次声对PHA和同种异体抗原诱导小鼠脾细胞增殖的影响
次声对PHA和同种异体抗原诱导小鼠脾细胞增殖的影响
杨琨 张建平 金伯泉 陈景藻
摘 要：目的 观察次声对PHA诱导小鼠脾细胞增殖及同种异体抗原诱导T细胞增殖反应的影响。方法应用次声压力舱，建立小鼠动物实验模型。以8Hz、120dB次声作用于8wk龄雌性Balb/c鼠，每天作用2h，连续作用14d。取小鼠脾细胞，用PHA或同种异体抗原刺激后，采用3H-TdR掺入法检测脾细胞的增殖情况。结果次声能显著促进PHA诱导的小鼠脾细胞增殖，刺激指数(SI)为4.73±0.17，与正常对照组的SI(2.12±0.05)相比较，提高了2.23倍(P<0.01)。而次声对同种异体抗原诱导的T细胞增殖具有明显的下调作用，SI为2.48±0.12，较正常对照组4.59±0.32，降低45.97%(P<0.01)。结论次声能够影响机体免疫淋巴细胞的功能。
, 百拇医药
关键词：次声；PHA；同种异体抗原；脾细胞；增殖
次声(infrasound)作为一种低频率(≤20Hz)的声波，因其具有一些独特的物理学性质，可导致机体组织、器官发生共振，从而引起分子结构的改变和影响生物体内多种生物学功能。从60年代起，对次声及其生物学效应的研究开始受到各国学者的关注〔1〕。现已发现，次声不仅对人或动物神经系统和听觉系统具有抑制和损伤作用〔2-5〕，对肝细胞、眼组织、肺组织及心脏等众多细胞、组织和器官也有损害效应〔6-10〕。此外，次声还可对某些细胞膜的通透性及酶的活性产生不同的影响〔11-13〕。然而，次声对免疫系统影响的研究才刚刚开始。到目前为止，国际上仅有一篇文献报道，以10Hz、155～160dB的次声作用于豚鼠10min，可降低变应原所致豚鼠超敏反应的死亡率〔14〕。至于次声作用后对机体免疫细胞(T细胞)的影响尚未见有报道。
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1材料和方法
1.1材料 Balb/c(H-2b)小鼠和C57BL/6(H-2b)小鼠，均由本校实验动物中心提供。PHA为美国Sigma公司产品，3HTdR购自上海原子能研究所。
1.2方法
1.2.1动物模型的建立 将6～8wk龄雌性Balb/c小鼠(20～22g)，置于特制的次声压力舱中，分别用8Hz和10Hz的频率及90dB，100dB，110dB和120dB的声压级(次声剂量)作用于小鼠，每天作用2h，持续时间分别为7，10和14d。同时设正常对照组，即将小鼠也置于次声压力舱中相同的时间，但不给予次声。
1.2.2PHA诱导的脾细胞增殖实验 无菌取正常组、次声组及对照组Balb/c小鼠的脾脏，按本室常规制备脾细胞悬液，活细胞计数后调整淋巴细胞的浓度至5×109/L。以上述同样方法无菌取正常C57BL/6小鼠的脾脏、制备脾细胞悬液，再以3000rad60Coγ射线照射。将Balb/c小鼠脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中(100μL/孔)，再加入PHA(100μL/孔)，并设3个复孔。同时设不加PHA的空白对照。置50mL/LCO2培养箱中孵育66h后，加入3H-TdR，1.85×104Bq(50μL/孔)。6h后，收获细胞于9999型玻璃滤纸上，烤干、加入闪烁液进行β-计数。所获结果用刺激指数(SI)表示：
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1.2.3同种异体抗原诱导的脾细胞增殖 将Balb/c小鼠脾细胞悬液和经60Co-γ射线照射的C57BL/6小鼠脾细胞悬液，分别加入96孔培养板中，100μL/孔。同时以单独Balb/c小鼠脾细胞悬液和经60Co-γ射线照射的C57BL/6小鼠脾细胞悬液作为对照。置50mL/LCO2培养箱中孵育90h后，加入3H-TdR，1.85×104Bq(50μL/孔)。6h后，同上收获细胞进行β-计数。
2结果
2.1动物模型的建立 用不同频率、不同剂量的次声作用于小鼠不同时间进行实验，发现以8Hz、120dB的次声，每天作用2h，连续作用14d，对小鼠淋巴细胞功能的影响最大。
2.2次声对PHA诱导小鼠脾细胞增殖的影响 将不同剂量的PHA加入不同浓度正常Balb/c小鼠脾细胞悬液中进行增殖实验。以掺入3H-TdR的值(cpm)对PHA的浓度绘制剂量依赖曲线(图1)。从图中可见，PHA可刺激Balb/c小鼠的脾细胞增殖，且呈剂量依赖关系。根据剂量依赖曲线，我们选择PHA的最适诱导浓度为6mg/L，脾细胞的最佳浓度为5×109/L。
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图1PHA诱导Balb/c小鼠脾细胞增殖的剂量依赖曲线
Fig1 Dose-dependent curve for PHA-induced proliferation
of splenocytes from Balb/cmice
关于次声作用组和正常对照组小鼠(各6只)脾细胞对PHA诱导增殖的反应性，共重复3次实验。结果表明，次声作用组小鼠脾细胞的增殖明显高于正常对照组(SI分别为4.73±0.17和2.12±0.05)，可提高2.23倍(P∨0.01，图2)。
图2次声对PHA和同种异体抗原诱导小鼠脾细胞增殖的影响
, 百拇医药
Fig2 Effect of in frasound on the proliferation of splenocytes induced by PHA and alloantigen
2.3次声对同种异体抗原诱导小鼠MLR的影响
以60Co-γ射线照射的C57BL/6小鼠脾细胞为刺激细胞，Balb/c小鼠的脾细胞为反应细胞，进行单向混合淋巴细胞反应(MLR)，观察次声作用组和正常对照组的MLR。结果表明，次声作用组脾细胞的增殖反应明显低于正常对照组，SI分别为2.48±0.12和4.59±0.32，可降低45.97%(P∨0.01，图2)。
3讨论
次声对机体的基本作用原理是生物共振。人体可看作是机械振动系统，一些组织、器官的振动频率即在次声频率范围内。一般情况下，机体处于平衡状态，当将机体置于次声声压场时，特别是组织、器官的自身振动频率接近或符合次声压力场的振动频率时，即发生共振反应。次声作用引起的组织器官的共振性颤动，可刺激机体本体感受器和内脏器官感受器，并通过这些类型的感受器可将振动信息传递到中枢神经系统，从而进一步反射性引起这些组织器官的生理反应。此外，振动的机械能可转化为热能、生物化学能及生物电能，直接作用于这些组织器官，最终造成机体某些系统和组织器官的功能障碍和器质性改变，同时还可影响机体的适应性调节机能。
, 百拇医药
我们应用次声压力舱，观察了次声对机体免疫淋巴细胞功能的影响。结果表明，次声能显著促进PHA诱导的小鼠脾细胞增殖，而对同种异体抗原诱导的T细胞增殖则具有明显的下调作用。本研究提示，次声对小鼠淋巴细胞的功能表现为两种不同的作用，在促进PHA刺激的脾淋巴细胞增殖的同时，对同种异体抗原诱导的混合淋巴细胞反应则呈抑制作用。由于PHA与同种异体抗原刺激淋巴细胞增殖的作用机制有所不同，PHA可能是作为一种凝集素，使淋巴细胞凝聚后在相互之间辅助分子的共同作用下导致脾细胞增殖，而同种异体抗原诱导的淋巴细胞增殖则是对抗原的应答过程。次声有可能分别作用于二者诱导途径的不同环节，最终导致了相反的反应。对这种反应的意义有待于进一步探讨。
基金项目：全军医药卫生科研基金重点资助，No.96Z042
作者简介：杨琨，女，36岁，讲师，博士生
杨琨(第四军医大学基础部免疫学教研室，陕西 西安 710032)
, 百拇医药
张建平(第四军医大学基础部免疫学教研室，陕西 西安 710032)
金伯泉(第四军医大学基础部免疫学教研室，陕西 西安 710032)
陈景藻(第四军医大学西京医院理疗科，陕西 西安 710032)
参考文献：
[1]Pawlaczyk-Luszczynska M.The influence and sources of infrasound:review of literature[J].MedPr,1998;49(5):489-492.
[2]Arabadzhi VI.Infrasound and biorhythms of the human brain[J].Biofizika,1992;37(1):150-151.
, http://www.100md.com
[3]Svidovyi VI,Glinchikov VV.Reaction of the nervous system cells to infrasound[J].Gig Tr Prof Zabol,1991;6:37-38.
[4]Nekhoroshev AS,Glinchikov VV.Mechanism of the effect of infrasound on labyrinthine receptors[J].Kosm Biol Aviakosm Med,1990;24(6):39-42.
[5]Anichin VF,Nekhoroshev AS.Reaction of vessels of the middle ear system of the guinea pig in response to exposure to infrasound[J].Gig Tr Prof Zabol,1985;9:43-44.
, 百拇医药
[6]Nekhoroshev AS,Glinchikov VV.Morphological research on the liver structures of experimental animals under the action of infrasound[J].Aviakosm Ekolog Med.1992;26(3):56-59.
[7]Nekhoroshev AS,Glinchikov VV.Reaction of hepatocytes to infrasound exposure[J].Gig Sanit,1991;2:45-47.
[8]Nekhoroshev AS,Glinchikov VV.Morpho-functional changes in the myocardium after exposure to infrasound[J].Gig Sanit,1991;12:56-58.
, http://www.100md.com
[9]Sidorenko EI,Zelikman MKh,Kaplina AV.Changes in eye tissues exposed to local action of infrasound[J].Oftalmol Zh,1988;2:109-111.
[10]Svidovyi VI,Glinchikov VV.Effect of infrasound on pulmonary structure[J].Gig Tr Prof Zabol,1987;1:34-37.
[11]Svidovyi VI,Kolmakov VN,Kuleba VA,et al.Change in the permeability and total ATPase activity of erthrocytes and blood plasma superoxide dismutase activity on exposure to infrasound in vitro[J].Gig Sanit,1987;5:78-79.
, 百拇医药
[12]Svidovyi VI,Shleikin AG.Effect of infrasound on tissue succinate dehydrogenase activity[J].Gig Tr Prof Zabol,1987;5:50-52.
[13]Svidovyi VI,Kolmakov VN,Kuznetsova GV.Changes in the aminotransferase activity and erythrocyte membrane permeability in exposure to infrasound and low-frequency noise[J].Gig Sanit,1985;10:73-74.
[14]Batanov GV.Characteristics of etiology of immedate hypersensitivity in conditions of exposure to infrasound[J].Radiats Biol Radioecol,1995;35(1):78-82., http://www.100md.com
杨琨 张建平 金伯泉 陈景藻
摘 要：目的 观察次声对PHA诱导小鼠脾细胞增殖及同种异体抗原诱导T细胞增殖反应的影响。方法应用次声压力舱，建立小鼠动物实验模型。以8Hz、120dB次声作用于8wk龄雌性Balb/c鼠，每天作用2h，连续作用14d。取小鼠脾细胞，用PHA或同种异体抗原刺激后，采用3H-TdR掺入法检测脾细胞的增殖情况。结果次声能显著促进PHA诱导的小鼠脾细胞增殖，刺激指数(SI)为4.73±0.17，与正常对照组的SI(2.12±0.05)相比较，提高了2.23倍(P<0.01)。而次声对同种异体抗原诱导的T细胞增殖具有明显的下调作用，SI为2.48±0.12，较正常对照组4.59±0.32，降低45.97%(P<0.01)。结论次声能够影响机体免疫淋巴细胞的功能。
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关键词：次声；PHA；同种异体抗原；脾细胞；增殖
次声(infrasound)作为一种低频率(≤20Hz)的声波，因其具有一些独特的物理学性质，可导致机体组织、器官发生共振，从而引起分子结构的改变和影响生物体内多种生物学功能。从60年代起，对次声及其生物学效应的研究开始受到各国学者的关注〔1〕。现已发现，次声不仅对人或动物神经系统和听觉系统具有抑制和损伤作用〔2-5〕，对肝细胞、眼组织、肺组织及心脏等众多细胞、组织和器官也有损害效应〔6-10〕。此外，次声还可对某些细胞膜的通透性及酶的活性产生不同的影响〔11-13〕。然而，次声对免疫系统影响的研究才刚刚开始。到目前为止，国际上仅有一篇文献报道，以10Hz、155～160dB的次声作用于豚鼠10min，可降低变应原所致豚鼠超敏反应的死亡率〔14〕。至于次声作用后对机体免疫细胞(T细胞)的影响尚未见有报道。
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1材料和方法
1.1材料 Balb/c(H-2b)小鼠和C57BL/6(H-2b)小鼠，均由本校实验动物中心提供。PHA为美国Sigma公司产品，3HTdR购自上海原子能研究所。
1.2方法
1.2.1动物模型的建立 将6～8wk龄雌性Balb/c小鼠(20～22g)，置于特制的次声压力舱中，分别用8Hz和10Hz的频率及90dB，100dB，110dB和120dB的声压级(次声剂量)作用于小鼠，每天作用2h，持续时间分别为7，10和14d。同时设正常对照组，即将小鼠也置于次声压力舱中相同的时间，但不给予次声。
1.2.2PHA诱导的脾细胞增殖实验 无菌取正常组、次声组及对照组Balb/c小鼠的脾脏，按本室常规制备脾细胞悬液，活细胞计数后调整淋巴细胞的浓度至5×109/L。以上述同样方法无菌取正常C57BL/6小鼠的脾脏、制备脾细胞悬液，再以3000rad60Coγ射线照射。将Balb/c小鼠脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中(100μL/孔)，再加入PHA(100μL/孔)，并设3个复孔。同时设不加PHA的空白对照。置50mL/LCO2培养箱中孵育66h后，加入3H-TdR，1.85×104Bq(50μL/孔)。6h后，收获细胞于9999型玻璃滤纸上，烤干、加入闪烁液进行β-计数。所获结果用刺激指数(SI)表示：
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1.2.3同种异体抗原诱导的脾细胞增殖 将Balb/c小鼠脾细胞悬液和经60Co-γ射线照射的C57BL/6小鼠脾细胞悬液，分别加入96孔培养板中，100μL/孔。同时以单独Balb/c小鼠脾细胞悬液和经60Co-γ射线照射的C57BL/6小鼠脾细胞悬液作为对照。置50mL/LCO2培养箱中孵育90h后，加入3H-TdR，1.85×104Bq(50μL/孔)。6h后，同上收获细胞进行β-计数。
2结果
2.1动物模型的建立 用不同频率、不同剂量的次声作用于小鼠不同时间进行实验，发现以8Hz、120dB的次声，每天作用2h，连续作用14d，对小鼠淋巴细胞功能的影响最大。
2.2次声对PHA诱导小鼠脾细胞增殖的影响 将不同剂量的PHA加入不同浓度正常Balb/c小鼠脾细胞悬液中进行增殖实验。以掺入3H-TdR的值(cpm)对PHA的浓度绘制剂量依赖曲线(图1)。从图中可见，PHA可刺激Balb/c小鼠的脾细胞增殖，且呈剂量依赖关系。根据剂量依赖曲线，我们选择PHA的最适诱导浓度为6mg/L，脾细胞的最佳浓度为5×109/L。
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图1PHA诱导Balb/c小鼠脾细胞增殖的剂量依赖曲线
Fig1 Dose-dependent curve for PHA-induced proliferation
of splenocytes from Balb/cmice
关于次声作用组和正常对照组小鼠(各6只)脾细胞对PHA诱导增殖的反应性，共重复3次实验。结果表明，次声作用组小鼠脾细胞的增殖明显高于正常对照组(SI分别为4.73±0.17和2.12±0.05)，可提高2.23倍(P∨0.01，图2)。
图2次声对PHA和同种异体抗原诱导小鼠脾细胞增殖的影响
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Fig2 Effect of in frasound on the proliferation of splenocytes induced by PHA and alloantigen
2.3次声对同种异体抗原诱导小鼠MLR的影响
以60Co-γ射线照射的C57BL/6小鼠脾细胞为刺激细胞，Balb/c小鼠的脾细胞为反应细胞，进行单向混合淋巴细胞反应(MLR)，观察次声作用组和正常对照组的MLR。结果表明，次声作用组脾细胞的增殖反应明显低于正常对照组，SI分别为2.48±0.12和4.59±0.32，可降低45.97%(P∨0.01，图2)。
3讨论
次声对机体的基本作用原理是生物共振。人体可看作是机械振动系统，一些组织、器官的振动频率即在次声频率范围内。一般情况下，机体处于平衡状态，当将机体置于次声声压场时，特别是组织、器官的自身振动频率接近或符合次声压力场的振动频率时，即发生共振反应。次声作用引起的组织器官的共振性颤动，可刺激机体本体感受器和内脏器官感受器，并通过这些类型的感受器可将振动信息传递到中枢神经系统，从而进一步反射性引起这些组织器官的生理反应。此外，振动的机械能可转化为热能、生物化学能及生物电能，直接作用于这些组织器官，最终造成机体某些系统和组织器官的功能障碍和器质性改变，同时还可影响机体的适应性调节机能。
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我们应用次声压力舱，观察了次声对机体免疫淋巴细胞功能的影响。结果表明，次声能显著促进PHA诱导的小鼠脾细胞增殖，而对同种异体抗原诱导的T细胞增殖则具有明显的下调作用。本研究提示，次声对小鼠淋巴细胞的功能表现为两种不同的作用，在促进PHA刺激的脾淋巴细胞增殖的同时，对同种异体抗原诱导的混合淋巴细胞反应则呈抑制作用。由于PHA与同种异体抗原刺激淋巴细胞增殖的作用机制有所不同，PHA可能是作为一种凝集素，使淋巴细胞凝聚后在相互之间辅助分子的共同作用下导致脾细胞增殖，而同种异体抗原诱导的淋巴细胞增殖则是对抗原的应答过程。次声有可能分别作用于二者诱导途径的不同环节，最终导致了相反的反应。对这种反应的意义有待于进一步探讨。
基金项目：全军医药卫生科研基金重点资助，No.96Z042
作者简介：杨琨，女，36岁，讲师，博士生
杨琨(第四军医大学基础部免疫学教研室，陕西 西安 710032)
, 百拇医药
张建平(第四军医大学基础部免疫学教研室，陕西 西安 710032)
金伯泉(第四军医大学基础部免疫学教研室，陕西 西安 710032)
陈景藻(第四军医大学西京医院理疗科，陕西 西安 710032)
参考文献：
[1]Pawlaczyk-Luszczynska M.The influence and sources of infrasound:review of literature[J].MedPr,1998;49(5):489-492.
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[3]Svidovyi VI,Glinchikov VV.Reaction of the nervous system cells to infrasound[J].Gig Tr Prof Zabol,1991;6:37-38.
[4]Nekhoroshev AS,Glinchikov VV.Mechanism of the effect of infrasound on labyrinthine receptors[J].Kosm Biol Aviakosm Med,1990;24(6):39-42.
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, 百拇医药
[6]Nekhoroshev AS,Glinchikov VV.Morphological research on the liver structures of experimental animals under the action of infrasound[J].Aviakosm Ekolog Med.1992;26(3):56-59.
[7]Nekhoroshev AS,Glinchikov VV.Reaction of hepatocytes to infrasound exposure[J].Gig Sanit,1991;2:45-47.
[8]Nekhoroshev AS,Glinchikov VV.Morpho-functional changes in the myocardium after exposure to infrasound[J].Gig Sanit,1991;12:56-58.
, http://www.100md.com
[9]Sidorenko EI,Zelikman MKh,Kaplina AV.Changes in eye tissues exposed to local action of infrasound[J].Oftalmol Zh,1988;2:109-111.
[10]Svidovyi VI,Glinchikov VV.Effect of infrasound on pulmonary structure[J].Gig Tr Prof Zabol,1987;1:34-37.
[11]Svidovyi VI,Kolmakov VN,Kuleba VA,et al.Change in the permeability and total ATPase activity of erthrocytes and blood plasma superoxide dismutase activity on exposure to infrasound in vitro[J].Gig Sanit,1987;5:78-79.
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[14]Batanov GV.Characteristics of etiology of immedate hypersensitivity in conditions of exposure to infrasound[J].Radiats Biol Radioecol,1995;35(1):78-82., http://www.100md.com