蛋白介导组胺H3受体调节垂体瘤AtT-20细胞分泌ACTH
蛋白介导组胺H3受体调节垂体瘤AtT-20细胞分泌ACTH
谢建军 罗晓星 赵德化
摘 要:目的 探讨G蛋白在组胺H3受体信号转导机制中的作用。方法 以高表达组胺H3受体的垂体细胞瘤AtT-20作为观察系统，用放免分析法测定给予H3受体激动剂后各时间点细胞上清液中ACTH分泌量的变化，并观察药物对细胞增殖的影响。结果 组胺H3受体激动剂R-(α)-MeHA(10-7mol/L)作用8h，能明显促进ACTH的释放，H1、H2受体激动剂无此作用，R-(α)-MeHA引起ACTH分泌的效应能被H3受体特异性拮抗剂thioperamide所拮抗，而H1受体和H2受体拮抗剂均不影响R-(α)-MeHA的效应。用G蛋白失活剂NEM预处理细胞后，取消了R-α-MeHA增强AtT-20细胞分泌ACTH的效应。结论 特异性激动组胺H3受体后能引起兴奋-分泌偶联过程，其信号转导过程中有G蛋白的参与。
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关键词：组胺H3受体；垂体瘤AtT-20细胞；促肾上腺皮质激素；G蛋白
组胺H3受体是1983年发现的一种组胺受体新亚型[1]，其作为突触前自身和异身受体，广泛分布于中枢与外周多种神经元末梢的突触前膜，通过负反馈调节神经递质的释放。目前，H3受体信号转导的机制尚不明确[2]。我们利用高表达组胺H3受体的垂体细胞瘤细胞AtT-20[3]作为观察系统，探讨了G蛋白在组胺H3受体信号转导机制中的作用。
1材料和方法
1.1材料 垂体细胞株AtT-20购自中国科学院上海细胞生物学研究所(从美国ATCC引进)，RPMI1640购自Gibco公司。新生牛血清(NBS)购自杭州四季青生物工程材料研究所。ACTH检测试剂购自天津德普生物技术和医学产品有限公司。H3受体激动剂R-(α)-methylhistamine〔R-(α)-MeHA〕购自Sigma公司。
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1.2方法
1.2.1细胞培养 复苏冻存的垂体细胞株AtT-20，以含100ml/L新生牛血清的RPMI1640培养液接种于培养瓶中，置于950ml/L空气和50ml/L孵箱内，24h后换液，以后每2～3d更换1次培养液。一般4～6d长满，以2.5g/L胰酶消化后，按1∶2或1∶3传代。
1.2.2ACTH的放射免疫测定 将AtT-20细胞消化分散后，以约2×105/孔铺于48孔培养板中。给药后，按不同时间点收集每孔的上清液，冰冻离心去除脱落细胞。将上清液按照试剂盒中产品说明书的操作步骤进行放免测定。
1.2.3细胞增殖试验(MTT法) 将细胞分散后，以104/孔铺于96孔板中。给药后，分别于8，和24h加入MTT5mg/L20μL/孔。反应4h后，小心吸弃上清液，加入DMSO100μL/孔，振荡10min，于波长670nm和630nm测定光吸收(A)。数据处理：培养细胞分泌ACTH以实际测算出的数值表示。数据表示为平均值±标准差，采用SPLM软件进行单因素方差分析。
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2结果
2.1AtT-20细胞生长状态观察 对传代后1～8d的细胞进行观察与拍照。细胞消化分散后呈小而圆形。传代后第1天，单个细胞呈梭形或三角形，体积较小，细胞中央隐约可见细小圆形颗粒。2～4d细胞体积逐渐长大，单个细胞呈梭状、岛状和枫叶状，有的呈多角形或呈簇状接合，部分体积较大的细胞开始融合，细胞中央颗粒明显可见。至5～6d，大部分细胞融合紧密，有的已呈现层叠生长，并出现细胞脱落，同时在大片融合细胞的边缘可见新生出的梭状小细胞。第8天细胞脱落明显，个别区域呈大片脱落，原已融合成片的细胞层块中央呈空洞穴状。
2.23种组胺激动剂对AtT-20细胞分泌ACTH的影响 分别在给药后0，1，2，4，8，12h，收集细胞上清液检测ACTH的分泌量。正常对照组在各时间点ACTH的分泌量变化不大，无统计学意义。R-(α)-MeHA组，在10-7mol/L作用下，随作用时间的延长，从4h起，ACTH的量即明显增高，8h达高峰，12h后逐渐降低。将4，8，12h各点分泌的ACTH与对照组相比较，均明显增高(P∨0.01)。而H1受体激动剂2-methylhistamine(10-6mol/L)和H2受体激动剂impromidine(10-5mol/L)对AtT-20细胞ACTH的分泌无明显影响(P∧0.05，图1)。
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图13种组胺受体激动剂对AtT-20细胞分泌ACTH的影响
Fig1 Effects of 3 histamineag on ists on ACTH levels secreted
by AtT-20cells
AtT-20cell streated with R-(α)-methylhistamine(■);2-methylhis-tamine(▲),Impromidine(
)and culture media(●,control),respectively.(n=8，aP∨0.05，bP∨0.01vscontrol).
, http://www.100md.com 2.33种拮抗剂对R-(α)-MeHA诱发AtT-20细胞分泌ACTH的影响10-5mol/L的组胺H3受体特异性拮抗剂thioperamide(TPM)能明显拮抗(10-7mol/L)R-(α)-MeHA的效应；10-6mol/L时能明显抑制(10-7mol/L)R-(α)-MeHA的效应；而10-5mol/LH1受体拮抗剂chlorpheniramine(CPR)和10-5mol/LH2受体拮抗剂cimetadine(CTD)都不能影响10-7mol/LR-(α)-MeHA的效应(图2)。
图2组胺H1，H2和H3拮抗剂对(10-7mol/L)R-(α)-MeHA
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诱发AtT-20细胞分泌ACTH的影响
Fig2 The in fluences of 3 antagonists on ACTH release of
AtT-20cell sinduced by MeHA(10-7mol/L)
1:Control;2:MeHA;3:TPM(10-6mol/L)+MeHA;4:TPM(10-5mol/L)+MeHA;5:CPR(10-5mol/L)+MeHA;6:CTD(10-5mol/L)+MeHA.n=8,aP∨0.05，bP∨0.01vs control group;cP∨0.05，dP∨0.01vsMeHA group.
2.4NEM对R-(α)-MeHA诱发AtT-20细胞分泌ACTH的影响 将细胞预先用G蛋白失活剂NEM(10-5mol/L)处理30min，能取消H3受体激动剂R-(α)MeHA(10-7mol/L)的效应(图3)。
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图3NEM对R(α)MeHA(10-7mol/L)诱导的AtT20细胞
释放ACTH的影响
Fig3 Effects of NEM(10-5mol/L)on the ACTH release from
AtT20cell sinduced by R-(α)-MeHA(10-7mol/L)
n=8，bP<0.01 vscontrol.
2.5激动剂R-(α)-MeHA对AtT-20细胞增殖的影响 用H3受体激动剂R-(α)-MeHA(10-5mol/L～10-9mol/L)作用8，24h后，与同时间点的对照组相比较，无明显增殖或抑制作用。
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3讨论
到目前为止，已发现有两种细胞株富含H3受体，即人胃癌HGT1细胞和鼠垂体细胞瘤AtT-20细胞[4]。我国虽购进此细胞株，但国内用AtT-20细胞进行的实验和研究资料尚少。因此，我们在细胞培养、生长状态等方面做了较为详细的观察，为今后利用AtT-20细胞开展科研工作奠定了基础。
本实验结果表明，我们购进并传代培养的垂体细胞瘤AtT-20细胞具有分泌ACTH的功能。组胺H3受体激动剂R-(α)-MeHA(10-7mol/L)能明显促进ACTH的释放；而H1和H2激动剂无此作用；但其引起ACTH分泌的效应能被H3受体特异性拮抗剂thioperamide所拮抗。H1受体和H2受体拮抗剂均不能影响R-(α)-MeHA的效应，说明R-α-MeHA引起ACTH分泌的升高是由H3受体特异性被激动所引起的。我们不仅用购进并传代培养的垂体细胞瘤AtT-20细胞，证实国外学者报道的该细胞可高表达H3受体，而且对R-α-MeHA引起ACTH分泌的原因做了进一步的实验分析。细胞增殖试验表明，R-α-MeHA诱发细胞分泌ACTH水平的升高并非由于细胞数目的增加，而是引起细胞分泌功能的明显提高，即激动此观察系统中的组胺H3受体可引起一个兴奋一分泌偶联过程。
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NEM属巯基烷化剂，在低浓度时，主要选择性地作用于PTX敏感的G蛋白，使G蛋白结构内巯基烷基化，从而使之不可逆性失活，阻断细胞信号的转导[5]。本实验结果表明，用低浓度的NEM处理细胞后，取消了R-α-MeHA增强AtT-20细胞分泌ACTH的效应，提示激动H3受体后所引起的兴奋一分泌偶联过程，其信号转导中有G蛋白的参与。至于G蛋白下游的第二信使有无Ca2+参与及其作用正在研究之中。
基金项目：国家自然科学基金资助,No.39900075
作者简介：谢建军，女，33岁，博士
谢建军(第四军医大学基础医学部药理学教研室，陕西 西安 710032)
罗晓星(第四军医大学基础医学部药理学教研室，陕西 西安 710032)
赵德化(第四军医大学基础医学部药理学教研室，陕西 西安 710032)
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参考文献：
[1]Arrang.J.M,Garbarg M，Schwartz JC.Auto-inhibition of brain histamine release mediated by a novel class (H3) histamine receptor[J].Nature,1983;302:832-837.
[2]Hill SJ,Ganellin CR,Timmerman,et al.International union of pharmacology.Ⅹ Ⅲ .Classification of histamine receptors[J].Pharmacol Rev,1997;49(3):253-279.
[3]Clark MA,Korte A,Myers J,et al.High affinity histamine H3 receptors regulate ACTH release by AtT-20 cells.Eur J Pharmacol,1992;210:31-35.
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[4]Cherifi Y,Pigeon C,Le Romancer M,et al.Purification of histamine H3 receptor negatively coupled to phosphoinositide turnover in the human gastric cell line HGT1[J].J Biol Chem,1992;267:25315-25320.
[5]Veda H,Misawa H,Katada T,et al.Functional reconstitution of purified Gi ande Go with μ opioid receptors in guinea stiatal membranes pretreated with micromolar concentration of N-ethylmaleimide[J].J Neurochem,1990;54:841-848., 百拇医药(蛋白介导组胺H3受体调节垂体瘤AtT-20细胞分泌ACTH)
谢建军 罗晓星 赵德化
摘 要:目的 探讨G蛋白在组胺H3受体信号转导机制中的作用。方法 以高表达组胺H3受体的垂体细胞瘤AtT-20作为观察系统，用放免分析法测定给予H3受体激动剂后各时间点细胞上清液中ACTH分泌量的变化，并观察药物对细胞增殖的影响。结果 组胺H3受体激动剂R-(α)-MeHA(10-7mol/L)作用8h，能明显促进ACTH的释放，H1、H2受体激动剂无此作用，R-(α)-MeHA引起ACTH分泌的效应能被H3受体特异性拮抗剂thioperamide所拮抗，而H1受体和H2受体拮抗剂均不影响R-(α)-MeHA的效应。用G蛋白失活剂NEM预处理细胞后，取消了R-α-MeHA增强AtT-20细胞分泌ACTH的效应。结论 特异性激动组胺H3受体后能引起兴奋-分泌偶联过程，其信号转导过程中有G蛋白的参与。
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关键词：组胺H3受体；垂体瘤AtT-20细胞；促肾上腺皮质激素；G蛋白
组胺H3受体是1983年发现的一种组胺受体新亚型[1]，其作为突触前自身和异身受体，广泛分布于中枢与外周多种神经元末梢的突触前膜，通过负反馈调节神经递质的释放。目前，H3受体信号转导的机制尚不明确[2]。我们利用高表达组胺H3受体的垂体细胞瘤细胞AtT-20[3]作为观察系统，探讨了G蛋白在组胺H3受体信号转导机制中的作用。
1材料和方法
1.1材料 垂体细胞株AtT-20购自中国科学院上海细胞生物学研究所(从美国ATCC引进)，RPMI1640购自Gibco公司。新生牛血清(NBS)购自杭州四季青生物工程材料研究所。ACTH检测试剂购自天津德普生物技术和医学产品有限公司。H3受体激动剂R-(α)-methylhistamine〔R-(α)-MeHA〕购自Sigma公司。
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1.2方法
1.2.1细胞培养 复苏冻存的垂体细胞株AtT-20，以含100ml/L新生牛血清的RPMI1640培养液接种于培养瓶中，置于950ml/L空气和50ml/L孵箱内，24h后换液，以后每2～3d更换1次培养液。一般4～6d长满，以2.5g/L胰酶消化后，按1∶2或1∶3传代。
1.2.2ACTH的放射免疫测定 将AtT-20细胞消化分散后，以约2×105/孔铺于48孔培养板中。给药后，按不同时间点收集每孔的上清液，冰冻离心去除脱落细胞。将上清液按照试剂盒中产品说明书的操作步骤进行放免测定。
1.2.3细胞增殖试验(MTT法) 将细胞分散后，以104/孔铺于96孔板中。给药后，分别于8，和24h加入MTT5mg/L20μL/孔。反应4h后，小心吸弃上清液，加入DMSO100μL/孔，振荡10min，于波长670nm和630nm测定光吸收(A)。数据处理：培养细胞分泌ACTH以实际测算出的数值表示。数据表示为平均值±标准差，采用SPLM软件进行单因素方差分析。
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2结果
2.1AtT-20细胞生长状态观察 对传代后1～8d的细胞进行观察与拍照。细胞消化分散后呈小而圆形。传代后第1天，单个细胞呈梭形或三角形，体积较小，细胞中央隐约可见细小圆形颗粒。2～4d细胞体积逐渐长大，单个细胞呈梭状、岛状和枫叶状，有的呈多角形或呈簇状接合，部分体积较大的细胞开始融合，细胞中央颗粒明显可见。至5～6d，大部分细胞融合紧密，有的已呈现层叠生长，并出现细胞脱落，同时在大片融合细胞的边缘可见新生出的梭状小细胞。第8天细胞脱落明显，个别区域呈大片脱落，原已融合成片的细胞层块中央呈空洞穴状。
2.23种组胺激动剂对AtT-20细胞分泌ACTH的影响 分别在给药后0，1，2，4，8，12h，收集细胞上清液检测ACTH的分泌量。正常对照组在各时间点ACTH的分泌量变化不大，无统计学意义。R-(α)-MeHA组，在10-7mol/L作用下，随作用时间的延长，从4h起，ACTH的量即明显增高，8h达高峰，12h后逐渐降低。将4，8，12h各点分泌的ACTH与对照组相比较，均明显增高(P∨0.01)。而H1受体激动剂2-methylhistamine(10-6mol/L)和H2受体激动剂impromidine(10-5mol/L)对AtT-20细胞ACTH的分泌无明显影响(P∧0.05，图1)。
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图13种组胺受体激动剂对AtT-20细胞分泌ACTH的影响
Fig1 Effects of 3 histamineag on ists on ACTH levels secreted
by AtT-20cells
AtT-20cell streated with R-(α)-methylhistamine(■);2-methylhis-tamine(▲),Impromidine(
)and culture media(●,control),respectively.(n=8，aP∨0.05，bP∨0.01vscontrol)., http://www.100md.com 2.33种拮抗剂对R-(α)-MeHA诱发AtT-20细胞分泌ACTH的影响10-5mol/L的组胺H3受体特异性拮抗剂thioperamide(TPM)能明显拮抗(10-7mol/L)R-(α)-MeHA的效应；10-6mol/L时能明显抑制(10-7mol/L)R-(α)-MeHA的效应；而10-5mol/LH1受体拮抗剂chlorpheniramine(CPR)和10-5mol/LH2受体拮抗剂cimetadine(CTD)都不能影响10-7mol/LR-(α)-MeHA的效应(图2)。
图2组胺H1，H2和H3拮抗剂对(10-7mol/L)R-(α)-MeHA
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诱发AtT-20细胞分泌ACTH的影响
Fig2 The in fluences of 3 antagonists on ACTH release of
AtT-20cell sinduced by MeHA(10-7mol/L)
1:Control;2:MeHA;3:TPM(10-6mol/L)+MeHA;4:TPM(10-5mol/L)+MeHA;5:CPR(10-5mol/L)+MeHA;6:CTD(10-5mol/L)+MeHA.n=8,aP∨0.05，bP∨0.01vs control group;cP∨0.05，dP∨0.01vsMeHA group.
2.4NEM对R-(α)-MeHA诱发AtT-20细胞分泌ACTH的影响 将细胞预先用G蛋白失活剂NEM(10-5mol/L)处理30min，能取消H3受体激动剂R-(α)MeHA(10-7mol/L)的效应(图3)。
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图3NEM对R(α)MeHA(10-7mol/L)诱导的AtT20细胞
释放ACTH的影响
Fig3 Effects of NEM(10-5mol/L)on the ACTH release from
AtT20cell sinduced by R-(α)-MeHA(10-7mol/L)
n=8，bP<0.01 vscontrol.
2.5激动剂R-(α)-MeHA对AtT-20细胞增殖的影响 用H3受体激动剂R-(α)-MeHA(10-5mol/L～10-9mol/L)作用8，24h后，与同时间点的对照组相比较，无明显增殖或抑制作用。
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到目前为止，已发现有两种细胞株富含H3受体，即人胃癌HGT1细胞和鼠垂体细胞瘤AtT-20细胞[4]。我国虽购进此细胞株，但国内用AtT-20细胞进行的实验和研究资料尚少。因此，我们在细胞培养、生长状态等方面做了较为详细的观察，为今后利用AtT-20细胞开展科研工作奠定了基础。
本实验结果表明，我们购进并传代培养的垂体细胞瘤AtT-20细胞具有分泌ACTH的功能。组胺H3受体激动剂R-(α)-MeHA(10-7mol/L)能明显促进ACTH的释放；而H1和H2激动剂无此作用；但其引起ACTH分泌的效应能被H3受体特异性拮抗剂thioperamide所拮抗。H1受体和H2受体拮抗剂均不能影响R-(α)-MeHA的效应，说明R-α-MeHA引起ACTH分泌的升高是由H3受体特异性被激动所引起的。我们不仅用购进并传代培养的垂体细胞瘤AtT-20细胞，证实国外学者报道的该细胞可高表达H3受体，而且对R-α-MeHA引起ACTH分泌的原因做了进一步的实验分析。细胞增殖试验表明，R-α-MeHA诱发细胞分泌ACTH水平的升高并非由于细胞数目的增加，而是引起细胞分泌功能的明显提高，即激动此观察系统中的组胺H3受体可引起一个兴奋一分泌偶联过程。
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NEM属巯基烷化剂，在低浓度时，主要选择性地作用于PTX敏感的G蛋白，使G蛋白结构内巯基烷基化，从而使之不可逆性失活，阻断细胞信号的转导[5]。本实验结果表明，用低浓度的NEM处理细胞后，取消了R-α-MeHA增强AtT-20细胞分泌ACTH的效应，提示激动H3受体后所引起的兴奋一分泌偶联过程，其信号转导中有G蛋白的参与。至于G蛋白下游的第二信使有无Ca2+参与及其作用正在研究之中。
基金项目：国家自然科学基金资助,No.39900075
作者简介：谢建军，女，33岁，博士
谢建军(第四军医大学基础医学部药理学教研室，陕西 西安 710032)
罗晓星(第四军医大学基础医学部药理学教研室，陕西 西安 710032)
赵德化(第四军医大学基础医学部药理学教研室，陕西 西安 710032)
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参考文献：
[1]Arrang.J.M,Garbarg M，Schwartz JC.Auto-inhibition of brain histamine release mediated by a novel class (H3) histamine receptor[J].Nature,1983;302:832-837.
[2]Hill SJ,Ganellin CR,Timmerman,et al.International union of pharmacology.Ⅹ Ⅲ .Classification of histamine receptors[J].Pharmacol Rev,1997;49(3):253-279.
[3]Clark MA,Korte A,Myers J,et al.High affinity histamine H3 receptors regulate ACTH release by AtT-20 cells.Eur J Pharmacol,1992;210:31-35.
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[4]Cherifi Y,Pigeon C,Le Romancer M,et al.Purification of histamine H3 receptor negatively coupled to phosphoinositide turnover in the human gastric cell line HGT1[J].J Biol Chem,1992;267:25315-25320.
[5]Veda H,Misawa H,Katada T,et al.Functional reconstitution of purified Gi ande Go with μ opioid receptors in guinea stiatal membranes pretreated with micromolar concentration of N-ethylmaleimide[J].J Neurochem,1990;54:841-848., 百拇医药(蛋白介导组胺H3受体调节垂体瘤AtT-20细胞分泌ACTH)