眼表重建术后局部应用FK-506的初步临床观察
眼表重建术后局部应用FK-506的初步临床观察
林跃生 陈家祺 刘永民 周世友 谢汉平 王敏华
摘 要 目的 寻找眼表重建术后主要并发症的有效治疗措施。方法 对32例32只严重化学伤患眼施眼表重建术(板层角膜移植、角膜缘移植及羊膜移植术)，随机将研究对象分为治疗组及对照组(各16只眼)；治疗组于术后1wk局部应用0.5g.L-1的FK-506滴眼液，对照组应用10g.L-1CsA滴眼液，观察2组角膜新生血管指数、移植组织的排斥反应指数。结果 在随访期内，治疗组的组织排斥反应时间、发生率、角膜假性胬肉及睑球粘连4个指标均明显优于对照组。结论 局部应用FK-506可有效提高眼表重建术的成功率。
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关键词：FK-506；角膜；排斥反应；愈合
由于化学伤、热灼伤及其他原因造成的眼表疾病是我国常见而严重的致盲眼病之一，目前正引起眼科界的高度重视。1995年1月至1998年4月期间，因严重眼表疾病致盲而被我院收治的患者805例，其中约64.8%的视力≤0.05。为使这些患者有效脱盲，目前多采用眼表重建术以恢复结膜与角膜的正常解剖生理功能。然而导致眼表重建手术失败的主要原因是移植物排斥反应。为有效地提高眼表重建术的成功率，我们于术后局部应用新型高效免疫抑制剂(FK-506)，收到一定的临床效果，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 病例选择 选择1997年1月至1998年12月在我院角膜病科住院的严重眼表疾病患者32例32只眼。其中男24例，女8例，年龄26～49a，平均32.2a。致盲原因分别为化学伤20例(62.50%)、热灼伤8例(25.00%)、复发性胬肉2例(6.25%)、蚕蚀性角膜溃疡2例(6.25%)。
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1.2 手术方法 在本组病例中施睑球粘连分离+羊膜移植+角膜缘移植+板层角膜移植术12例；施睑球粘连分离+羊膜移植+角膜缘移植术10例；施角膜缘移植术6例、施板层角膜移植术4例。所有羊膜及角膜供体材料均应用新鲜短期保存材料。角膜缘及角膜移植用10-0尼龙线缝合，羊膜移植用8-0可吸收线缝合。
1.3 药物 FK-506为日本Fujisawa药品有限公司上市注射液(5g.L-1)，经我院眼药制剂室将溶剂中的乙醇与氢化蓖麻油去除，然后加入适量的NaCl、羟丙基甲基纤维素及硫柳汞、注射用水调剂成0.5g.L-1的标准水溶性滴眼液。经动物实验、人体耐受性试验及药代动力学研究，确认其安全性与有效性后应用于上述病例。环胞霉素A(CsA)采用Sandoz药厂出品的口服液，应用蓖麻油稀释为10g.L-1CsA溶液，皮质类固醇应用美国爱尔康公司上市产品点必舒。
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1.4 用药方案 将上述研究病例按随机原则分治疗组及对照组各16例16只眼。治疗组的投药方案为：FK-506+点必舒+Solcoseryl Eye Gel；对照组的投药方案为：CsA+点必舒+Solcoseryl Eye Gel;每种药物均为每天4次，点必舒于术后1mo开始逐步减量。术后5d开始投药，持续3～9mo，平均随访6mo。
1.5 观察指标
1.5.1 角膜新生血管指数分0～3级 0级为术后角膜新生血管无增加(0分)；1级为新生血管轻度增加(≤10条，1分)；2级为新生血管中度增加(10～20条，2分)；3级为新生血管重度增加(>20条，3分)。
1.5.2 角膜上皮排斥反应 上皮排斥以典型的上皮排斥线为指标，记录出现及持续的时间。
1.5.3 移植片排斥反应 以植片混浊水肿为标准，分0～3级。0级无水肿混浊(0分)；1级为轻度水肿混浊(可见虹膜结构，1分)；2级为中度水肿混浊(可见前房，2分)；3级为重度水肿混浊(看不到前房，3分)。
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1.5.4 假性胬肉指数分0～3级 0级为无假性胬肉长入；1级为胬肉长入角膜的径长与弦长之和≤5mm(1分)；2级为胬肉的径长与弦长之和为5～10mm(2分)；3级为胬肉的径长与弦长之和≥10mm(3分)。
1.5.5 睑球粘连改善程度分0～3级 0级为术后无睑球粘连(0分)；1级为睑球粘连象限<1/3圆周，睑球活动度无明显影响(1分)；2级为睑球粘连1/3～1/2圆周，穹窿变浅，睑球活动中度受限(2分)；3级为睑球粘连>1/2圆周，穹窿消失，睑球活动严重受限(3分)。
1.6 结果记录与统计方法 本研究病例全部由我院角膜病科教授在统一标准下施术，术后由专人负责定期随访记录，所有数字均输入计算机作统计学分析。
2 结果
2.1 术后上皮排斥反应发生率 在随访期内，治疗组与对照组的上皮排斥反应发生率分别为56.3%及81.3%(u检验，P<0.01)；上皮排斥反应持续时间分别为2.35d±1.76d及3.18d±1.89d(u检验，P<0.05)。
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2.2 角膜新生血管指数 在随访期内，治疗组与对照组角膜移植片新生血管指数分别为1.46±1.01及2.34±1.53(u检验，P<0.01)，2组间有显著性差异。
2.3 角膜移植片排斥反应 随访期末，2组角膜移植片水肿混浊指数分别为1.13±0.79及2.67±1.19(u检验，P<0.01)；移植片的排斥反应发生率分别为43.8%及75.0%(u检验，P<0.01)，2组间具有极显著差异。
2.4 假性胬肉发生指数 按上述评价，治疗组及对照组假性胬肉发生指数分别为1.04±0.81及2.31±1.33(u检验，P<0.05)。
2.5 睑球粘连 随访期末，2组按观察指标评分，治疗组的平均分数为1.31±0.87，对照组的平均分数为2.60±1.03(u检验，P<0.05)，2组差异有显著意义。
2.6 不良反应发生率 FK-506局部滴眼未见刺痛、上皮毒性等不良反应，而10g.L-1CsA滴眼液却有明显刺痛感。
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3 讨论
3.1 眼表重建术在治疗严重眼表疾病中的地位与存在问题 1986年，Schermer应用免疫组化技术首次提出了角膜缘干细胞(stem cells,SCs)的概念，后来的研究证明正常情况下角膜缘干细胞是角膜上皮细胞增殖分化的源泉并具有上皮屏障作用，它能阻止结膜上皮及血管向角膜内生长[1，2]。当外伤、感染与免疫等因素使SCs缺乏或功能不全时，眼表便会出现角膜上皮结膜化、血管化、慢性炎症、复发性上皮糜烂及持续上皮缺损、瘢痕与假性胬肉的形成[3]。对此，传统的角膜移植术很难达到预期目的。1989年Kengon等在Thoft结膜移植的基础上首先提出了自体角膜缘移植术(limbal autograft transplantation,LAUT)，眼表疾病的疗效取得了进一步的改良[4]。此手术虽解决了OSDs的部分问题，但对于严重眼表损伤患者来说，自体的SCs显然有限。为了解决供体来源不足的问题，Tsai等首次报告了同种异体角膜缘移植术(limbal allograft transplation,LALT)，然而人体的角膜缘供体仍然受到许多因素的制约。因此，Kiritoshi等[4]对培养的人角膜缘上皮移植进行了可行性研究，从而为OSDs的治疗开拓了一个新的领域。另外，为了解决结膜移植供体这一临床难题，1981年Akle等[5]发现新鲜的羊膜抗原性很低，移植于眼表后几乎不发生排斥反应，从此揭开了羊膜移植重建眼表的序幕，取得了令人振奋的临床效果。
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LATL及羊膜移植成为目前OSDs治疗的重要手段，但术后移植物排斥反应仍是造成手术失败的头号并发症。面对这一临床难题，传统的治疗方法是应用糖皮质激素及CsA，但效果都不尽人意。为了有效解决上述问题，提高眼表重建术的临床效果，研制新型、高效、安全的免疫抑制剂是提高眼表重建术成功率的关键措施。
3.2 FK-506局部应用的药理基础及临床价值 FK-506是日本藤泽制药有限公司研制的新型高效免疫抑制剂，国内外的研究结果一致表明，该药可有效抑制机体的细胞与体液免疫，对多种器官的同种异体移植术排斥反应均显示了高度的免疫抑制效果，且效价明显高于CsA。它与CsA相似，其主要作用机理是使T细胞增殖与活化受到限制[7]。我们经药代动力学及人体耐受性试验研究发现，该药的局部应用具有安全、高效、无全身毒副作用的特点，其0.5g.L-1的滴眼液是将5g.L-1的注射液用抽真空离心方法去除其中的乙醇而配制成标准的水溶液，经初步临床应用，取得了良好效果。
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3.3 眼表重建术后局部应用FK-506可有效控制移植物的免疫排斥反应。LAUT虽可避免排斥反应的发生，但对于严重眼表疾病及双眼受伤患者显然不能解决供体来源问题；LALT虽可解决供体问题，但术后不可避免将出现排斥反应。传统的抗排斥措施是局部应用糖皮质激素及CsA，但两者均不能完全抑制该并发症的出现，且由于药物本身的毒副作用而进一步影响其临床使用的时间与效果。我们在动物实验、人体耐受性试验及药代动力学研究的基础上，对FK-506局部临床应用进行了有效的探索。经研究配制成的0.5g.L-1的FK-506滴眼液具有无刺激性、临床效价高、无全身毒副作用的优点。本研究表明，该药可有效的抑制角膜新生血管的再生、延长移植片及角膜的透明维持时间、有效降低排斥反应的发生率，其临床的免疫抑制效价明显高于10g.L-1CsA，具有良好的开发应用前景。
我们相信，在其他药物的协同下，该药的局部应用可望成为提高眼表重建术成功率的另一重要措施。
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基金项目：卫生部课题基金(961122)，广东省自然科学基金(960145)及广东省重点科技攻关项目(962205004)资助
作者简介：林跃生，男，生于1960年8月，广东揭阳人，汉族。1983年中山医科大学医学系毕业，获学士学位。现任中山医科大学中山眼科中心眼科医院角膜病科主任医师，硕士研究生导师。主要从事角膜病、角膜移植术、角膜屈光手术及眼表疾病的防治研究。近5年完成第一作者的大学以上科研项目6项；发表第一作者学术论著25篇；参与3部学术著作的撰写；先后获得第一完成人的部委级科研成果3项。
作者单位：林跃生(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
陈家祺(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
刘永民(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
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周世友(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
谢汉平(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
王敏华(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
参考文献
1，Galvins SA.Differentiation related expression of a major 64k corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells[J].J Cell Biol 1986;103∶49-62.
2，Huang AJW,Tseng SCG.Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epitheleum[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1991;32∶96-105.
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3，Tseng SCG,Tsubota K.Important concepts for treating ocular surface and tear disorders[J].Am J Ophthalmol 1997;124∶825-835.
4，Kiritoshi A,Sundar-Raj N,Thoft RA.Differentiation in cultured limbal epithelium as defined by keratin expression[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1991;32∶3073-3077.
5，Akle CA,Adinlofi M,welsh KI,et al.Immuogenicity of human amniotic epithelial cells after transplantation into volunteers[J].Lancet 1981;8254∶1003-1005.
6，Mills RA,Jones DB,Winkler CR,et al.Topical FK-506 prevints experimental corneal allograft rejection[J].Cornea 1995;14∶157-160.
7，吕 岚，张文华，孙旭光.FK-506抑制大鼠角膜移植排斥反应的研究[J].中华眼科杂志 1999；35∶25-27., 百拇医药
林跃生 陈家祺 刘永民 周世友 谢汉平 王敏华
摘 要 目的 寻找眼表重建术后主要并发症的有效治疗措施。方法 对32例32只严重化学伤患眼施眼表重建术(板层角膜移植、角膜缘移植及羊膜移植术)，随机将研究对象分为治疗组及对照组(各16只眼)；治疗组于术后1wk局部应用0.5g.L-1的FK-506滴眼液，对照组应用10g.L-1CsA滴眼液，观察2组角膜新生血管指数、移植组织的排斥反应指数。结果 在随访期内，治疗组的组织排斥反应时间、发生率、角膜假性胬肉及睑球粘连4个指标均明显优于对照组。结论 局部应用FK-506可有效提高眼表重建术的成功率。
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关键词：FK-506；角膜；排斥反应；愈合
由于化学伤、热灼伤及其他原因造成的眼表疾病是我国常见而严重的致盲眼病之一，目前正引起眼科界的高度重视。1995年1月至1998年4月期间，因严重眼表疾病致盲而被我院收治的患者805例，其中约64.8%的视力≤0.05。为使这些患者有效脱盲，目前多采用眼表重建术以恢复结膜与角膜的正常解剖生理功能。然而导致眼表重建手术失败的主要原因是移植物排斥反应。为有效地提高眼表重建术的成功率，我们于术后局部应用新型高效免疫抑制剂(FK-506)，收到一定的临床效果，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 病例选择 选择1997年1月至1998年12月在我院角膜病科住院的严重眼表疾病患者32例32只眼。其中男24例，女8例，年龄26～49a，平均32.2a。致盲原因分别为化学伤20例(62.50%)、热灼伤8例(25.00%)、复发性胬肉2例(6.25%)、蚕蚀性角膜溃疡2例(6.25%)。
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1.2 手术方法 在本组病例中施睑球粘连分离+羊膜移植+角膜缘移植+板层角膜移植术12例；施睑球粘连分离+羊膜移植+角膜缘移植术10例；施角膜缘移植术6例、施板层角膜移植术4例。所有羊膜及角膜供体材料均应用新鲜短期保存材料。角膜缘及角膜移植用10-0尼龙线缝合，羊膜移植用8-0可吸收线缝合。
1.3 药物 FK-506为日本Fujisawa药品有限公司上市注射液(5g.L-1)，经我院眼药制剂室将溶剂中的乙醇与氢化蓖麻油去除，然后加入适量的NaCl、羟丙基甲基纤维素及硫柳汞、注射用水调剂成0.5g.L-1的标准水溶性滴眼液。经动物实验、人体耐受性试验及药代动力学研究，确认其安全性与有效性后应用于上述病例。环胞霉素A(CsA)采用Sandoz药厂出品的口服液，应用蓖麻油稀释为10g.L-1CsA溶液，皮质类固醇应用美国爱尔康公司上市产品点必舒。
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1.4 用药方案 将上述研究病例按随机原则分治疗组及对照组各16例16只眼。治疗组的投药方案为：FK-506+点必舒+Solcoseryl Eye Gel；对照组的投药方案为：CsA+点必舒+Solcoseryl Eye Gel;每种药物均为每天4次，点必舒于术后1mo开始逐步减量。术后5d开始投药，持续3～9mo，平均随访6mo。
1.5 观察指标
1.5.1 角膜新生血管指数分0～3级 0级为术后角膜新生血管无增加(0分)；1级为新生血管轻度增加(≤10条，1分)；2级为新生血管中度增加(10～20条，2分)；3级为新生血管重度增加(>20条，3分)。
1.5.2 角膜上皮排斥反应 上皮排斥以典型的上皮排斥线为指标，记录出现及持续的时间。
1.5.3 移植片排斥反应 以植片混浊水肿为标准，分0～3级。0级无水肿混浊(0分)；1级为轻度水肿混浊(可见虹膜结构，1分)；2级为中度水肿混浊(可见前房，2分)；3级为重度水肿混浊(看不到前房，3分)。
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1.5.4 假性胬肉指数分0～3级 0级为无假性胬肉长入；1级为胬肉长入角膜的径长与弦长之和≤5mm(1分)；2级为胬肉的径长与弦长之和为5～10mm(2分)；3级为胬肉的径长与弦长之和≥10mm(3分)。
1.5.5 睑球粘连改善程度分0～3级 0级为术后无睑球粘连(0分)；1级为睑球粘连象限<1/3圆周，睑球活动度无明显影响(1分)；2级为睑球粘连1/3～1/2圆周，穹窿变浅，睑球活动中度受限(2分)；3级为睑球粘连>1/2圆周，穹窿消失，睑球活动严重受限(3分)。
1.6 结果记录与统计方法 本研究病例全部由我院角膜病科教授在统一标准下施术，术后由专人负责定期随访记录，所有数字均输入计算机作统计学分析。
2 结果
2.1 术后上皮排斥反应发生率 在随访期内，治疗组与对照组的上皮排斥反应发生率分别为56.3%及81.3%(u检验，P<0.01)；上皮排斥反应持续时间分别为2.35d±1.76d及3.18d±1.89d(u检验，P<0.05)。
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2.2 角膜新生血管指数 在随访期内，治疗组与对照组角膜移植片新生血管指数分别为1.46±1.01及2.34±1.53(u检验，P<0.01)，2组间有显著性差异。
2.3 角膜移植片排斥反应 随访期末，2组角膜移植片水肿混浊指数分别为1.13±0.79及2.67±1.19(u检验，P<0.01)；移植片的排斥反应发生率分别为43.8%及75.0%(u检验，P<0.01)，2组间具有极显著差异。
2.4 假性胬肉发生指数 按上述评价，治疗组及对照组假性胬肉发生指数分别为1.04±0.81及2.31±1.33(u检验，P<0.05)。
2.5 睑球粘连 随访期末，2组按观察指标评分，治疗组的平均分数为1.31±0.87，对照组的平均分数为2.60±1.03(u检验，P<0.05)，2组差异有显著意义。
2.6 不良反应发生率 FK-506局部滴眼未见刺痛、上皮毒性等不良反应，而10g.L-1CsA滴眼液却有明显刺痛感。
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3 讨论
3.1 眼表重建术在治疗严重眼表疾病中的地位与存在问题 1986年，Schermer应用免疫组化技术首次提出了角膜缘干细胞(stem cells,SCs)的概念，后来的研究证明正常情况下角膜缘干细胞是角膜上皮细胞增殖分化的源泉并具有上皮屏障作用，它能阻止结膜上皮及血管向角膜内生长[1，2]。当外伤、感染与免疫等因素使SCs缺乏或功能不全时，眼表便会出现角膜上皮结膜化、血管化、慢性炎症、复发性上皮糜烂及持续上皮缺损、瘢痕与假性胬肉的形成[3]。对此，传统的角膜移植术很难达到预期目的。1989年Kengon等在Thoft结膜移植的基础上首先提出了自体角膜缘移植术(limbal autograft transplantation,LAUT)，眼表疾病的疗效取得了进一步的改良[4]。此手术虽解决了OSDs的部分问题，但对于严重眼表损伤患者来说，自体的SCs显然有限。为了解决供体来源不足的问题，Tsai等首次报告了同种异体角膜缘移植术(limbal allograft transplation,LALT)，然而人体的角膜缘供体仍然受到许多因素的制约。因此，Kiritoshi等[4]对培养的人角膜缘上皮移植进行了可行性研究，从而为OSDs的治疗开拓了一个新的领域。另外，为了解决结膜移植供体这一临床难题，1981年Akle等[5]发现新鲜的羊膜抗原性很低，移植于眼表后几乎不发生排斥反应，从此揭开了羊膜移植重建眼表的序幕，取得了令人振奋的临床效果。
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LATL及羊膜移植成为目前OSDs治疗的重要手段，但术后移植物排斥反应仍是造成手术失败的头号并发症。面对这一临床难题，传统的治疗方法是应用糖皮质激素及CsA，但效果都不尽人意。为了有效解决上述问题，提高眼表重建术的临床效果，研制新型、高效、安全的免疫抑制剂是提高眼表重建术成功率的关键措施。
3.2 FK-506局部应用的药理基础及临床价值 FK-506是日本藤泽制药有限公司研制的新型高效免疫抑制剂，国内外的研究结果一致表明，该药可有效抑制机体的细胞与体液免疫，对多种器官的同种异体移植术排斥反应均显示了高度的免疫抑制效果，且效价明显高于CsA。它与CsA相似，其主要作用机理是使T细胞增殖与活化受到限制[7]。我们经药代动力学及人体耐受性试验研究发现，该药的局部应用具有安全、高效、无全身毒副作用的特点，其0.5g.L-1的滴眼液是将5g.L-1的注射液用抽真空离心方法去除其中的乙醇而配制成标准的水溶液，经初步临床应用，取得了良好效果。
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3.3 眼表重建术后局部应用FK-506可有效控制移植物的免疫排斥反应。LAUT虽可避免排斥反应的发生，但对于严重眼表疾病及双眼受伤患者显然不能解决供体来源问题；LALT虽可解决供体问题，但术后不可避免将出现排斥反应。传统的抗排斥措施是局部应用糖皮质激素及CsA，但两者均不能完全抑制该并发症的出现，且由于药物本身的毒副作用而进一步影响其临床使用的时间与效果。我们在动物实验、人体耐受性试验及药代动力学研究的基础上，对FK-506局部临床应用进行了有效的探索。经研究配制成的0.5g.L-1的FK-506滴眼液具有无刺激性、临床效价高、无全身毒副作用的优点。本研究表明，该药可有效的抑制角膜新生血管的再生、延长移植片及角膜的透明维持时间、有效降低排斥反应的发生率，其临床的免疫抑制效价明显高于10g.L-1CsA，具有良好的开发应用前景。
我们相信，在其他药物的协同下，该药的局部应用可望成为提高眼表重建术成功率的另一重要措施。
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基金项目：卫生部课题基金(961122)，广东省自然科学基金(960145)及广东省重点科技攻关项目(962205004)资助
作者简介：林跃生，男，生于1960年8月，广东揭阳人，汉族。1983年中山医科大学医学系毕业，获学士学位。现任中山医科大学中山眼科中心眼科医院角膜病科主任医师，硕士研究生导师。主要从事角膜病、角膜移植术、角膜屈光手术及眼表疾病的防治研究。近5年完成第一作者的大学以上科研项目6项；发表第一作者学术论著25篇；参与3部学术著作的撰写；先后获得第一完成人的部委级科研成果3项。
作者单位：林跃生(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
陈家祺(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
刘永民(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
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周世友(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
谢汉平(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
王敏华(中山医科大学中山眼科中心 广州市，510060)
参考文献
1，Galvins SA.Differentiation related expression of a major 64k corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells[J].J Cell Biol 1986;103∶49-62.
2，Huang AJW,Tseng SCG.Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epitheleum[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1991;32∶96-105.
, 百拇医药
3，Tseng SCG,Tsubota K.Important concepts for treating ocular surface and tear disorders[J].Am J Ophthalmol 1997;124∶825-835.
4，Kiritoshi A,Sundar-Raj N,Thoft RA.Differentiation in cultured limbal epithelium as defined by keratin expression[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1991;32∶3073-3077.
5，Akle CA,Adinlofi M,welsh KI,et al.Immuogenicity of human amniotic epithelial cells after transplantation into volunteers[J].Lancet 1981;8254∶1003-1005.
6，Mills RA,Jones DB,Winkler CR,et al.Topical FK-506 prevints experimental corneal allograft rejection[J].Cornea 1995;14∶157-160.
7，吕 岚，张文华，孙旭光.FK-506抑制大鼠角膜移植排斥反应的研究[J].中华眼科杂志 1999；35∶25-27., 百拇医药