恒磁场对离体兔动脉平滑肌细胞的抑制效应
恒磁场对离体兔动脉平滑肌细胞的抑制效应
吕安林 高歌 贾国良 王小燕 郭文怡 王海昌
摘 要 目的 探讨恒磁场对离体兔主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用，为研究冠脉内磁化支架对经皮腔内冠脉成形术(PTCA)及支架术后冠脉再狭窄的防治作用提供理论基础。方法 用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液体外培养新西兰白兔的主动脉平滑肌细胞至3～7代，将含5%小牛血清的RPMI-1640培养液主动脉平滑肌细胞悬液100 μl加入96孔培养板中培养，对照组持续培养72 h，实验组24 h后将培养板置于0.35 T的恒磁场中继续培养48 h，两组培养72 h后用MTT法和3H-TdR掺入法检测动脉平滑肌细胞的增殖数量(A值和核素闪烁计数值)。结果 在恒磁场的作用下，实验组主动脉平滑肌细胞的增殖数量(0.294 8±0.044 8和1 378±596)min，显著低于对照组平滑肌细胞的增殖数量(0.478 3±0.058 0和2 687±983)min，P<0.001。结论 恒磁场对动脉平滑肌细胞 的增殖有显著的抑制作用；磁场对PTCA支架后冠脉再狭窄可能具有防治作用。
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关键词：磁疗法；兔；细胞，增殖，平滑肌；抑制作用
近年来，有关磁场促进创伤组织愈合的研究文献较多[1]，但磁场调控主动脉平滑肌细胞(ASMCs)增殖的研究鲜见报道。经皮腔内冠脉成形术(PTCA)及冠脉内支架后冠脉再狭窄(RS)的主要原因是冠脉血管重构和新生内膜增生，血管重构是冠脉血管的修复效应造成的，而新生内膜增生则是血管平滑肌细胞的迁移、增殖和基质改建形成的[2]。在RS的形成过程中，冠脉新生内膜增生是主要影响因素[3]。
目前有关RS防治研究的文献较多，但所提出防治措施的疗效均未能显著降低RS的发生率15%～20%[2-4]，这严重阻碍了PTCA支架术的进一步发展、推广和应用。为提高PTCA支架术的疗效，降低RS的发生率，我们研究了恒磁场对离体兔ASMCs增殖的影响，探索冠脉内磁化支架预防RS发生的可能性。
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材料和方法
ASMCs的体外培养，无菌取出新西兰白兔(体重1.5±0.5 kg)主动脉段，刮出内膜后，剥脱中膜的平滑肌层，按照Ross贴片法用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液培养ASMCs，在CO2孵箱中静置培养7 d后，可见平滑肌细胞开始从组织块边缘爬出，待平滑肌细胞生长到一定密度后即传代培养，取其3～7代作为实验用细胞。
ASMCs的鉴定：相差显微镜下ASMCs呈梭形或长梭形，可重叠生长达多层，高低起伏呈“峰”“谷”状(图略)。透视电镜可见ASMCs的胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝及与其相联的致密体，部分细胞周围可见基膜(图略)。α-肌动蛋白抗体染色，淡蓝色的ASMCs胞核有淡棕色的阳性肌丝(图略)。
实验设计：将含5%小牛血清的RPMI-1640培养液与3～7代ASMCs的混悬液(细胞浓度为1×104/ml)100 μl加入96孔培养板中，对照组无磁场作用状态下在美制MODEL 2300 CO2孵箱中静止培养72 h；实验组静止培养24 h后置于0.35 T恒磁场(恒磁体为内蒙古产，平均磁感应强度0.35 T，长60 mm，宽40 mm，高25 mm，N极和S极对置，培养板位于两级中间)中继续培养48 h。
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ASMCs增殖数量的检测：四唑盐比色法(MTT)：ASMCs培养72 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，继续孵育4 h后终止培养；吸弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，然后在国产DG3022A型酶联免疫检测仪上(波长490 mm)测定各孔光吸收值，结果以A值表示。3H-TdR掺入实验：ASMCs培养72 h后每孔加入3H-TdR 50 μl(5×10-3μCi/孔)，继续培养6 h后终止反应。用“9999”型纤维滤纸和ET-II型微量细胞收集仪收集细胞，滤纸经红外线烤箱烘干后，分别置于闪烁瓶中加入PPO/POPOP二甲苯闪烁液500 μl，在美制LS-6500液体闪烁计数器上测定核素闪烁计数值，结果以min表示。
统计方法：统计数据用均值±标准差表示，数据处理采用显著性t检验法。
结 果
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MTT法和3H-TdR掺入法测定的ASMCs增殖的A值与核素闪烁计数(min)值统计数据见表1。统计学检验表明，实验组ASMCs增殖的A值与min值均显著低于对照组(t＝3.816 6，3.932 2，P<0.001)。
表1 MTT法与3H-TdR掺入法测定的两组A值与核素闪烁计数值(X±s，n＝48)
组别
A值
核素闪烁计数值(min)
对照组
0.478 3±0.058 0
2 687±983
, 百拇医药
磁场组
0.294 8±0.044 8
1 378±596
讨 论 磁场治疗心血管系统的疾病已有很多报道[5]，但未见利用磁场对冠状动脉平滑肌细胞增殖的调控作用治疗PTCA支架术后冠脉再狭窄的报道。曾有报道脉冲磁场作用时间小于10 min时，磁场能够促进表皮细胞的增殖，大于10 min时抑制表皮细胞的增殖[6]。本组实验结果同样表现出了这种细胞生物学的抑制效应，而且ASMCs培养板放置于N极、S极相对的0.35 T恒磁场中能够极显著的抑制ASMCs的增殖。
磁场抑制ASMCs增殖的作用机理可能为：①磁场对细胞新陈代谢的影响：培养液中的荷电离子，如钾、钠、氯、钙、镁、磷等离子，在磁场的作用下，其荷电能力发生改变，影响了这些离子的移动速度和排列形式，使细胞代谢所需酶的活性或功能受到干扰，细胞代谢水平降低，细胞的增殖能力降低[6，7]；②磁场对DNA合成的影响：磁场的能量直接作用于DNA合成的信使转录系统，降低了DNA的合成速度，使ASMCs的增殖受到抑制[8]。
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已知人体是一带生物电的机体， 由于内部电子的运动而产生磁场效应。人体物质代谢的实质是氧化还原最终产生能量，根据电子形成电流和磁场的原理，磁场可影响机体生物电的大小和方向。因此，受磁场作用后，机体出现血管扩张，血流速度加快，红细胞的变形能力增强，红细胞凝聚力降低，血粘度降低，所以冠脉内磁化支架有改善冠脉血液循环和防止血栓形成的作用[7，9，10]。
由于磁场既能改善冠脉血循环和防止血栓形成又能抑制冠状动脉平滑肌细胞的增殖，而且已有文献报道，适当强度的磁场对心脏的传导和收缩功能无显著影响[9-11]，因此，体内或体外磁疗可望显著降低PTCA支架后冠脉再狭窄的发生率，但有待于进一步的动物实验和临床试验证实。
吕安林(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
高歌(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
, http://www.100md.com
贾国良(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
王小燕(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
郭文怡(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
王海昌(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
参考文献
1，Darendeliler MA,Darendeliler A,Sinclair PM.Effects of static magnetic and pulsed electromagnetic fields on bone healing.Lnt J Adult Orthodon Orthognath Surg,1997,12:43-53.
, 百拇医药
2，Farb A,Sangiorgi G,Carter AJ,et al.Pathology of acute and chronic coronary stenting in humans.Circulation,1999,99:44-52.
3，Mgosaki N,Tsurumi Y,Hosoda S.Current approaches to restenosis after coronary interventions.Nippon Rinsho,1998,56:242-248.
4，Leon MB,Popma JJ,Mintz GS,et al.An overview of US coronary stent trials.Semi Interv Cardiol,1998,1:247-254.
5，Pang SC,Venanece SL.Cultured smooth muscle approaches in the study of hypertension.Can J Physiol Pharmacol,1992,70:573-579.
, 百拇医药
6，陈树德，张红锋，陈家森，等.低频电磁场对细胞生物学效应的影响.中华物理医学杂志，1998，20：78-80.
7，Nossol B,Buse G,Silny J.Influence weak static 50 Hz magnetic fields on the redox activity of cytochrome-C.Bioelectromagnetics,1993,14:361-372.
8，Lai H,Singh NP.Acute exposure to a 60 Hz magnetic field increases DNA strand breaks in rat brain cells.Bioelectromagnetics,1997,18:156-165.
9，Grassi-Schultheiss PP,Heller F,Dobson J.Analysis of magnetic material in the human heart,spleen and liver.Biometals,1997,10:351-355.
, 百拇医药
10，Mouchawar GA,bourland TD,Nyenhuis TA.Closed-chest cardiac stimulation with a pulsed magnetic field.Med Biol Eng Comput,1992,30:162-168.
11，Kazakova RT,Badakva AM.Effect of isolated and combined effect of a constant magnetic field and antiorthostatic hypokinesia on central hemodynamics in rats.Kosm Biol Avikosm Med,1991,25:48-49., http://www.100md.com
吕安林 高歌 贾国良 王小燕 郭文怡 王海昌
摘 要 目的 探讨恒磁场对离体兔主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用，为研究冠脉内磁化支架对经皮腔内冠脉成形术(PTCA)及支架术后冠脉再狭窄的防治作用提供理论基础。方法 用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液体外培养新西兰白兔的主动脉平滑肌细胞至3～7代，将含5%小牛血清的RPMI-1640培养液主动脉平滑肌细胞悬液100 μl加入96孔培养板中培养，对照组持续培养72 h，实验组24 h后将培养板置于0.35 T的恒磁场中继续培养48 h，两组培养72 h后用MTT法和3H-TdR掺入法检测动脉平滑肌细胞的增殖数量(A值和核素闪烁计数值)。结果 在恒磁场的作用下，实验组主动脉平滑肌细胞的增殖数量(0.294 8±0.044 8和1 378±596)min，显著低于对照组平滑肌细胞的增殖数量(0.478 3±0.058 0和2 687±983)min，P<0.001。结论 恒磁场对动脉平滑肌细胞 的增殖有显著的抑制作用；磁场对PTCA支架后冠脉再狭窄可能具有防治作用。
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关键词：磁疗法；兔；细胞，增殖，平滑肌；抑制作用
近年来，有关磁场促进创伤组织愈合的研究文献较多[1]，但磁场调控主动脉平滑肌细胞(ASMCs)增殖的研究鲜见报道。经皮腔内冠脉成形术(PTCA)及冠脉内支架后冠脉再狭窄(RS)的主要原因是冠脉血管重构和新生内膜增生，血管重构是冠脉血管的修复效应造成的，而新生内膜增生则是血管平滑肌细胞的迁移、增殖和基质改建形成的[2]。在RS的形成过程中，冠脉新生内膜增生是主要影响因素[3]。
目前有关RS防治研究的文献较多，但所提出防治措施的疗效均未能显著降低RS的发生率15%～20%[2-4]，这严重阻碍了PTCA支架术的进一步发展、推广和应用。为提高PTCA支架术的疗效，降低RS的发生率，我们研究了恒磁场对离体兔ASMCs增殖的影响，探索冠脉内磁化支架预防RS发生的可能性。
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材料和方法
ASMCs的体外培养，无菌取出新西兰白兔(体重1.5±0.5 kg)主动脉段，刮出内膜后，剥脱中膜的平滑肌层，按照Ross贴片法用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液培养ASMCs，在CO2孵箱中静置培养7 d后，可见平滑肌细胞开始从组织块边缘爬出，待平滑肌细胞生长到一定密度后即传代培养，取其3～7代作为实验用细胞。
ASMCs的鉴定：相差显微镜下ASMCs呈梭形或长梭形，可重叠生长达多层，高低起伏呈“峰”“谷”状(图略)。透视电镜可见ASMCs的胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝及与其相联的致密体，部分细胞周围可见基膜(图略)。α-肌动蛋白抗体染色，淡蓝色的ASMCs胞核有淡棕色的阳性肌丝(图略)。
实验设计：将含5%小牛血清的RPMI-1640培养液与3～7代ASMCs的混悬液(细胞浓度为1×104/ml)100 μl加入96孔培养板中，对照组无磁场作用状态下在美制MODEL 2300 CO2孵箱中静止培养72 h；实验组静止培养24 h后置于0.35 T恒磁场(恒磁体为内蒙古产，平均磁感应强度0.35 T，长60 mm，宽40 mm，高25 mm，N极和S极对置，培养板位于两级中间)中继续培养48 h。
, http://www.100md.com
ASMCs增殖数量的检测：四唑盐比色法(MTT)：ASMCs培养72 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，继续孵育4 h后终止培养；吸弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，然后在国产DG3022A型酶联免疫检测仪上(波长490 mm)测定各孔光吸收值，结果以A值表示。3H-TdR掺入实验：ASMCs培养72 h后每孔加入3H-TdR 50 μl(5×10-3μCi/孔)，继续培养6 h后终止反应。用“9999”型纤维滤纸和ET-II型微量细胞收集仪收集细胞，滤纸经红外线烤箱烘干后，分别置于闪烁瓶中加入PPO/POPOP二甲苯闪烁液500 μl，在美制LS-6500液体闪烁计数器上测定核素闪烁计数值，结果以min表示。
统计方法：统计数据用均值±标准差表示，数据处理采用显著性t检验法。
结 果
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MTT法和3H-TdR掺入法测定的ASMCs增殖的A值与核素闪烁计数(min)值统计数据见表1。统计学检验表明，实验组ASMCs增殖的A值与min值均显著低于对照组(t＝3.816 6，3.932 2，P<0.001)。
表1 MTT法与3H-TdR掺入法测定的两组A值与核素闪烁计数值(X±s，n＝48)
组别
A值
核素闪烁计数值(min)
对照组
0.478 3±0.058 0
2 687±983
, 百拇医药
磁场组
0.294 8±0.044 8
1 378±596
讨 论 磁场治疗心血管系统的疾病已有很多报道[5]，但未见利用磁场对冠状动脉平滑肌细胞增殖的调控作用治疗PTCA支架术后冠脉再狭窄的报道。曾有报道脉冲磁场作用时间小于10 min时，磁场能够促进表皮细胞的增殖，大于10 min时抑制表皮细胞的增殖[6]。本组实验结果同样表现出了这种细胞生物学的抑制效应，而且ASMCs培养板放置于N极、S极相对的0.35 T恒磁场中能够极显著的抑制ASMCs的增殖。
磁场抑制ASMCs增殖的作用机理可能为：①磁场对细胞新陈代谢的影响：培养液中的荷电离子，如钾、钠、氯、钙、镁、磷等离子，在磁场的作用下，其荷电能力发生改变，影响了这些离子的移动速度和排列形式，使细胞代谢所需酶的活性或功能受到干扰，细胞代谢水平降低，细胞的增殖能力降低[6，7]；②磁场对DNA合成的影响：磁场的能量直接作用于DNA合成的信使转录系统，降低了DNA的合成速度，使ASMCs的增殖受到抑制[8]。
, http://www.100md.com
已知人体是一带生物电的机体， 由于内部电子的运动而产生磁场效应。人体物质代谢的实质是氧化还原最终产生能量，根据电子形成电流和磁场的原理，磁场可影响机体生物电的大小和方向。因此，受磁场作用后，机体出现血管扩张，血流速度加快，红细胞的变形能力增强，红细胞凝聚力降低，血粘度降低，所以冠脉内磁化支架有改善冠脉血液循环和防止血栓形成的作用[7，9，10]。
由于磁场既能改善冠脉血循环和防止血栓形成又能抑制冠状动脉平滑肌细胞的增殖，而且已有文献报道，适当强度的磁场对心脏的传导和收缩功能无显著影响[9-11]，因此，体内或体外磁疗可望显著降低PTCA支架后冠脉再狭窄的发生率，但有待于进一步的动物实验和临床试验证实。
吕安林(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
高歌(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
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贾国良(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
王小燕(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
郭文怡(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
王海昌(710032 西安，第四军医大学西京医院心脏内科)
参考文献
1，Darendeliler MA,Darendeliler A,Sinclair PM.Effects of static magnetic and pulsed electromagnetic fields on bone healing.Lnt J Adult Orthodon Orthognath Surg,1997,12:43-53.
, 百拇医药
2，Farb A,Sangiorgi G,Carter AJ,et al.Pathology of acute and chronic coronary stenting in humans.Circulation,1999,99:44-52.
3，Mgosaki N,Tsurumi Y,Hosoda S.Current approaches to restenosis after coronary interventions.Nippon Rinsho,1998,56:242-248.
4，Leon MB,Popma JJ,Mintz GS,et al.An overview of US coronary stent trials.Semi Interv Cardiol,1998,1:247-254.
5，Pang SC,Venanece SL.Cultured smooth muscle approaches in the study of hypertension.Can J Physiol Pharmacol,1992,70:573-579.
, 百拇医药
6，陈树德，张红锋，陈家森，等.低频电磁场对细胞生物学效应的影响.中华物理医学杂志，1998，20：78-80.
7，Nossol B,Buse G,Silny J.Influence weak static 50 Hz magnetic fields on the redox activity of cytochrome-C.Bioelectromagnetics,1993,14:361-372.
8，Lai H,Singh NP.Acute exposure to a 60 Hz magnetic field increases DNA strand breaks in rat brain cells.Bioelectromagnetics,1997,18:156-165.
9，Grassi-Schultheiss PP,Heller F,Dobson J.Analysis of magnetic material in the human heart,spleen and liver.Biometals,1997,10:351-355.
, 百拇医药
10，Mouchawar GA,bourland TD,Nyenhuis TA.Closed-chest cardiac stimulation with a pulsed magnetic field.Med Biol Eng Comput,1992,30:162-168.
11，Kazakova RT,Badakva AM.Effect of isolated and combined effect of a constant magnetic field and antiorthostatic hypokinesia on central hemodynamics in rats.Kosm Biol Avikosm Med,1991,25:48-49., http://www.100md.com