视网膜移植的研究进展
视网膜移植的研究进展
于文贞 董晓光 谢立信
关键词：视网膜移植；神经上皮；神经节细胞；感光细胞
视网膜是视觉中光电变化的发生部位，其功能及解剖的异常均可导致视觉功能的下降，组织病理学证明：光感受器细胞的变性和死亡是视网膜色素变性、视网膜脱离及其他视网膜疾病致盲的主要原因。因而，挽救和替代变性的光感受器细胞，促进视网膜细胞的恢复，促使其再生可以阻止疾病的发生甚至治愈许多疾病。近年来国内外许多学者进行了大量的视网膜移植研究，并取得了令人满意的成绩，虽然这些研究成果与临床应用还有很大差距，但它展现的美好前景引起了眼科学、神经科学等许多领域科研工作者的极大兴趣，目前研究的热点主要集中在视网膜移植及促进视网膜神经节细胞的再生方面，下面对此进行简要综述。
1 移植物的获取
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以前的移植物大部分是光感受器细胞悬液[1]和(或)视网膜颗粒[1，2]，但该移植物植入视网膜下腔后容易形成花结[3]，造成解剖结构的异常，因而越来越多的学者采用视网膜片作为移植物进行移植，以减少花环形成。
1.1 光感受器移植片的获取 将供体动物视网膜完整地分离出，然后用激光或组织切削机取得单纯的光感受器细胞层、可直接移植该片或经储存培养后进行移植[4]，一般年轻的供体比年长的供体效果好。大致方法是在无菌状态下将视网膜取下后，切成大小不等的视网膜片，铺在凝固的明胶片上，使二者粘附在一起用激光或组织切削机切去视网膜内层，即可获得单纯的光感受器细胞层[4-6]。
1.2 胚胎视网膜片的获取 将不同孕期的供体动物处死后取出其胚胎，小心地分离出视网膜全层，然后放入4℃的营养液中保存[7]，也可放入Optisol中保存[8]，移植时可按要求剪成大小不同的视网膜片，此法获取的移植片可用明胶进行包埋处理，操作方便。
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1.3 其他移植材料 为了挽救变性的视网膜细胞，有学者利用雪旺细胞营养神经的特性，将雪旺细胞植入视网膜下腔来促进感光细胞层的恢复[9]。也有学者用移植外周神经的方法来提供给视网膜神经节细胞轴突再生的环境[10]，促使其再生。
2 动物实验
视网膜的替代及再生是视功能恢复的主要解剖学基础，为了达到这一目的，科研工作者从移植的可行性到移植后的细胞发育、生理功能等各方向进行了大量的实验。
2.1 视网膜下腔的免疫赦免 从动物的同种异体移植到异种移植证明视网膜下腔是一免疫赦免区，使人类的视网膜移植成为可能。Maeno等[11]将猫的胰岛素分泌细胞分离出后，植入到血糖正常的家猫的视网膜下腔及结膜下腔进行免疫反应比较，21d后检查发现：结膜下腔的胰岛素细胞全部破坏，产生了免疫反应，而视网膜下腔的胰岛素细胞正常，未受到任何破坏。Jiang等[12]将新生的C57b1/c鼠的视网膜移植到成年BALb/c鼠的视网膜下腔及结膜下，经过不同时期的发育后检查发现，结膜下的视网膜移植片受到了破坏，受体产生了宿主特异性的迟发性超敏反应，而视网膜下腔的植片分化良好，没有任何炎症及免疫排斥反应迹象。这些实验都证明视网膜下腔是免疫赦免区，为了深入探索视网膜下腔免疫赦免的机制，Jorgensen等[13]将分离培养的人色素上皮细胞与激活的T淋巴细胞和周围血中的淋巴细胞共同培养6h～2d，用特殊的免疫组化方法检查，结果发现视网膜色素上皮细胞表达FasL，激活的T细胞表达Fas，当Fas-FasL相互结合时，激活的T细胞发生程序性死亡，用抗体阻断二者结合时，则不发生细胞死亡，外周血中静止的淋巴细胞逃过色素上皮引起的凋亡，说明视网膜色素上皮可构成一个抵御有害T细胞的免疫功能屏障，保护视网膜下腔的移植物的成活。
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2.2 胚胎视网膜移植的组织学观察 胚胎视网膜由于发育未成熟，仍有生长能力且抗原性小，因而是移植的主要材料。移植的成分有所不同，可进行全厚移植及单纯的感光细胞层移植。Silverman等[14]将分离的感光细胞层移植到没有感光细胞层的成年鼠的视网膜下腔中，经过一定时间的发育后用电镜进行植片结构的检查，发现移植的感光细胞片与宿主的内核层之间形成了类似外丛状层结构，在形成的外丛状层结构中可见凹陷性突触结构，而在宿主的视网膜中没有这种结构，同时他们也发现光照移植眼后出现了VEP及瞳孔的改变，证明了移植的感光细胞与宿主视网膜细胞形成了突触连接并有一定功能。Zucker等[15]也进行了这方面的研究，发现移植的感光细胞形成了完整的内节和外节，突触终端内有突触带及许多小的突触小泡，与宿主的双极细胞及水平细胞形成了突触二联体及三联体，植片与宿主的视网膜间无特异性发现。
在进行结构方面研究的同时，许多学者对移植后视网膜成分的发育情况进行了观察，Seiler等[16]把人的胚胎视网膜(孕后6～11wk)移植到成年鼠的视网膜下腔中，术后13～37wk内取眼球，用免疫组化技术对视网膜中各种细胞的生长情况进行了观察，结果是：视锥细胞在14～16wk时出现神经特异性稀醇酶及synaptophysin(SYN),25wk出现视蛋白；视杆细胞17～18wk表达S抗原，20wk时胞体及内节出现转导蛋白及视紫红质，37wk时视杆细胞内外节都表达很强的杆细胞特异性抗原。在移植的早期(总胎龄14～16wk)，胶质细胞就表达vimentin,19～20wk时植片muller细胞开始表达CRALBP(cellular retinaldehyde-binging protein),25wk时达到最高程度，同时，植片开始表达胶质神经酸蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。Bruun 等[17]把胚胎视网膜植入成年动物的视网膜下腔后，检查发现植片同正常视网膜一样都有花生凝集素存在，外节区域有视网膜样结合蛋白存在，说明移植的细胞可以合成分泌正常的细胞间质成分。而Perez等[18]检查发现植片细胞中一氧化氮合成酶的存在，证明能够生成对视网膜有营养作用及递质作用的一氧化氮。Bergstrom等[19]也发现移植细胞发育正常，表达细胞特异性标志，光感受器细胞表达视紫红质R2-15、免疫特异性锥细胞色素cos-1和cos-2锥细胞特异性抗原50-1B11，双极细胞表达PKC、水平细胞表达HPC-1抗原及neurofilament 160 KDa,胶质细胞表达GFAP和vimetin。Gouras等[20]把导入标志基因的胚胎视网膜移植到成年动物的视网膜下腔，经过一定时间的发育后，进行检测，植片视网膜仍能表达该标志基因的产物。组织学上植片细胞与宿主相邻的结构形成了正常关系。 Adolph等[21]将单个电极放在移植的视网膜表面，然后检查记录到局部视网膜电图及短暂on或on-off反应，发现感受野的大小与刺激光强度有关，刺激光强度越高视网膜组织感受野的反应也越大，波形有时表现on-center反应，有时on-off反应。局部视网膜电图是去极化反应的记忆，或者是正常视网膜反应中看到的M波，反应植片中无长突细胞的电位活动，这些电位变化大致与正常视网膜的电活动一致。
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2.3 移植光感受器细胞层的检查 在进行胚胎视网膜移植的同时，有人也用成年动物的感光细胞层进行移植探索其可行性。Hung等[22]将用激光切削的猫的视网膜感光细胞层植入同种异体的视网膜下腔，检查发现植入的感光细胞层成活良好，与宿主视网膜色素上皮细胞形成良好的接触。而移植区宿主的感光细胞层由于与色素上皮层脱离而其外节变短或缺损更有利于植片与宿主的双极细胞形成突触，减弱了突触形成的屏障。而Mohand-Said等[23]将分离的鼠的感光细胞层植入到缺少杆细胞的视网膜变性的rd鼠的视网膜下腔，术后用特殊标记检测方法对移植组和非移植组残留的锥细胞数量进行了统计学分析，移植组残存的锥细胞数量多于非移植组，有明显的统计学意义，说明移植的感光细胞层对锥细胞有营养作用。
2.4 节细胞再生方面的研究 在进行大量感光细胞研究的同时，人们也对视网膜节细胞再生能力进行了探索，Fukuda等[24]将猫的节细胞轴突切断后，移植外周神经作为辅助物提供营养环境，移植后2wk发现，给光中心的节细胞轴突能够再生，其轴突末端与四迭体上丘的靶细胞形成突触联系，而撤光中心的节细胞不能再生，为视网膜的研究开辟了新的领域。
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2.5 移植后的生理功能 瞳孔反射是一种间接反映，反映视路的功能，Klasen等[25]发现光照射视网膜移植片可引起宿主的瞳孔反映，且反映强度随时间的不同而异，但出现的反映潜时、强度及持续时间均低于正常组，而Kwan等[26]报道结果同Klasen一致。Craner等[27]发现光照视网膜移植片后虽然引起瞳孔反映，但反映潜时较正常组平均延长50ms。 以上结果说明植片不仅与宿主视网膜建立联系，而且可能与中枢运动核建立联系。
3 临床随访
Kaplan等[28]报道2例用感光细胞片植入无光感的视网膜色素上皮变性患者的黄斑区视网膜下腔，未用任何免疫抑制剂，随访中未发现免疫排斥反应，也无黄斑囊样水肿、葡萄膜炎、黄斑皱褶等并发症，但视力仍无光感。而Das等[29]也进行了这方面的应用研究，将人胚胎视网膜层植入14例视网膜色素上皮变性患者的黄斑区视网膜下腔，5例进行10～34mo的观察，结果2例视力从光感到手动，1例从光感到数指，1例从CF/1/3m到CF/2/3m，另1例患者在5度视野内从光感到20/200，ERG及视野检查无任何改变，视网膜下腔情况同Kaplan报道。
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以上资料可以证明，视网膜下腔可以安全的进行视网膜移植，不会产生任何并发症，尽管植入后ERG没有改变，视功能无明显提高，但并不意味着移植失败，因为正常的视觉是一个复杂的电生理过程，必须有足够的感光细胞受到刺激才能产生视觉，目前的移植方法可能达不到有效的感光细胞数目，因而目前的检测方法可能检测不到。
4 展望
视网膜移植及再生是治疗某些眼底病的可行方法，但植片的生长存活必须在适宜的微环境中进行，还需一些成长因子的作用，同时还要抑制感光细胞的丢失，随着分子生物学的进展，可以利用调控基因的方法，促进细胞的生长发育，使其恢复功能，当然，在临床应用之前，还需做大量的研究工作。
作者单位：于文贞(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
董晓光(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
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谢立信(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
参考文献
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于文贞 董晓光 谢立信
关键词：视网膜移植；神经上皮；神经节细胞；感光细胞
视网膜是视觉中光电变化的发生部位，其功能及解剖的异常均可导致视觉功能的下降，组织病理学证明：光感受器细胞的变性和死亡是视网膜色素变性、视网膜脱离及其他视网膜疾病致盲的主要原因。因而，挽救和替代变性的光感受器细胞，促进视网膜细胞的恢复，促使其再生可以阻止疾病的发生甚至治愈许多疾病。近年来国内外许多学者进行了大量的视网膜移植研究，并取得了令人满意的成绩，虽然这些研究成果与临床应用还有很大差距，但它展现的美好前景引起了眼科学、神经科学等许多领域科研工作者的极大兴趣，目前研究的热点主要集中在视网膜移植及促进视网膜神经节细胞的再生方面，下面对此进行简要综述。
1 移植物的获取
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以前的移植物大部分是光感受器细胞悬液[1]和(或)视网膜颗粒[1，2]，但该移植物植入视网膜下腔后容易形成花结[3]，造成解剖结构的异常，因而越来越多的学者采用视网膜片作为移植物进行移植，以减少花环形成。
1.1 光感受器移植片的获取 将供体动物视网膜完整地分离出，然后用激光或组织切削机取得单纯的光感受器细胞层、可直接移植该片或经储存培养后进行移植[4]，一般年轻的供体比年长的供体效果好。大致方法是在无菌状态下将视网膜取下后，切成大小不等的视网膜片，铺在凝固的明胶片上，使二者粘附在一起用激光或组织切削机切去视网膜内层，即可获得单纯的光感受器细胞层[4-6]。
1.2 胚胎视网膜片的获取 将不同孕期的供体动物处死后取出其胚胎，小心地分离出视网膜全层，然后放入4℃的营养液中保存[7]，也可放入Optisol中保存[8]，移植时可按要求剪成大小不同的视网膜片，此法获取的移植片可用明胶进行包埋处理，操作方便。
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1.3 其他移植材料 为了挽救变性的视网膜细胞，有学者利用雪旺细胞营养神经的特性，将雪旺细胞植入视网膜下腔来促进感光细胞层的恢复[9]。也有学者用移植外周神经的方法来提供给视网膜神经节细胞轴突再生的环境[10]，促使其再生。
2 动物实验
视网膜的替代及再生是视功能恢复的主要解剖学基础，为了达到这一目的，科研工作者从移植的可行性到移植后的细胞发育、生理功能等各方向进行了大量的实验。
2.1 视网膜下腔的免疫赦免 从动物的同种异体移植到异种移植证明视网膜下腔是一免疫赦免区，使人类的视网膜移植成为可能。Maeno等[11]将猫的胰岛素分泌细胞分离出后，植入到血糖正常的家猫的视网膜下腔及结膜下腔进行免疫反应比较，21d后检查发现：结膜下腔的胰岛素细胞全部破坏，产生了免疫反应，而视网膜下腔的胰岛素细胞正常，未受到任何破坏。Jiang等[12]将新生的C57b1/c鼠的视网膜移植到成年BALb/c鼠的视网膜下腔及结膜下，经过不同时期的发育后检查发现，结膜下的视网膜移植片受到了破坏，受体产生了宿主特异性的迟发性超敏反应，而视网膜下腔的植片分化良好，没有任何炎症及免疫排斥反应迹象。这些实验都证明视网膜下腔是免疫赦免区，为了深入探索视网膜下腔免疫赦免的机制，Jorgensen等[13]将分离培养的人色素上皮细胞与激活的T淋巴细胞和周围血中的淋巴细胞共同培养6h～2d，用特殊的免疫组化方法检查，结果发现视网膜色素上皮细胞表达FasL，激活的T细胞表达Fas，当Fas-FasL相互结合时，激活的T细胞发生程序性死亡，用抗体阻断二者结合时，则不发生细胞死亡，外周血中静止的淋巴细胞逃过色素上皮引起的凋亡，说明视网膜色素上皮可构成一个抵御有害T细胞的免疫功能屏障，保护视网膜下腔的移植物的成活。
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2.2 胚胎视网膜移植的组织学观察 胚胎视网膜由于发育未成熟，仍有生长能力且抗原性小，因而是移植的主要材料。移植的成分有所不同，可进行全厚移植及单纯的感光细胞层移植。Silverman等[14]将分离的感光细胞层移植到没有感光细胞层的成年鼠的视网膜下腔中，经过一定时间的发育后用电镜进行植片结构的检查，发现移植的感光细胞片与宿主的内核层之间形成了类似外丛状层结构，在形成的外丛状层结构中可见凹陷性突触结构，而在宿主的视网膜中没有这种结构，同时他们也发现光照移植眼后出现了VEP及瞳孔的改变，证明了移植的感光细胞与宿主视网膜细胞形成了突触连接并有一定功能。Zucker等[15]也进行了这方面的研究，发现移植的感光细胞形成了完整的内节和外节，突触终端内有突触带及许多小的突触小泡，与宿主的双极细胞及水平细胞形成了突触二联体及三联体，植片与宿主的视网膜间无特异性发现。
在进行结构方面研究的同时，许多学者对移植后视网膜成分的发育情况进行了观察，Seiler等[16]把人的胚胎视网膜(孕后6～11wk)移植到成年鼠的视网膜下腔中，术后13～37wk内取眼球，用免疫组化技术对视网膜中各种细胞的生长情况进行了观察，结果是：视锥细胞在14～16wk时出现神经特异性稀醇酶及synaptophysin(SYN),25wk出现视蛋白；视杆细胞17～18wk表达S抗原，20wk时胞体及内节出现转导蛋白及视紫红质，37wk时视杆细胞内外节都表达很强的杆细胞特异性抗原。在移植的早期(总胎龄14～16wk)，胶质细胞就表达vimentin,19～20wk时植片muller细胞开始表达CRALBP(cellular retinaldehyde-binging protein),25wk时达到最高程度，同时，植片开始表达胶质神经酸蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。Bruun 等[17]把胚胎视网膜植入成年动物的视网膜下腔后，检查发现植片同正常视网膜一样都有花生凝集素存在，外节区域有视网膜样结合蛋白存在，说明移植的细胞可以合成分泌正常的细胞间质成分。而Perez等[18]检查发现植片细胞中一氧化氮合成酶的存在，证明能够生成对视网膜有营养作用及递质作用的一氧化氮。Bergstrom等[19]也发现移植细胞发育正常，表达细胞特异性标志，光感受器细胞表达视紫红质R2-15、免疫特异性锥细胞色素cos-1和cos-2锥细胞特异性抗原50-1B11，双极细胞表达PKC、水平细胞表达HPC-1抗原及neurofilament 160 KDa,胶质细胞表达GFAP和vimetin。Gouras等[20]把导入标志基因的胚胎视网膜移植到成年动物的视网膜下腔，经过一定时间的发育后，进行检测，植片视网膜仍能表达该标志基因的产物。组织学上植片细胞与宿主相邻的结构形成了正常关系。 Adolph等[21]将单个电极放在移植的视网膜表面，然后检查记录到局部视网膜电图及短暂on或on-off反应，发现感受野的大小与刺激光强度有关，刺激光强度越高视网膜组织感受野的反应也越大，波形有时表现on-center反应，有时on-off反应。局部视网膜电图是去极化反应的记忆，或者是正常视网膜反应中看到的M波，反应植片中无长突细胞的电位活动，这些电位变化大致与正常视网膜的电活动一致。
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2.3 移植光感受器细胞层的检查 在进行胚胎视网膜移植的同时，有人也用成年动物的感光细胞层进行移植探索其可行性。Hung等[22]将用激光切削的猫的视网膜感光细胞层植入同种异体的视网膜下腔，检查发现植入的感光细胞层成活良好，与宿主视网膜色素上皮细胞形成良好的接触。而移植区宿主的感光细胞层由于与色素上皮层脱离而其外节变短或缺损更有利于植片与宿主的双极细胞形成突触，减弱了突触形成的屏障。而Mohand-Said等[23]将分离的鼠的感光细胞层植入到缺少杆细胞的视网膜变性的rd鼠的视网膜下腔，术后用特殊标记检测方法对移植组和非移植组残留的锥细胞数量进行了统计学分析，移植组残存的锥细胞数量多于非移植组，有明显的统计学意义，说明移植的感光细胞层对锥细胞有营养作用。
2.4 节细胞再生方面的研究 在进行大量感光细胞研究的同时，人们也对视网膜节细胞再生能力进行了探索，Fukuda等[24]将猫的节细胞轴突切断后，移植外周神经作为辅助物提供营养环境，移植后2wk发现，给光中心的节细胞轴突能够再生，其轴突末端与四迭体上丘的靶细胞形成突触联系，而撤光中心的节细胞不能再生，为视网膜的研究开辟了新的领域。
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2.5 移植后的生理功能 瞳孔反射是一种间接反映，反映视路的功能，Klasen等[25]发现光照射视网膜移植片可引起宿主的瞳孔反映，且反映强度随时间的不同而异，但出现的反映潜时、强度及持续时间均低于正常组，而Kwan等[26]报道结果同Klasen一致。Craner等[27]发现光照视网膜移植片后虽然引起瞳孔反映，但反映潜时较正常组平均延长50ms。 以上结果说明植片不仅与宿主视网膜建立联系，而且可能与中枢运动核建立联系。
3 临床随访
Kaplan等[28]报道2例用感光细胞片植入无光感的视网膜色素上皮变性患者的黄斑区视网膜下腔，未用任何免疫抑制剂，随访中未发现免疫排斥反应，也无黄斑囊样水肿、葡萄膜炎、黄斑皱褶等并发症，但视力仍无光感。而Das等[29]也进行了这方面的应用研究，将人胚胎视网膜层植入14例视网膜色素上皮变性患者的黄斑区视网膜下腔，5例进行10～34mo的观察，结果2例视力从光感到手动，1例从光感到数指，1例从CF/1/3m到CF/2/3m，另1例患者在5度视野内从光感到20/200，ERG及视野检查无任何改变，视网膜下腔情况同Kaplan报道。
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以上资料可以证明，视网膜下腔可以安全的进行视网膜移植，不会产生任何并发症，尽管植入后ERG没有改变，视功能无明显提高，但并不意味着移植失败，因为正常的视觉是一个复杂的电生理过程，必须有足够的感光细胞受到刺激才能产生视觉，目前的移植方法可能达不到有效的感光细胞数目，因而目前的检测方法可能检测不到。
4 展望
视网膜移植及再生是治疗某些眼底病的可行方法，但植片的生长存活必须在适宜的微环境中进行，还需一些成长因子的作用，同时还要抑制感光细胞的丢失，随着分子生物学的进展，可以利用调控基因的方法，促进细胞的生长发育，使其恢复功能，当然，在临床应用之前，还需做大量的研究工作。
作者单位：于文贞(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
董晓光(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
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谢立信(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
参考文献
1，Del Cerro M,Lazar ES,Diloreto DJR.The first decade of continuous progress in retinal transplantation[J].Microse Res Tech 1997;36(2)∶130-141.
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