胰岛素眼液及其促吸收剂对兔血糖的影响
胰岛素眼液及其促吸收剂对兔血糖的影响
周跃华 李志辉 安伟丽 George CHIOU
摘 要 目的 本研究主要观察胰岛素眼液及其促吸收剂对兔血糖的影响。方法 不同浓度的胰岛素眼液及其促吸收剂滴入30只(30眼)新西兰白兔眼内，然后，对其血糖及血浆胰岛素进行测量。结果 胰岛素眼液降低血糖的作用是剂量依赖性的，10g.L-1的胰岛素降血糖作用与2.5g.L-1和5g.L-1的胰岛素给药组比较，具有显著性差异(P<0.05)；促吸收剂Tween 80可加速胰岛素的吸收，尤其是10g.L-1的Tween 80，其促进胰岛素吸收的能力与5g.L-1的Tween 80比较，具有显著性的差异(P<0.05)。结论 胰岛素眼液及其促吸收剂对于糖尿病病人的临床治疗具有一定的意义。
, 百拇医药
关键词：胰岛素；兔；血糖
胰岛素是一种肽类药物，由于胃肠消化道的肽酶可以使其降解，因此，对于胰岛素依赖型的糖尿病患者，不能采用口服给药的形式使用胰岛素。目前，最为常用的办法是皮下注射给药。胰岛素的这种给药方法，虽然有效，但其长期应用有一定的困难和麻烦，许多糖尿病病人深感痛苦和无奈。近年来，有报道在实验性的兔和鼠眼滴用一定的胰岛素眼液可降低血糖的浓度[1-4]。由于不同条件的胰岛素眼液及其促吸收剂对血糖影响的程度不同，故本研究以新西兰白兔为对象， 对胰岛素眼液及其促吸收剂的不同组合进行实验性的观察。
1 材料与方法
1.1 药物 猪胰岛素(26.1IU.mg-1)和 Tween 80 (polyoxyethylesorbitan monooleate) 均购于 Sigma 公司 ( St.Louis,MO)。胰岛素 RIA 试剂盒购于 Pharmacia Diagnostic 公司 ( Uppsala,Sweden )。实验所用的胰岛素眼液和促吸收剂 Tween 80 的浓度均用磷酸盐平衡溶液( PBS )新鲜配制，并将其pH值调至8.0。
, 百拇医药
1.2 动物模型 雌性新西兰白兔30只，体重2.5～3.0kg，随机分成5个不同的治疗组：2.5g.L-1胰岛素、5g.L-1 胰岛素、10g.L-1胰岛素、5g.L-1胰岛素+5g.L-1Tween 80 和 5g.L-1胰岛素+10g.L-1 Tween 80等治疗组，每组各 6 只。盐酸氯胺酮 35mg.kg-1加盐酸甲苯噻嗪 5mg.kg-1肌肉注射麻醉，此后，每小时半量肌肉注射维持麻醉。左股动脉插管 ( PE-90 ) ， 用于血液样本收集和肝素化 ( 50×103U.L-1)生理盐水的注入。50μL的胰岛素眼液或胰岛素眼液+促吸收剂点入兔左眼，收集 2mL的血液样本用于血糖和血浆胰岛素的测量。收集血样本的时间分别为：点药前、点药后10、20、30、60、90、120、180、240和300min。样本收集后，先用血糖测量仪2000型 ( Lifescan,Mountain View,CA ) 测量所收集样本的血糖含量，然后，每个血样本内加入约7mg的EDTA 用于抗凝，将血样本低速离心(150×g)10min，取离心后的血浆冷冻保存于 -70℃，用于胰岛素的放射免疫测定。实验结束后，戊巴比妥钠100mg.kg-1静脉注射将兔处死。
, http://www.100md.com
1.3 血浆胰岛素的测量 按照胰岛素RIA 试剂盒的要求，略作修改。其步骤如下：100μL的血浆+50μL 的125I 标记的胰岛素+50μL的胰岛素抗体，在室温下孵育 3h；加入二抗于室温下再孵育30min；在1500×g 的转速下离心10min，去上清液并用吸纸吸干；用伽玛自动计数仪( packard instrument,downers grove,IL )进行测量，从标准曲线中可读出胰岛素的含量。
2 结果
2.1 胰岛素眼液的浓度对兔血糖的影响 在pH值为8.0时，不同浓度的胰岛素眼液对兔血糖有不同程度的影响。2.5g.L-1胰岛素给药组，兔血糖含量的变化不大，在给药后120min，其血糖含量降到最低程度为给药前的84.66%±18.53%；5g.L-1胰岛素给药组，兔血糖含量的变化稍增大在给药后120 min，其血糖含量降到最低程度为给药前的 61.51%±14.37% ，但与2.5g.L-1的胰岛素给药组的兔血糖含量比较，2组间并无显著性差异(P<0.05)；10g.L-1胰岛素给药组，兔血糖含量的变化明显增大，在给药后180 min，其血糖含量降到最低程度为给药前的 30.26%±4.29% ，与2.5g.L-1和5g.L-1的胰岛素给药组的兔血糖含量比较，均有显著性差异(P<0.05)。
, 百拇医药
2.2 促吸收剂 ( Tween 80 ) 对胰岛素眼液吸收程度的影响 胰岛素眼液点眼后，兔血浆胰岛素的浓度迅速增加，于给药后20min，达到最高峰。5g.L-1胰岛素给药组，在给药后20min，其兔血浆胰岛素的浓度为89.12mU.L-1±25.73mU.L-1， 较给药前的22.40mU.L-1±5.42mU.L-1明显增加(P<0.05) ，同时，血糖含量在给药后120min降到最低程度为给药前的61.51%±14.37%； 5g.L-1胰岛素加5g.L-1Tween 80 给药组，在给药后 20 min，其兔血浆胰岛素的浓度为93.32mU.L-1±21.48mU.L-1，血糖含量在给药后180 min降到最低程度为给药前的62.60%±16.25%，与5g.L-1的胰岛素给药组比较，血浆胰岛素的浓度和血糖含量均无显著性差异(P>0.05 ) ；5g.L-1的胰岛素+10g.L-1的 Tween 80 给药组，在给药20min时，其兔血浆胰岛素浓度明显升高为210.77mU.L-1±41.95mU.L-1，血糖含量在给药后180min降到最低程度为给药前的46.40%±6.64%，与5g.L-1胰岛素给药组和5g.L-1胰岛素+5g.L-1 Tween 80给药组比较，血浆胰岛素的浓度和血糖含量均有显著性差异 ( P<0.05 ) 。
, 百拇医药
3 讨论
80年代末期，Chiou 等 [1-3] 首先报道，胰岛素眼液及其促吸收剂可用于降低兔血糖的含量。但是，10a过去，其临床应用还有许多问题有待于探讨。
3.1 胰岛素眼液如何影响血糖的含量 一般情况下，点眼液滴入眼内，根据分子量及可溶性的不同，药物主要通过角膜、结膜血管和鼻泪道等方式吸收[5-6]。胰岛素是一种肽类药物，Chiou 等 [1-3]认为，胰岛素很难通过角膜的方式而吸收，但是在其促吸收剂的作用下，有可能有少量的胰岛素通过角膜的方式吸收。Schwade 等 [7] 对胰岛素的吸收方式曾进行实验观察，发现在泪小点阻断的情况下，胰岛素眼液及其促吸收剂仍可以一定程度地降低兔血糖的含量，但是当泪小点打开后，其降血糖的能力明显增加，即胰岛素眼液通过结膜的方式可吸收约为28%～34% ，而通过鼻泪道的方式则可吸收66%～72%.可见，胰岛素对血糖的影响，主要是通过鼻泪道的吸收方式进入体循环。
, http://www.100md.com
3.2 不同浓度的胰岛素眼液对血糖的影响 胰岛素是一种肽类大分子物质，在一般情况下很难溶解，只有在碱性条件下才能够完全溶解。如果胰岛素眼液的 pH 过低，在高浓度下有可能有部分胰岛素处于非溶解状态而影响其降血糖的作用。在pH值为8.0时，高浓度的胰岛素眼液可以很好地溶解，其对血糖的影响是剂量依赖性的，即胰岛素眼液的浓度越高，其降血糖的程度就越大。在本实验中，10g.L-1胰岛素给药组，兔血糖降低的程度明显增大，与2.5g.L-1和5g.L-1胰岛素给药组比较，其差异均有显著性 (P<0.05 ) 。
3.3 促吸收剂对胰岛素眼液吸收程度的影响 Pillion等[4] 认为，皂角苷及其他表面活性剂可以作为胰岛素眼液的促吸收剂，其机制是多方面的。皂角苷可加速胰岛素从角膜表面清除而进入鼻泪道，防止或减少胰岛素在眼内的降解，亦可改善鼻泪道粘膜细胞的通透性而增加胰岛素的吸收。本实验观察发现，Tween 80可作为一种新的胰岛素眼液的促吸收剂，其对胰岛素眼液吸收程度的影响是剂量依赖性的，10g.L-1 Tween 80可以很好地促进胰岛素的吸收。
, http://www.100md.com
3.4 胰岛素眼液可否用于糖尿病患者的治疗 从目前的研究来看，胰岛素眼液已成功地用于降低兔及鼠的血糖含量[1-4] 。提示我们，肽类激素胰岛素是可以通过滴眼药的方式而影响体循环的血糖含量的，以此方式对糖尿病病人进行临床治疗是有可能的。但是人的体重明显高于兔的体重，约为兔体重的20 ～25倍。这样，用于人的胰岛素眼液的浓度则必须大大增加，否则，如果没有促吸收剂的帮助，其浓度将超过胰岛素眼液的最大允许浓度[8] ，而无法达到充分降低血糖的作用。因此，选择良好的促吸收剂，是胰岛素在未来能否用于糖尿病患者治疗的关键。
总之，胰岛素眼液及其促吸收剂对于糖尿病患者的治疗是有可能的，进一步的研究对其未来的临床应用具有重要的意义。
作者简介：周跃华，男，1966年出生。1989年毕业于哈尔滨医科大学。1993年考入首都医科大学北京同仁医院眼科，从师李志辉教授攻读硕士学位。1996年从师李志辉教授和孙葆忱教授攻读博士学位。1997～1998年在美国德克萨斯A&M大学医学院眼科药物研究所做博士后研究工作。目前从事角膜屈光手术和理论研究。在国内外先后发表“准分子激光角膜切削术治疗近视散光的临床研究”、“近视眼角膜屈光力及眼轴的测定分析”、“圆锥角膜与近视眼角膜地形图的比较”、“Corneal topographic analysis after excimer photorefractive keratectomy”、“Effects of some N-nitropyrazole derivatives on ocular blood flow and retinal function recovery after ischemic insult”、“瞬间性高眼压对视网膜功能的影响”等学术论文共20余篇。
, http://www.100md.com
作者单位：周跃华(首都医科大学附属北京同仁医院眼科 北京，100730)
李志辉(首都医科大学附属北京同仁医院眼科 北京，100730)
安伟丽(首都医科大学附属北京同仁医院眼科 北京，100730)
George CHIOU(A与M大学医学院眼科药物研究所 美国，德克萨斯)
参考文献
1，Chiou GC,Chuang CY,Chang MS.Reduction of blood glucose concentration with insulin eye drops[J].Diabetes Care 1988;11(9)∶750-751.
, http://www.100md.com 2，Chiou GC,Chuang CY.Improvement of systemic absorption of insulin through eyes with absorption enhancers[J].J Pharmacol Sci 1989;78(10)∶815-818.
3，Chiou GC,Chuang CY,Chang MS.Systemic delivery of insulin through eyes to lower the glucose concentration[J].J Ocul Pharmacol 1989;5(1)∶81-91.
4，Pillion DJ,Bartlett JD,Meezan E,et al.Systemic absorption of insulin delivered topically to the rat eye[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1991;32(12)∶3021-3027.
, 百拇医药
5，Patton TF,Francoeur M.Ocular bioavailabity and systemic loss of topically applied ophthalmic drugs[J].Am J Ophthalmol 1978;85(2)∶225-229.
6，Kaila T,Salminen L,Huuppanen R.Systemic absorption of topically applied ocular timolol[J].J Ocul Pharmacol 1985;1(1)∶79-83.
7，Schwade ND,Albritton Ⅳ FD,Liu SXL.Comparison of systemic absorption of insulin via conjunctiva with punctum sealed and via normal eye with punctum opened[J].Drug Delivery 1993;1∶139-142.
8，Lambert DW,Potter DE.Clinical Ophthalmic Pharmacology[M].Little Brown and Co.,Boston,MA.1987∶1-52., http://www.100md.com
周跃华 李志辉 安伟丽 George CHIOU
摘 要 目的 本研究主要观察胰岛素眼液及其促吸收剂对兔血糖的影响。方法 不同浓度的胰岛素眼液及其促吸收剂滴入30只(30眼)新西兰白兔眼内，然后，对其血糖及血浆胰岛素进行测量。结果 胰岛素眼液降低血糖的作用是剂量依赖性的，10g.L-1的胰岛素降血糖作用与2.5g.L-1和5g.L-1的胰岛素给药组比较，具有显著性差异(P<0.05)；促吸收剂Tween 80可加速胰岛素的吸收，尤其是10g.L-1的Tween 80，其促进胰岛素吸收的能力与5g.L-1的Tween 80比较，具有显著性的差异(P<0.05)。结论 胰岛素眼液及其促吸收剂对于糖尿病病人的临床治疗具有一定的意义。
, 百拇医药
关键词：胰岛素；兔；血糖
胰岛素是一种肽类药物，由于胃肠消化道的肽酶可以使其降解，因此，对于胰岛素依赖型的糖尿病患者，不能采用口服给药的形式使用胰岛素。目前，最为常用的办法是皮下注射给药。胰岛素的这种给药方法，虽然有效，但其长期应用有一定的困难和麻烦，许多糖尿病病人深感痛苦和无奈。近年来，有报道在实验性的兔和鼠眼滴用一定的胰岛素眼液可降低血糖的浓度[1-4]。由于不同条件的胰岛素眼液及其促吸收剂对血糖影响的程度不同，故本研究以新西兰白兔为对象， 对胰岛素眼液及其促吸收剂的不同组合进行实验性的观察。
1 材料与方法
1.1 药物 猪胰岛素(26.1IU.mg-1)和 Tween 80 (polyoxyethylesorbitan monooleate) 均购于 Sigma 公司 ( St.Louis,MO)。胰岛素 RIA 试剂盒购于 Pharmacia Diagnostic 公司 ( Uppsala,Sweden )。实验所用的胰岛素眼液和促吸收剂 Tween 80 的浓度均用磷酸盐平衡溶液( PBS )新鲜配制，并将其pH值调至8.0。
, 百拇医药
1.2 动物模型 雌性新西兰白兔30只，体重2.5～3.0kg，随机分成5个不同的治疗组：2.5g.L-1胰岛素、5g.L-1 胰岛素、10g.L-1胰岛素、5g.L-1胰岛素+5g.L-1Tween 80 和 5g.L-1胰岛素+10g.L-1 Tween 80等治疗组，每组各 6 只。盐酸氯胺酮 35mg.kg-1加盐酸甲苯噻嗪 5mg.kg-1肌肉注射麻醉，此后，每小时半量肌肉注射维持麻醉。左股动脉插管 ( PE-90 ) ， 用于血液样本收集和肝素化 ( 50×103U.L-1)生理盐水的注入。50μL的胰岛素眼液或胰岛素眼液+促吸收剂点入兔左眼，收集 2mL的血液样本用于血糖和血浆胰岛素的测量。收集血样本的时间分别为：点药前、点药后10、20、30、60、90、120、180、240和300min。样本收集后，先用血糖测量仪2000型 ( Lifescan,Mountain View,CA ) 测量所收集样本的血糖含量，然后，每个血样本内加入约7mg的EDTA 用于抗凝，将血样本低速离心(150×g)10min，取离心后的血浆冷冻保存于 -70℃，用于胰岛素的放射免疫测定。实验结束后，戊巴比妥钠100mg.kg-1静脉注射将兔处死。
, http://www.100md.com
1.3 血浆胰岛素的测量 按照胰岛素RIA 试剂盒的要求，略作修改。其步骤如下：100μL的血浆+50μL 的125I 标记的胰岛素+50μL的胰岛素抗体，在室温下孵育 3h；加入二抗于室温下再孵育30min；在1500×g 的转速下离心10min，去上清液并用吸纸吸干；用伽玛自动计数仪( packard instrument,downers grove,IL )进行测量，从标准曲线中可读出胰岛素的含量。
2 结果
2.1 胰岛素眼液的浓度对兔血糖的影响 在pH值为8.0时，不同浓度的胰岛素眼液对兔血糖有不同程度的影响。2.5g.L-1胰岛素给药组，兔血糖含量的变化不大，在给药后120min，其血糖含量降到最低程度为给药前的84.66%±18.53%；5g.L-1胰岛素给药组，兔血糖含量的变化稍增大在给药后120 min，其血糖含量降到最低程度为给药前的 61.51%±14.37% ，但与2.5g.L-1的胰岛素给药组的兔血糖含量比较，2组间并无显著性差异(P<0.05)；10g.L-1胰岛素给药组，兔血糖含量的变化明显增大，在给药后180 min，其血糖含量降到最低程度为给药前的 30.26%±4.29% ，与2.5g.L-1和5g.L-1的胰岛素给药组的兔血糖含量比较，均有显著性差异(P<0.05)。
, 百拇医药
2.2 促吸收剂 ( Tween 80 ) 对胰岛素眼液吸收程度的影响 胰岛素眼液点眼后，兔血浆胰岛素的浓度迅速增加，于给药后20min，达到最高峰。5g.L-1胰岛素给药组，在给药后20min，其兔血浆胰岛素的浓度为89.12mU.L-1±25.73mU.L-1， 较给药前的22.40mU.L-1±5.42mU.L-1明显增加(P<0.05) ，同时，血糖含量在给药后120min降到最低程度为给药前的61.51%±14.37%； 5g.L-1胰岛素加5g.L-1Tween 80 给药组，在给药后 20 min，其兔血浆胰岛素的浓度为93.32mU.L-1±21.48mU.L-1，血糖含量在给药后180 min降到最低程度为给药前的62.60%±16.25%，与5g.L-1的胰岛素给药组比较，血浆胰岛素的浓度和血糖含量均无显著性差异(P>0.05 ) ；5g.L-1的胰岛素+10g.L-1的 Tween 80 给药组，在给药20min时，其兔血浆胰岛素浓度明显升高为210.77mU.L-1±41.95mU.L-1，血糖含量在给药后180min降到最低程度为给药前的46.40%±6.64%，与5g.L-1胰岛素给药组和5g.L-1胰岛素+5g.L-1 Tween 80给药组比较，血浆胰岛素的浓度和血糖含量均有显著性差异 ( P<0.05 ) 。
, 百拇医药
3 讨论
80年代末期，Chiou 等 [1-3] 首先报道，胰岛素眼液及其促吸收剂可用于降低兔血糖的含量。但是，10a过去，其临床应用还有许多问题有待于探讨。
3.1 胰岛素眼液如何影响血糖的含量 一般情况下，点眼液滴入眼内，根据分子量及可溶性的不同，药物主要通过角膜、结膜血管和鼻泪道等方式吸收[5-6]。胰岛素是一种肽类药物，Chiou 等 [1-3]认为，胰岛素很难通过角膜的方式而吸收，但是在其促吸收剂的作用下，有可能有少量的胰岛素通过角膜的方式吸收。Schwade 等 [7] 对胰岛素的吸收方式曾进行实验观察，发现在泪小点阻断的情况下，胰岛素眼液及其促吸收剂仍可以一定程度地降低兔血糖的含量，但是当泪小点打开后，其降血糖的能力明显增加，即胰岛素眼液通过结膜的方式可吸收约为28%～34% ，而通过鼻泪道的方式则可吸收66%～72%.可见，胰岛素对血糖的影响，主要是通过鼻泪道的吸收方式进入体循环。
, http://www.100md.com
3.2 不同浓度的胰岛素眼液对血糖的影响 胰岛素是一种肽类大分子物质，在一般情况下很难溶解，只有在碱性条件下才能够完全溶解。如果胰岛素眼液的 pH 过低，在高浓度下有可能有部分胰岛素处于非溶解状态而影响其降血糖的作用。在pH值为8.0时，高浓度的胰岛素眼液可以很好地溶解，其对血糖的影响是剂量依赖性的，即胰岛素眼液的浓度越高，其降血糖的程度就越大。在本实验中，10g.L-1胰岛素给药组，兔血糖降低的程度明显增大，与2.5g.L-1和5g.L-1胰岛素给药组比较，其差异均有显著性 (P<0.05 ) 。
3.3 促吸收剂对胰岛素眼液吸收程度的影响 Pillion等[4] 认为，皂角苷及其他表面活性剂可以作为胰岛素眼液的促吸收剂，其机制是多方面的。皂角苷可加速胰岛素从角膜表面清除而进入鼻泪道，防止或减少胰岛素在眼内的降解，亦可改善鼻泪道粘膜细胞的通透性而增加胰岛素的吸收。本实验观察发现，Tween 80可作为一种新的胰岛素眼液的促吸收剂，其对胰岛素眼液吸收程度的影响是剂量依赖性的，10g.L-1 Tween 80可以很好地促进胰岛素的吸收。
, http://www.100md.com
3.4 胰岛素眼液可否用于糖尿病患者的治疗 从目前的研究来看，胰岛素眼液已成功地用于降低兔及鼠的血糖含量[1-4] 。提示我们，肽类激素胰岛素是可以通过滴眼药的方式而影响体循环的血糖含量的，以此方式对糖尿病病人进行临床治疗是有可能的。但是人的体重明显高于兔的体重，约为兔体重的20 ～25倍。这样，用于人的胰岛素眼液的浓度则必须大大增加，否则，如果没有促吸收剂的帮助，其浓度将超过胰岛素眼液的最大允许浓度[8] ，而无法达到充分降低血糖的作用。因此，选择良好的促吸收剂，是胰岛素在未来能否用于糖尿病患者治疗的关键。
总之，胰岛素眼液及其促吸收剂对于糖尿病患者的治疗是有可能的，进一步的研究对其未来的临床应用具有重要的意义。
作者简介：周跃华，男，1966年出生。1989年毕业于哈尔滨医科大学。1993年考入首都医科大学北京同仁医院眼科，从师李志辉教授攻读硕士学位。1996年从师李志辉教授和孙葆忱教授攻读博士学位。1997～1998年在美国德克萨斯A&M大学医学院眼科药物研究所做博士后研究工作。目前从事角膜屈光手术和理论研究。在国内外先后发表“准分子激光角膜切削术治疗近视散光的临床研究”、“近视眼角膜屈光力及眼轴的测定分析”、“圆锥角膜与近视眼角膜地形图的比较”、“Corneal topographic analysis after excimer photorefractive keratectomy”、“Effects of some N-nitropyrazole derivatives on ocular blood flow and retinal function recovery after ischemic insult”、“瞬间性高眼压对视网膜功能的影响”等学术论文共20余篇。
, http://www.100md.com
作者单位：周跃华(首都医科大学附属北京同仁医院眼科 北京，100730)
李志辉(首都医科大学附属北京同仁医院眼科 北京，100730)
安伟丽(首都医科大学附属北京同仁医院眼科 北京，100730)
George CHIOU(A与M大学医学院眼科药物研究所 美国，德克萨斯)
参考文献
1，Chiou GC,Chuang CY,Chang MS.Reduction of blood glucose concentration with insulin eye drops[J].Diabetes Care 1988;11(9)∶750-751.
, http://www.100md.com 2，Chiou GC,Chuang CY.Improvement of systemic absorption of insulin through eyes with absorption enhancers[J].J Pharmacol Sci 1989;78(10)∶815-818.
3，Chiou GC,Chuang CY,Chang MS.Systemic delivery of insulin through eyes to lower the glucose concentration[J].J Ocul Pharmacol 1989;5(1)∶81-91.
4，Pillion DJ,Bartlett JD,Meezan E,et al.Systemic absorption of insulin delivered topically to the rat eye[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1991;32(12)∶3021-3027.
, 百拇医药
5，Patton TF,Francoeur M.Ocular bioavailabity and systemic loss of topically applied ophthalmic drugs[J].Am J Ophthalmol 1978;85(2)∶225-229.
6，Kaila T,Salminen L,Huuppanen R.Systemic absorption of topically applied ocular timolol[J].J Ocul Pharmacol 1985;1(1)∶79-83.
7，Schwade ND,Albritton Ⅳ FD,Liu SXL.Comparison of systemic absorption of insulin via conjunctiva with punctum sealed and via normal eye with punctum opened[J].Drug Delivery 1993;1∶139-142.
8，Lambert DW,Potter DE.Clinical Ophthalmic Pharmacology[M].Little Brown and Co.,Boston,MA.1987∶1-52., http://www.100md.com