可溶性PTA1分子的发现及其检测方法的建立
可溶性PTA1分子的发现及其检测方法的建立
贾卫 金伯泉 李琦 闵密克 刘雪松
摘 要：目的 建立检测sPTA1的方法，探讨正常人和肿瘤患者血清中是否存在可溶性PTA1(sPTA1)分子。方法 以亲和层析法从血小板纯化的天然PTA1分子作为免疫原，制备抗PTA1分子的多克隆抗体(PcAb)，并以此建立检测sPTA1的双抗体夹心ELISA法。结果 建立的双抗体夹心ELISA法敏感性达100ng/L,应用此方法从经TPA，PHA及抗CD3mAb活化的人PBMC细胞培养上清中检测到sPTA1。与膜型PTA1(mPTA1)分子表达的动态相关研究发现,sPTA1的产生晚于mPTA1分子的表达，且可持续存在。检测60例正常人血清sPTA1的水平为(36.2±4.5)μg/L，16例肿瘤患者为(57.3±5.0)μg/L。血清中sPTA1相对分子质量(Mr)约为50000。结论 首次发现sPTA1分子，建立了具有较高敏感性和特异性的检测sPTA1的方法，为进一步深入研究PTA1分子的生物学功能提供了新的手段。
, 百拇医药
关键词：夹心ELISA；PTA1；可溶性粘附分子
许多免疫细胞膜分子存在膜型和可溶性两种形式。某些可溶性形式的分子对于其膜型分子功能的发挥和调节，以及对一些疾病的发生、诊断及预后判定具有重要的意义。血小板/T细胞活化抗原1(plateletandTcellactivationantigen1,PTA1)是免疫细胞膜上一种新的分子[1]。1997年基因克隆成功[2]，主要分布于活化T细胞、NK细胞、巨核/血小板谱系及内皮细胞。PTA1分子参与杀伤性T细胞(CTL)的分化、血小板的活化与凝集[2,3]，是一种刺激型NK细胞受体[2]。临床初步研究表明，PTA1分子与血小板功能异常、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、肿瘤及移植物抗宿主病等的发病关系密切[4，5]。我们首次证实，细胞培养上清和人血清中存在可溶性PTA1分子(sPTA1)，并讨论了其生理意义及与临床疾病的关系。
, http://www.100md.com
1材料和方法
1.1材料 新西兰纯种兔由本校动物中心提供。PMSF,碘乙酰胺，胰蛋白酶抑制剂，PHA，TPA，ABTS和FITC标记的抗鼠抗体，均为Sigma公司产品。Sepharose4B购自Pharmacia公司，WesternBlot试剂盒为BoheringerMannheim公司产品，辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体购自博士德公司。抗CD3mAb、抗PTA1mAbLeoA1和FITC标记的抗兔抗体为本室制备。ELISA板为Nunc公司产品。
1.2方法
1.2.1PTA1的纯化及其Mr的测定 离心收集人血小板(总数约5×1011)置裂解缓冲液中，其组成为10mmol/LTrisHCl,1%NP40,150mmol/LNaCl,2mmol/LPMSF,20mmol/L碘乙酰胺,10mg/L胰蛋白酶抑制剂及1g/LBSA。于4℃缓慢搅拌1h后,以27000g离心15min，除去不溶性物质[3]。亲和层析方法依照Pharmacia公司Sepharose4B操作说明书进行。以不同稀释度经LeoA1Sepharose4B亲和层析柱纯化的PTA1分子包被ELISA板，用间接ELISA法检测其免疫反应性。纯化PTA1分子的相对分子质量(Mr)的鉴定：纯化的PTA1分子进行SDSPAGE，转移PVDF膜，封闭后，与抗PTA1分子的多抗及对照多抗1F12进行反应，余按照BoheringerMannheim公司Westernblot试剂盒说明书进行操作。
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1.2.2sPTA1检测方法的建立 选取雄性新西兰纯种兔,按照常规方法制备兔抗PTA1的PcAb，建立检测sPTA1的夹心ELISA法。主要步骤为:以不同浓度的mAbLeoA1包被ELISA板，依次加入不同浓度的PTA1/Ig融合蛋白(本室构建表达)，然后分别加兔抗PTA1抗体及HRP标记的羊抗兔抗体，每步骤间均经温育和洗涤，用ABTS底物显色后，测波长410nm处光吸收(A)值。同时设立空白(PBS)、正常兔血清对照及包被无关mAb1F12的对照。对建立的方法，按常规进行批内、批间稳定性实验。
1.2.3PTA1的检测 分离人PBMC,调整细胞浓度至5×109/L,以终浓度为20mg/L的抗CD3mAb，5mg/L的PHA或50μg/L的TPA分别活化人PBMC。于不同时间点收集细胞培养上清检测sPTA1，同时收集细胞，按照常规进行间接免疫荧光染色。抗CD3mAb刺激细胞采用兔抗PTA1PcAb，PHA和TPA刺激细胞采用mAbLeoA1，分别与活化的PBMC反应,洗涤后加FITC标记的抗兔或抗鼠抗体与细胞反应，最后用流式细胞仪检测mPTA1分子的表达。收集正常人血清(60份)、肿瘤患者血清(16份)以及细胞培养上清，用上述建立的夹心ELISA方法检测sPTA1。
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1.2.4sPTA1Mr的测定 取正常人血清，用mAbLeoA1或对照抗体1F12做免疫沉淀后,再以抗PTA1PcAb进行Westernblot测定sPTA1的Mr。
2结果
2.1纯化PTA1分子及其多克隆抗体的鉴定 纯化的天然PTA1分子保持了较好的免疫反应性，与无关抗体未出现交叉反应。Westernblot结果表明，纯化PTA1仅出现1条带，其Mr约为67000(图1)。ELISA检测结果表明,免疫兔产生的抗PTA1分子PcAb与其它蛋白无交叉反应，抗体效价为2.5×10-7。
图1纯化PTA1分子的Westernblot分析
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Fig1 Analysis of the purified PTA1 by Westernblot
1:Marker;2:Probed with antiPTA1 PcAb;3:Probed with control PcAb 1F12.
2.2双抗体夹心法检测系统的建立 通过方阵滴定建立了检测系统，当包被mAbLeoA1的浓度为5mg/L，夹心抗体(兔抗PTA1PcAb)的浓度为20mg/L时，检测sPTA1的敏感性可达100ng/L，且线性关系良好(图2)，并有较好的特异性(表1)。稳定性实验结果表明，批内、批间的变异系数分别小于5%和8%。
图2夹心ELISA检测PTA1/Ig的剂量依赖曲线
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Fig2 Dose dependent curveofs and wich ELISA indetecting
the PTA1/Ig
表1双抗体夹心ELISA法检测sPTA1的特异性
Tab1 Specificity ofthe sPTA1 detected by sandwich ELISA
Coated mAb
Sample
Sandwich Ab
Conjugated
Results
, 百拇医药
Leo A1
aPTA1
anti-PTA1 PcAb
GAR IgG-HPRz
+++
LeoA1
aPTA1
normal rabbit serum
GAR IgG-HPRz
-
LeoA1
PBS
, 百拇医药
anti-PTA1 PcAb
GAR IgG-HPRz
-
1Fl2
aPTA1
anti-PTA1 PcAb
GAR IgG-HPRz
-
2.3mPTA1与sPTA1的关系分析 抗CD3mAb，TPA和PHA刺激PBMC后,mPTA1分子的表达分别于12，48及72h达到高峰；培养上清中sPTA1的检出分别于48,60及96h达高峰，并持续至120h。3种T细胞的多克隆刺激剂中,以TPA刺激PBMC产生的sPTA1的水平较高(图3)。
, 百拇医药
图3活化人PBMCmPTA1与sPTA1的关系分析
Fig3 Analysis of the relationship between mPTA1 and sPTA1
from PBMC
2.4正常人及肿瘤患者血清sPTA1的水平
正常人血清sPTA1为(36.23±4.51)μg/L,肿瘤患者为(57.26±5.00)μg/L，二者差异显著(P∨0.001)。
2.5sPTA1Mr的测定如图4所示，人血清中sPTA1的Mr约为50000,与PTA1分子的胞膜外区的Mr相当。
, 百拇医药
图4免疫沉淀及Westernblot测定sPTA1的Mr
Fig4 Determination of the Mrof sPTA1 by immunoprecipita
tion and Western blot
1:Immunoprecipitated with mAb Loe A1;
2:Immunoprecipitated with control mAb IF12.
3讨论
我们采用抗PTA1的mAbLeoA1做亲和层析，纯化了血小板来源的天然PTA1分子。纯化的PTA1分子保持了较好的免疫反应性，以此作为抗原免疫新西兰纯种兔，得到高效价的特异性PcAb。我们建立的检测sPTA1的夹心ELISA法系统，对标准品的检测呈现良好的线性关系，敏感性可达100ng/L。
, 百拇医药
可溶性形式的膜分子通常由细胞受到刺激后所产生[6]。在本实验中观察到人PBMC体外经TPA,PHA或抗CD3mAb激活后，sPTA1的产生明显增加，以TPA刺激产生的sPTA1水平较高，可能与不同刺激剂活化细胞的信号转导途径不同有关。与mPTA1相比较，sPTA1的产生在时相上晚于mPTA1的表达,似乎支持了sPTA1主要由mPTA1脱落而来。同许多可溶性粘附分子相类似，正常人血清中也存在一定水平的sPTA1分子，部分肿瘤患者(如肺癌、贲门癌、脑膜瘤、肾肿瘤及睾丸肿瘤等)的血清中，发现有较高水平的sPTA1分子，与正常人血清中的水平相比较差异显著(P∨0.001)。以往研究显示，心脏及肾脏移植患者的外周血淋巴细胞上可表达高水平的PTA1[4]，结合其它临床研究结果[5]，提示PTA1分子可能具有潜在的临床意义。
已证实TPA可诱导细胞内的酶活化，使一些膜分子产生可溶性形式。由于TPA刺激PBMC后产生的sPTA1水平较高,人血清中sPTA1的Mr也与mPTA1分子胞膜外区的Mr相当，提示sPTA1可能是在细胞内源性酶的作用下而产生的。PTA1分子在正常人血清中具有一定水平的可溶性形式，这主要是由于PTA1分子除表达于活化的T细胞、NK细胞和内皮细胞外，在血小板表面也有高水平的表达[3]，并可能成为血清中sPTA1的主要来源。sPTA1分子的生理功能及其与临床疾病的的关系均值得深入研究。
, 百拇医药
致谢对西京医院输血科戴月娥和马红艳在血小板分离和正常人外周血采集中给予的热情帮助，中心实验室曹云新实验师在流式细胞仪样品检测中的大力帮助表示感谢!
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39770697
作者简介：贾卫，男，29岁，博士生
贾卫(第四军医大学免疫学教研室,陕西 西安 710032)
金伯泉(第四军医大学免疫学教研室,陕西 西安 710032)
李琦(第四军医大学免疫学教研室,陕西 西安 710032)
闵密克(第四军医大学免疫学教研室,陕西 西安 710032)
刘雪松(第四军医大学免疫学教研室,陕西 西安 710032)
, http://www.100md.com
参考文献:
[1]Burns GF,Triglia T,Werkmeister JA，et al.TLiSA,a human T lineage-specific activation antigen involved in the differentiation of cytotoxic T lymphocytes and anomalous killer cells from their precursors[J].J Exp Med,1985;16:1063-1078.
[2]Sherrington PD,Scott JL,Jin BQ,et al.TLisA1(PTA1) activation ant-igen implicated in T cell differentiation and platelet activation is a member of the immunoglobulin superfamily exhibiting distinctive regulation of expression[J].J Biol Chem,1997;272:21735-21744.
, http://www.100md.com
[3]Scott JL,Dunn SM,Jin BQ,et al.Characterization of a novel membrane glycoprotein involved in platelet activation[J].J Biol Chem,1989;264:13475-13482.
[4]Loertscher R,Forbes RD,Halabi G,et al.Expression of early and late activation markers on peripheral blood T lymphocytes does not reliably reflect immune events in transplanted hearts[J].Clin Transplant,1994;8(3 Pt 1):230-238.
[5]Huang C,Jin B,Wang M,et al.Hemorrhagic fever with renal syndrome relationship between pathogenesis and cellular immunity[J].J Infect Dis，1994;169(4):868-870.
[6]Bazil V.Physiological enzymatic cleavage of leukocyte membrane molecules[J].Immunol Today，1995;16 (3):135-140., http://www.100md.com
贾卫 金伯泉 李琦 闵密克 刘雪松
摘 要：目的 建立检测sPTA1的方法，探讨正常人和肿瘤患者血清中是否存在可溶性PTA1(sPTA1)分子。方法 以亲和层析法从血小板纯化的天然PTA1分子作为免疫原，制备抗PTA1分子的多克隆抗体(PcAb)，并以此建立检测sPTA1的双抗体夹心ELISA法。结果 建立的双抗体夹心ELISA法敏感性达100ng/L,应用此方法从经TPA，PHA及抗CD3mAb活化的人PBMC细胞培养上清中检测到sPTA1。与膜型PTA1(mPTA1)分子表达的动态相关研究发现,sPTA1的产生晚于mPTA1分子的表达，且可持续存在。检测60例正常人血清sPTA1的水平为(36.2±4.5)μg/L，16例肿瘤患者为(57.3±5.0)μg/L。血清中sPTA1相对分子质量(Mr)约为50000。结论 首次发现sPTA1分子，建立了具有较高敏感性和特异性的检测sPTA1的方法，为进一步深入研究PTA1分子的生物学功能提供了新的手段。
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关键词：夹心ELISA；PTA1；可溶性粘附分子
许多免疫细胞膜分子存在膜型和可溶性两种形式。某些可溶性形式的分子对于其膜型分子功能的发挥和调节，以及对一些疾病的发生、诊断及预后判定具有重要的意义。血小板/T细胞活化抗原1(plateletandTcellactivationantigen1,PTA1)是免疫细胞膜上一种新的分子[1]。1997年基因克隆成功[2]，主要分布于活化T细胞、NK细胞、巨核/血小板谱系及内皮细胞。PTA1分子参与杀伤性T细胞(CTL)的分化、血小板的活化与凝集[2,3]，是一种刺激型NK细胞受体[2]。临床初步研究表明，PTA1分子与血小板功能异常、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、肿瘤及移植物抗宿主病等的发病关系密切[4，5]。我们首次证实，细胞培养上清和人血清中存在可溶性PTA1分子(sPTA1)，并讨论了其生理意义及与临床疾病的关系。
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1材料和方法
1.1材料 新西兰纯种兔由本校动物中心提供。PMSF,碘乙酰胺，胰蛋白酶抑制剂，PHA，TPA，ABTS和FITC标记的抗鼠抗体，均为Sigma公司产品。Sepharose4B购自Pharmacia公司，WesternBlot试剂盒为BoheringerMannheim公司产品，辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体购自博士德公司。抗CD3mAb、抗PTA1mAbLeoA1和FITC标记的抗兔抗体为本室制备。ELISA板为Nunc公司产品。
1.2方法
1.2.1PTA1的纯化及其Mr的测定 离心收集人血小板(总数约5×1011)置裂解缓冲液中，其组成为10mmol/LTrisHCl,1%NP40,150mmol/LNaCl,2mmol/LPMSF,20mmol/L碘乙酰胺,10mg/L胰蛋白酶抑制剂及1g/LBSA。于4℃缓慢搅拌1h后,以27000g离心15min，除去不溶性物质[3]。亲和层析方法依照Pharmacia公司Sepharose4B操作说明书进行。以不同稀释度经LeoA1Sepharose4B亲和层析柱纯化的PTA1分子包被ELISA板，用间接ELISA法检测其免疫反应性。纯化PTA1分子的相对分子质量(Mr)的鉴定：纯化的PTA1分子进行SDSPAGE，转移PVDF膜，封闭后，与抗PTA1分子的多抗及对照多抗1F12进行反应，余按照BoheringerMannheim公司Westernblot试剂盒说明书进行操作。
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1.2.2sPTA1检测方法的建立 选取雄性新西兰纯种兔,按照常规方法制备兔抗PTA1的PcAb，建立检测sPTA1的夹心ELISA法。主要步骤为:以不同浓度的mAbLeoA1包被ELISA板，依次加入不同浓度的PTA1/Ig融合蛋白(本室构建表达)，然后分别加兔抗PTA1抗体及HRP标记的羊抗兔抗体，每步骤间均经温育和洗涤，用ABTS底物显色后，测波长410nm处光吸收(A)值。同时设立空白(PBS)、正常兔血清对照及包被无关mAb1F12的对照。对建立的方法，按常规进行批内、批间稳定性实验。
1.2.3PTA1的检测 分离人PBMC,调整细胞浓度至5×109/L,以终浓度为20mg/L的抗CD3mAb，5mg/L的PHA或50μg/L的TPA分别活化人PBMC。于不同时间点收集细胞培养上清检测sPTA1，同时收集细胞，按照常规进行间接免疫荧光染色。抗CD3mAb刺激细胞采用兔抗PTA1PcAb，PHA和TPA刺激细胞采用mAbLeoA1，分别与活化的PBMC反应,洗涤后加FITC标记的抗兔或抗鼠抗体与细胞反应，最后用流式细胞仪检测mPTA1分子的表达。收集正常人血清(60份)、肿瘤患者血清(16份)以及细胞培养上清，用上述建立的夹心ELISA方法检测sPTA1。
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1.2.4sPTA1Mr的测定 取正常人血清，用mAbLeoA1或对照抗体1F12做免疫沉淀后,再以抗PTA1PcAb进行Westernblot测定sPTA1的Mr。
2结果
2.1纯化PTA1分子及其多克隆抗体的鉴定 纯化的天然PTA1分子保持了较好的免疫反应性，与无关抗体未出现交叉反应。Westernblot结果表明，纯化PTA1仅出现1条带，其Mr约为67000(图1)。ELISA检测结果表明,免疫兔产生的抗PTA1分子PcAb与其它蛋白无交叉反应，抗体效价为2.5×10-7。
图1纯化PTA1分子的Westernblot分析
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Fig1 Analysis of the purified PTA1 by Westernblot
1:Marker;2:Probed with antiPTA1 PcAb;3:Probed with control PcAb 1F12.
2.2双抗体夹心法检测系统的建立 通过方阵滴定建立了检测系统，当包被mAbLeoA1的浓度为5mg/L，夹心抗体(兔抗PTA1PcAb)的浓度为20mg/L时，检测sPTA1的敏感性可达100ng/L，且线性关系良好(图2)，并有较好的特异性(表1)。稳定性实验结果表明，批内、批间的变异系数分别小于5%和8%。
图2夹心ELISA检测PTA1/Ig的剂量依赖曲线
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Fig2 Dose dependent curveofs and wich ELISA indetecting
the PTA1/Ig
表1双抗体夹心ELISA法检测sPTA1的特异性
Tab1 Specificity ofthe sPTA1 detected by sandwich ELISA
Coated mAb
Sample
Sandwich Ab
Conjugated
Results
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Leo A1
aPTA1
anti-PTA1 PcAb
GAR IgG-HPRz
+++
LeoA1
aPTA1
normal rabbit serum
GAR IgG-HPRz
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LeoA1
PBS
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anti-PTA1 PcAb
GAR IgG-HPRz
-
1Fl2
aPTA1
anti-PTA1 PcAb
GAR IgG-HPRz
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2.3mPTA1与sPTA1的关系分析 抗CD3mAb，TPA和PHA刺激PBMC后,mPTA1分子的表达分别于12，48及72h达到高峰；培养上清中sPTA1的检出分别于48,60及96h达高峰，并持续至120h。3种T细胞的多克隆刺激剂中,以TPA刺激PBMC产生的sPTA1的水平较高(图3)。
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图3活化人PBMCmPTA1与sPTA1的关系分析
Fig3 Analysis of the relationship between mPTA1 and sPTA1
from PBMC
2.4正常人及肿瘤患者血清sPTA1的水平
正常人血清sPTA1为(36.23±4.51)μg/L,肿瘤患者为(57.26±5.00)μg/L，二者差异显著(P∨0.001)。
2.5sPTA1Mr的测定如图4所示，人血清中sPTA1的Mr约为50000,与PTA1分子的胞膜外区的Mr相当。
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图4免疫沉淀及Westernblot测定sPTA1的Mr
Fig4 Determination of the Mrof sPTA1 by immunoprecipita
tion and Western blot
1:Immunoprecipitated with mAb Loe A1;
2:Immunoprecipitated with control mAb IF12.
3讨论
我们采用抗PTA1的mAbLeoA1做亲和层析，纯化了血小板来源的天然PTA1分子。纯化的PTA1分子保持了较好的免疫反应性，以此作为抗原免疫新西兰纯种兔，得到高效价的特异性PcAb。我们建立的检测sPTA1的夹心ELISA法系统，对标准品的检测呈现良好的线性关系，敏感性可达100ng/L。
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可溶性形式的膜分子通常由细胞受到刺激后所产生[6]。在本实验中观察到人PBMC体外经TPA,PHA或抗CD3mAb激活后，sPTA1的产生明显增加，以TPA刺激产生的sPTA1水平较高，可能与不同刺激剂活化细胞的信号转导途径不同有关。与mPTA1相比较，sPTA1的产生在时相上晚于mPTA1的表达,似乎支持了sPTA1主要由mPTA1脱落而来。同许多可溶性粘附分子相类似，正常人血清中也存在一定水平的sPTA1分子，部分肿瘤患者(如肺癌、贲门癌、脑膜瘤、肾肿瘤及睾丸肿瘤等)的血清中，发现有较高水平的sPTA1分子，与正常人血清中的水平相比较差异显著(P∨0.001)。以往研究显示，心脏及肾脏移植患者的外周血淋巴细胞上可表达高水平的PTA1[4]，结合其它临床研究结果[5]，提示PTA1分子可能具有潜在的临床意义。
已证实TPA可诱导细胞内的酶活化，使一些膜分子产生可溶性形式。由于TPA刺激PBMC后产生的sPTA1水平较高,人血清中sPTA1的Mr也与mPTA1分子胞膜外区的Mr相当，提示sPTA1可能是在细胞内源性酶的作用下而产生的。PTA1分子在正常人血清中具有一定水平的可溶性形式，这主要是由于PTA1分子除表达于活化的T细胞、NK细胞和内皮细胞外，在血小板表面也有高水平的表达[3]，并可能成为血清中sPTA1的主要来源。sPTA1分子的生理功能及其与临床疾病的的关系均值得深入研究。
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致谢对西京医院输血科戴月娥和马红艳在血小板分离和正常人外周血采集中给予的热情帮助，中心实验室曹云新实验师在流式细胞仪样品检测中的大力帮助表示感谢!
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39770697
作者简介：贾卫，男，29岁，博士生
贾卫(第四军医大学免疫学教研室,陕西 西安 710032)
金伯泉(第四军医大学免疫学教研室,陕西 西安 710032)
李琦(第四军医大学免疫学教研室,陕西 西安 710032)
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刘雪松(第四军医大学免疫学教研室,陕西 西安 710032)
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[1]Burns GF,Triglia T,Werkmeister JA，et al.TLiSA,a human T lineage-specific activation antigen involved in the differentiation of cytotoxic T lymphocytes and anomalous killer cells from their precursors[J].J Exp Med,1985;16:1063-1078.
[2]Sherrington PD,Scott JL,Jin BQ,et al.TLisA1(PTA1) activation ant-igen implicated in T cell differentiation and platelet activation is a member of the immunoglobulin superfamily exhibiting distinctive regulation of expression[J].J Biol Chem,1997;272:21735-21744.
, http://www.100md.com
[3]Scott JL,Dunn SM,Jin BQ,et al.Characterization of a novel membrane glycoprotein involved in platelet activation[J].J Biol Chem,1989;264:13475-13482.
[4]Loertscher R,Forbes RD,Halabi G,et al.Expression of early and late activation markers on peripheral blood T lymphocytes does not reliably reflect immune events in transplanted hearts[J].Clin Transplant,1994;8(3 Pt 1):230-238.
[5]Huang C,Jin B,Wang M,et al.Hemorrhagic fever with renal syndrome relationship between pathogenesis and cellular immunity[J].J Infect Dis，1994;169(4):868-870.
[6]Bazil V.Physiological enzymatic cleavage of leukocyte membrane molecules[J].Immunol Today，1995;16 (3):135-140., http://www.100md.com