取PCR产物经稀释后以100 μl/孔加入微孔板中，37℃45 min以捕获PCR产物。用洗液洗板后，加150 mmol/L的NaOH溶液100 μl，室温10 min使产物变性并以单链形式结合在微孔板上。洗板后加入含荧光素标记探针的杂交液100 μl/孔进行杂交反应。杂交液为50%去离子甲酰胺、5×SSC、1×FPG、25 mmol/L磷酸盐、2 g/LSDS、50 g/L硫酸葡聚糖。洗板后加入稀释的标记有辣根过氧化物酶的Anti-FITC-抗体100 μl/孔，37℃45 min。酶稀释液为100 mmol/L Tris-HCl pH7.5、150 mmol/L NaCl、10 g/L BSA。充分洗板后加入底物100 μl/孔，37℃显色，2mol/L H2SO4 50 μl终止反应。酶标仪450 nm波长测吸光度A值。每批检测有标准株对照。
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结果
1.不同引物间敏感性的比较：将标准株总DNA用紫外分光光度计定量后做10倍系列稀释加入扩增体系中，分别应用质粒及外膜蛋白基因引物扩增并比较它们之间的敏感性。结果：行单次PCR，质粒引物较外膜蛋白基因引物敏感1 000倍，但通过半巢式PCR可提高外膜蛋白基因引物的敏感性，并且较质粒引物敏感10倍。
2.微孔板杂交特异性试验：选择沙眼衣原体及泌尿生殖道常见的解脲脲原体、淋病奈瑟菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肠球菌提取的模板进行PCR-MPH。结果显示，只有沙眼衣原体的半巢式扩增产物与探针发生特异性杂交，而其余几种模板均未见扩增产物的杂交反应。说明杂交特异性强。
3.微孔板杂交灵敏度试验：将标准株培养物收获的总DNA稀释成10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg和1 fg 8个浓度分别进行扩增，然后用酶切后聚丙烯酰胺凝胶电泳和杂交分别检测产物。随着模板浓度的增加，杂交信号也随之增加，最少模板量可至100 fg，而电泳只能检测到1 pg。
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4.重复性试验：分别取测量范围内的高浓度(强阳性结果)、中浓度(阳性)、低浓度(阴性)样品的PCR产物进行MPH，批内重复性试验每个浓度重复测定10份，确定其重复性及稳定性，见表1。
5.微孔板杂交体系的优化：随着包被浓度的提高，A值在不断增加，但包被浓度在4 μg/ml以上时，A值增加不明显；随产物结合时间的增加，A值变化不大，在20 min时信噪比最大；产物稀释度在1∶160前，A值变化不大，之后，随稀释倍数的增加，A值在不断下降；随探针浓度增大，A值不断增大，但增加到10 pmol/ml后，本底也有增大的趋势；随杂交时间增加，本底有增加的趋势，在30 min时信噪比最大；随着酶浓度的提高，阳性产物A值在增大。但当酶浓度提高到1∶3 000倍稀释后，阳性产物A值变化不大，但阴性产物A值急剧增大导致本底升高，信噪比越来越小。综合考虑后，杂交体系确定为：以4 μg/ml链霉亲和素包被微孔板，4℃过夜，次日弃去包被液，用洗液洗板3次，加封闭液4℃过夜封闭后，洗板4次，冷冻干燥备用。将扩增产物1∶20稀释后，加入微孔板中，37℃孵育20 min后，洗板3次。加入10 pmol/ml的荧光素标记探针37℃杂交30 min，洗板3次。加入1∶3 000稀释的酶标抗荧光素抗体，37℃作用10 min后洗板6次，加入TMB底物显色5～10 min，加入2 mol/L 硫酸终止反应，450 nm比色，读取A值。
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6.临床标本检测：利用新建立的半巢式PCR-MPH与酶切后聚丙烯酰胺凝胶电泳法对临床114份标本进行了检测，结果见表2。
表1 批内、批间重复性试验
组别
样本数
X±s*
CV(%)
低浓度
10
0.083±0.006
7.470
批内
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中浓度
10
1.103±0.027
2.430
高浓度
10
1.961±0.042
2.160
低浓度
9
0.082±0.009
11.550
批间
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中浓度
9
1.086±0.049
4.530
高浓度
9
1.744±0.158
9.080
*为吸光度A值表2 微孔板杂交法与聚丙烯酰胺凝胶电泳法
对114份临床标本检测结果
标本
份数
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聚丙烯酰胺凝胶
电泳法阳性
微孔板杂
交法阳性
泌尿生殖系统感染者分泌物
44
21
23
孕妇宫颈拭子
40
9
10
男性不育者精液
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30
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讨论
我们选用Ct的质粒引物KL1/KL2和主要外膜蛋白基因的一对引物P1/P2进行PCR，目的扩增片段分别为241 bp和180 bp。PCR产物经酶切后聚丙烯酰胺凝胶电泳观察，两种引物的敏感性有明显差异，质粒引物PCR较omp1引物PCR敏感1 000倍，与Mahony等[2]报道一致。这可解释为每个细胞中质粒的拷贝数有7～10个，而染色体基因只有一个拷贝。但在又增加一条omp1引物P3做半巢式PCR后(目的扩增片段为129 bp)，omp1引物的敏感性大大提高，比质粒引物PCR还要敏感10倍，说明通过进行半巢式PCR，不但有助于增强特异性，而且提高了敏感性。
本试验将P3用生物素标记，扩增后产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获，变性后与特异性探针进行杂交。由于下游引物P3 5′端标记了生物素，探针5′端标记了荧光素。于是，只有与扩增产物杂交的探针才能结合在微孔板上，同时也只有与特异性探针杂交的产物才能带有荧光素标记。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应，经过底物显色，在酶标仪上读取结果。我们对各种试验条件进行了优化，使方法更具可操作性。本研究表明，半巢式PCR-微孔板杂交法具有较好的特异性和稳定性，需时短，杂交灵敏度明显高于PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，与文献报道一致[4]。
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利用新建立的方法对临床114份标本进行检测，共检出41份阳性，而半巢式PCR后酶切电泳检出38份阳性。对3份酶切阴性而微孔板杂交阳性的标本重复3次仍为阳性。有学者认为，对于这类不一致的结果应增加其他检测方法扩大金标准范围进行确证[4]，故而用华美公司生产的沙眼衣原体核酸杂交检测试剂盒重复，结果均为阳性。考虑是由于标本中模板量较低，而电泳检测的灵敏度低于本法所致。本研究结果表明：泌尿生殖系统感染者、孕妇及男性不育患者Ct的感染率分别为52.3%、25%和26.7%，泌尿生殖系统感染者的检出率最高，与文献报道一致。
常规的电泳法判断结果可能存在非特异条带的影响。我们用限制性内切酶切割产物，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳观察结果，可以增强判断的特异性。但由于电泳法判断结果的敏感性低，如果目的DNA量很少，仍有漏检的可能，且有EB 污染、不适合大批量标本等不足；而我们建立的PCR-MPH法，结合了PCR的高敏感性和杂交的特异性，可提高检出的阳性率，便于临床及早诊断及治疗，而且适合于大批量标本的操作，判断结果客观，有助于实现检测的自动化，为临床诊断 Ct感染提供了一个很好的试验方法。
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作者单位：杨婧(100044 北京大学人民医院检验科)
张正(100044 北京大学人民医院检验科)
参考文献
1，Roosendaal R, Walboomers JM, Veltman OR, et al. Comparison of different primer sets for detection of Chlamydia trachomatis by the polymerase chain reaction. J Med Microbiol, 1993, 38:426-433.
2，Mahony JB, Luinstra KE, Sellors JW, et al. Confirmatory polymerase chain reaction testing for chlamydia trachomatis in First-void urine from asymptomatic and symptomatic men. J Clin Microbiol, 1992, 30:2241-2245.
3，仝文斌，张春英，费然，等. 酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物. 中华医学检验杂志, 1998，21:88-91.
4，Morse SA. 性病实验室诊断的新进展. 1996年全国性病学术研讨会论文集, 1996:48-67., 百拇医药