氦氖激光抑制培养瘢痕成纤维细胞生长的实验研究
氦氖激光抑制培养瘢痕成纤维细胞生长的实验研究
舒彬 吴宗耀 李涛 麦跃
摘 要 目的 探讨氦氖激光体外照射对培养的瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用。方法 以632.8 nm波长氦氖激光(功率密度50 mW/cm2)，3 J/cm2，30 J/cm2，90 J/cm2，180 J/cm2剂量，分别照射培养的人瘢痕成纤维细胞1次，3次和5次，每日1次，然后进行细胞计数和细胞周期分析。结果180 J/cm2重复照射3次和5次，细胞总数都明显少于同期对照组，差异均有显著性(P<0.05)。细胞周期分析表明，180 J/cm2照射细胞3次和5次后，S期细胞数从51%降低到20%和14%，G0/G1期细胞从28%分别上升到55%和60%，Sub-G2期细胞百分比分别为6.7%和9.8%。结论 一定剂量(180 J/cm2)氦氖激光重复照射能抑制培养的瘢痕成纤维细胞生长，原因可能是由于氦氖激光引起G0/G1期细胞停滞和细胞凋亡所致。
, 百拇医药
关键词：激光，氦氖；瘢痕；成纤维细胞；生长障碍；细胞周期
低能量激光的生物剌激(biostimulation)或生物激活(bioactivation)效应，国内外已有大量文献报道[1，2]，本研究目的是探讨低能量氦氖激光对培养瘢痕成纤维细胞生长的抑制或杀伤效应，试图将低能量激光用于增生性瘢痕的防治。
材料和方法
增生性瘢痕患者5例，均符合增生性瘢痕诊断标准[3]，年龄14～38岁，男3例，女2例，瘢痕存在时间8～24个月，平均16.7个月。按组织块法行成纤维细胞的原代培养。于含有体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基、CO2培养箱中，湿度100%、37℃条件下培养，待原代培养细胞布满培养皿后，用0.25%胰酶和0.02%EDTA-Na2(Sigma)共同消化传代，4～5 d传代1次，以4～10代细胞为实验细胞。实验分两部分，第一部分研究接种密度对细胞生长的影响，即将不同密度(5 000个/孔，10 000个/孔和20 000个/孔)的指数生长期细胞接种于96孔培养板，分别在接种后1，2，3，4，5，6，7和9 d进行细胞计数；第二部分研究激光照射对细胞生长的影响，包括不同激光剂量与照射次数对细胞生长的影响。将细胞接种于96孔培养孔，在CO2培养箱中孵育24 h后开始进行激光照射，激光照射前弃培养液，Hank平衡液冲洗，激光直接照射无培养液细胞，照射后添加新鲜培养液，置CO2培养箱中继续孵育。
, 百拇医药
采用重庆产HN-120型大功率氦氖激光照射仪，波长632.8 nm，三根光纤的最大输出功率分别为42，45和50 mW，实际输出功率由CLP-1型柱状激光功率计(北京放射医学研究所)测定，照射前调整光纤距离，使光斑完全覆盖整个培养孔底部(面积0.32 cm2)，垂直照射，功率密度约为50 mW/cm2，分别照射培养细胞1，10，30和60 min(相应能量密度约为3 J/cm2，30 J/cm2，90 J/cm2和180 J/cm2)，每日1次，在激光照射1，3和5次后24 h，即在细胞接种后第2，4和6 d，消化收集各剂量照射组细胞与对照组细胞(每组6孔)，然后进行台盼蓝染色计数(每个样本计数3次，取平均值)和FACS 420型流式细胞仪(BD公司)测定各细胞周期百分比(激发波长488 nm)。
结 果
细胞接种后24 h，仅有20%～30%的细胞贴壁，各种密度接种细胞在贴壁后的生长速率基本相同，当细胞密度达到6 000～8 000个/孔时，由于细胞融合，细胞生长缓慢，甚至停止；以5 000个/孔密度接种，接种6～7 d后细胞数量仍有增加，而以较高密度如20 000个/孔接种，3 d后细胞数量接近最大量(图1)，因此，本研究选用5 000个/孔的接种密度来观察激光照射对细胞生长的影响。
, 百拇医药
图1 培养瘢痕成纤维细胞的生长曲线
以不同剂量激光连续照射培养瘢痕成纤维细胞5次，24 h后对细胞进行计数，结果示3 J/cm2，30 J/cm2和90 J/cm2照射组细胞总数与对照组比较无明显差异，180 J/cm2照射组细胞总数少于对照组，两组差异有显著性(t＝2.77，P<0.05)。二次测定结果趋势基本相同(图2)。
图2 激光剂量与细胞生长的关系
由图3可见，3 J/cm2照射培养细胞1，3次与30 J/cm2照射1次，细胞总数都明显多于同期对照组(t＝2.78，2.54，2.62，P<0.05)；3 J/cm2照射5次，30 J/cm2照射3次和5次，90 J/cm2照射1，3和5次，180 J/cm2照射1次，总细胞数量与同期对照组相比无明显差异；180 J/cm2照射3次和5次后的细胞总数均少于同期对照组，两组相比差异有显著性(t＝2.75，2.82，P<0.05)。
, 百拇医药
图3 激光照射次数与细胞生长的关系
细胞周期分析示3 J/cm2照射1次和3次，30 J/cm2照射1次后，S期细胞百分比从51%增加到77%～66%不等，G0/G1期细胞百分比从28%降低到17%～13%不等，G2/M期细胞百分比无明显变化；3 J/cm2照射5次，30 J/cm2照射3次和5次，或90 J/cm2照射1，3，5次，180 J/cm2照射1次后，各细胞周期百分比与对照组相比差异无显著性；180 J/cm2照射3 和5次后，G0/G1期细胞数从对照组28%分别增加到55%和60%，S期细胞数从51%分别下降到20%和14%，G2/M期细胞百分比无明显变化；Sub-G2细胞在90 J/cm2重复照射时出现，180 J/cm2照射3和5次后分别为6.7%和9.8%(表1)。
, 百拇医药
表1 氦氖激光照射对培养的人瘢痕成纤维细胞周期分布的影响(%)
组 别
照射次数
细胞周期百分比(%)
Sub-G2
G0/G1
S
G2/M
对照组
0
0
, 百拇医药
28.2
51.4
20.4
3 J/cm2
1
0
16.7
76.9
16.4
3
0
14.1
65.8
, 百拇医药
20.1
5
0
32.1
44.4
23.5
30 J/cm2
1
0
13.4
65.7
20.9
3
, 百拇医药
0
27.8
46.1
26.1
5
0
29.4
44.3
26.3
90 J/cm2
1
0
29.2
, 百拇医药
49.5
21.3
3
1.1
33.7
46.9
18.3
5
2.5
38.2
42.3
17.0
180 J/cm2
, http://www.100md.com
1
0
31.1
45.7
23.2
3
6.7
55.4
19.8
18.1
5
9.8
60.2
, 百拇医药
14.2
15.8
讨 论
80年代初，人们开始使用二氧化碳激光、氩离子激光、Nd:YAG激光等来治疗增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，但由于这些高能量激光照射后产生新创面，故不可避免地出现复发，甚至加重[4]。低能量激光如氦氖激光照射不会损伤局部组织，但它能否用于增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的防治则不清楚。
低能量激光照射对培养人成纤维细胞增殖的影响已进行了大量研究。一些学者报道，氦氖激光(0.1 mW/cm2，0.1 J/cm2)照射能促进人成纤维细胞增殖[5]。一些学者发现，它对成纤维细胞生长无影响(24.7 mW/cm2，1.5 J/cm2[6]；2.5 mW/cm2，0.15 J/cm2[7])，而Bruegel等[8]报道，氦氖激光(0.55 mW照射330 s或2.91 mW照射60 s)能抑制培养人成纤维细胞增殖。氦氖激光(40 mW/cm2，11.9～142 J/cm2)抑制其他类型细胞如鼠肾上皮细胞生长的研究亦有报道[9]，以上结果差异可能与使用的激光剂量或强度不同有关，本研究采用50 mW/cm2功率密度氦氖激光以不同剂量照射，每日1次，连续照射5次，结果发现，以3 J/cm2，30 J/cm2和90 J/cm2能量密度照射，不能抑制瘢痕成纤维细胞生长，而以180 J/cm2能量密度照射则能抑制细胞生长，提示氦氖激光对培养瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用仅发生在一定的剂量水平(与强度的关系另文报道)。
, http://www.100md.com
照射次数对细胞生长影响的研究发现，氦氖激光一次照射刺激细胞生长(3 J/cm2、30 J/cm2)或对细胞生长无影响(90 J/cm2、180 J/cm2)，但无论多大剂量(3～180 J/cm2)，氦氖激光一次照射都不能抑制瘢痕细胞生长；氦氖激光多次重复照射，不仅能剌激细胞生长如3 J/cm2重复照射3次，或对细胞生长不产生影响如3 J/cm2照射5次、30 J/cm2或90 J/cm2照射3和5次，而且还能抑制细胞生长如180 J/cm2重复照射3和5次时。可见氦氖激光对培养瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用还与照射次数有关。
氦氖激光抑制细胞生长的机制，有学者报道，氦氖激光照射能改变分离线粒体和RNA的光特性[10]，本研究采用流式细胞仪对细胞周期进行分析，发现180 J/cm2氦氖激光重复照射能改变培养人瘢痕成纤维细胞的细胞周期分布，其中DNA合成前期(G0/G1)细胞百分比显著增加，S期细胞百分比显著降低，DNA合成后期(G2/M)细胞百分比无明显变化，这提示氦氖激光对细胞生长的抑制作用可能是通过引起G0/G1期细胞停滞所致。Sub-G2(亚二倍体)表示DNA降解，又称细胞凋亡峰，Sub-G2细胞在氦氖激光一次照射或3 J/cm2、30 J/cm2重复照射后都未呈现，在90 J/cm2重复照射后仅有少量产生，而180 J/cm2重复照射后明显增多，可见凋亡细胞的出现与细胞生长抑制相一致，这提示氦氖激光对细胞生长的抑制作用还与细胞凋亡有关。细胞凋亡不同于坏死，它是细胞在一定生理和病理条件下，遵循自身程序的生理性死亡，因而不会产生明显炎性反应。氦氖激光照射引起培养瘢痕成纤维细胞凋亡的产生，使激光无创治疗增生性瘢痕成为可能。
, 百拇医药
舒彬(400042 第三军医大学大坪医院康复理疗科)
吴宗耀(400038 重庆，第三军医大学西南医院康复理疗科)
李涛(第三军医大学西南医院皮肤科)
麦跃(第三军医大学大坪医院护理部)
参考文献
1，Hrnjak M,Kuljic KN,Budisin A,et al.Stimulatory effect of low-power density He-Ne laser radiation on human fibroblasts in vitro.Vojnosanit Pregl,1995,52:539-546.
2，Lam TS,Abergel RP,Meeker CA,et al.Laser stimulation of collagen synthesis in human skin fibroblast cultures.Life Sci,1986,1:61-77.
, 百拇医药
3，许伟石，主编.现代烧伤治疗.北京：北京科学技术出版社，1995.214-215.
4，Alster TS.Laser treatment of hypertrophic scars,keloids and striac.Dermatol Clin,1997,15:419-429.
5，Boulton M,Marshall J.He-Ne stimulation of human fibroblast proliferation and attachment in vitro.Lasers Life Sci,1986,1:125-134.
6，Hallman HO,Basford JR,O'Brien JF,et al.Does low-energy helium-neon laser irradiation alter ‘in vitro’ replication of human fibroblasts.Lasers Surg Med,1988,8:125-129.
, 百拇医药
7，Colver GB.Failure of a He-Ne laser to affect components of wound healing in vitro.Br J Dermatol,1989,121:179-186.
8，Breugel HHFI,Bar PRD.Power density and exposure time of He-Ne laser irradiation are more important than total energy dose in photo biomodulation of human fibroblast in vitro.Laser Surg Med,1992,12:528-537.
9，Gross AJ,Jelkmann W.Helium-Neon laser irradiation inhibits the growth of kidney epithelial cells in culture.Lasers Surg Med,1990,10:40-44.
10，Glassberg E,Lask GP,Tan EML,et al.Cellular effects of the pulsed tunable dye laser at 577 nanometers on human endothelial cells,fibroblasts, and erythrocytes:an in vitro study.Lasers Surg Med,1988,8:567-572., 百拇医药
舒彬 吴宗耀 李涛 麦跃
摘 要 目的 探讨氦氖激光体外照射对培养的瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用。方法 以632.8 nm波长氦氖激光(功率密度50 mW/cm2)，3 J/cm2，30 J/cm2，90 J/cm2，180 J/cm2剂量，分别照射培养的人瘢痕成纤维细胞1次，3次和5次，每日1次，然后进行细胞计数和细胞周期分析。结果180 J/cm2重复照射3次和5次，细胞总数都明显少于同期对照组，差异均有显著性(P<0.05)。细胞周期分析表明，180 J/cm2照射细胞3次和5次后，S期细胞数从51%降低到20%和14%，G0/G1期细胞从28%分别上升到55%和60%，Sub-G2期细胞百分比分别为6.7%和9.8%。结论 一定剂量(180 J/cm2)氦氖激光重复照射能抑制培养的瘢痕成纤维细胞生长，原因可能是由于氦氖激光引起G0/G1期细胞停滞和细胞凋亡所致。
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关键词：激光，氦氖；瘢痕；成纤维细胞；生长障碍；细胞周期
低能量激光的生物剌激(biostimulation)或生物激活(bioactivation)效应，国内外已有大量文献报道[1，2]，本研究目的是探讨低能量氦氖激光对培养瘢痕成纤维细胞生长的抑制或杀伤效应，试图将低能量激光用于增生性瘢痕的防治。
材料和方法
增生性瘢痕患者5例，均符合增生性瘢痕诊断标准[3]，年龄14～38岁，男3例，女2例，瘢痕存在时间8～24个月，平均16.7个月。按组织块法行成纤维细胞的原代培养。于含有体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基、CO2培养箱中，湿度100%、37℃条件下培养，待原代培养细胞布满培养皿后，用0.25%胰酶和0.02%EDTA-Na2(Sigma)共同消化传代，4～5 d传代1次，以4～10代细胞为实验细胞。实验分两部分，第一部分研究接种密度对细胞生长的影响，即将不同密度(5 000个/孔，10 000个/孔和20 000个/孔)的指数生长期细胞接种于96孔培养板，分别在接种后1，2，3，4，5，6，7和9 d进行细胞计数；第二部分研究激光照射对细胞生长的影响，包括不同激光剂量与照射次数对细胞生长的影响。将细胞接种于96孔培养孔，在CO2培养箱中孵育24 h后开始进行激光照射，激光照射前弃培养液，Hank平衡液冲洗，激光直接照射无培养液细胞，照射后添加新鲜培养液，置CO2培养箱中继续孵育。
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采用重庆产HN-120型大功率氦氖激光照射仪，波长632.8 nm，三根光纤的最大输出功率分别为42，45和50 mW，实际输出功率由CLP-1型柱状激光功率计(北京放射医学研究所)测定，照射前调整光纤距离，使光斑完全覆盖整个培养孔底部(面积0.32 cm2)，垂直照射，功率密度约为50 mW/cm2，分别照射培养细胞1，10，30和60 min(相应能量密度约为3 J/cm2，30 J/cm2，90 J/cm2和180 J/cm2)，每日1次，在激光照射1，3和5次后24 h，即在细胞接种后第2，4和6 d，消化收集各剂量照射组细胞与对照组细胞(每组6孔)，然后进行台盼蓝染色计数(每个样本计数3次，取平均值)和FACS 420型流式细胞仪(BD公司)测定各细胞周期百分比(激发波长488 nm)。
结 果
细胞接种后24 h，仅有20%～30%的细胞贴壁，各种密度接种细胞在贴壁后的生长速率基本相同，当细胞密度达到6 000～8 000个/孔时，由于细胞融合，细胞生长缓慢，甚至停止；以5 000个/孔密度接种，接种6～7 d后细胞数量仍有增加，而以较高密度如20 000个/孔接种，3 d后细胞数量接近最大量(图1)，因此，本研究选用5 000个/孔的接种密度来观察激光照射对细胞生长的影响。
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图1 培养瘢痕成纤维细胞的生长曲线
以不同剂量激光连续照射培养瘢痕成纤维细胞5次，24 h后对细胞进行计数，结果示3 J/cm2，30 J/cm2和90 J/cm2照射组细胞总数与对照组比较无明显差异，180 J/cm2照射组细胞总数少于对照组，两组差异有显著性(t＝2.77，P<0.05)。二次测定结果趋势基本相同(图2)。
图2 激光剂量与细胞生长的关系
由图3可见，3 J/cm2照射培养细胞1，3次与30 J/cm2照射1次，细胞总数都明显多于同期对照组(t＝2.78，2.54，2.62，P<0.05)；3 J/cm2照射5次，30 J/cm2照射3次和5次，90 J/cm2照射1，3和5次，180 J/cm2照射1次，总细胞数量与同期对照组相比无明显差异；180 J/cm2照射3次和5次后的细胞总数均少于同期对照组，两组相比差异有显著性(t＝2.75，2.82，P<0.05)。
, 百拇医药
图3 激光照射次数与细胞生长的关系
细胞周期分析示3 J/cm2照射1次和3次，30 J/cm2照射1次后，S期细胞百分比从51%增加到77%～66%不等，G0/G1期细胞百分比从28%降低到17%～13%不等，G2/M期细胞百分比无明显变化；3 J/cm2照射5次，30 J/cm2照射3次和5次，或90 J/cm2照射1，3，5次，180 J/cm2照射1次后，各细胞周期百分比与对照组相比差异无显著性；180 J/cm2照射3 和5次后，G0/G1期细胞数从对照组28%分别增加到55%和60%，S期细胞数从51%分别下降到20%和14%，G2/M期细胞百分比无明显变化；Sub-G2细胞在90 J/cm2重复照射时出现，180 J/cm2照射3和5次后分别为6.7%和9.8%(表1)。
, 百拇医药
表1 氦氖激光照射对培养的人瘢痕成纤维细胞周期分布的影响(%)
组 别
照射次数
细胞周期百分比(%)
Sub-G2
G0/G1
S
G2/M
对照组
0
0
, 百拇医药
28.2
51.4
20.4
3 J/cm2
1
0
16.7
76.9
16.4
3
0
14.1
65.8
, 百拇医药
20.1
5
0
32.1
44.4
23.5
30 J/cm2
1
0
13.4
65.7
20.9
3
, 百拇医药
0
27.8
46.1
26.1
5
0
29.4
44.3
26.3
90 J/cm2
1
0
29.2
, 百拇医药
49.5
21.3
3
1.1
33.7
46.9
18.3
5
2.5
38.2
42.3
17.0
180 J/cm2
, http://www.100md.com
1
0
31.1
45.7
23.2
3
6.7
55.4
19.8
18.1
5
9.8
60.2
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14.2
15.8
讨 论
80年代初，人们开始使用二氧化碳激光、氩离子激光、Nd:YAG激光等来治疗增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，但由于这些高能量激光照射后产生新创面，故不可避免地出现复发，甚至加重[4]。低能量激光如氦氖激光照射不会损伤局部组织，但它能否用于增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的防治则不清楚。
低能量激光照射对培养人成纤维细胞增殖的影响已进行了大量研究。一些学者报道，氦氖激光(0.1 mW/cm2，0.1 J/cm2)照射能促进人成纤维细胞增殖[5]。一些学者发现，它对成纤维细胞生长无影响(24.7 mW/cm2，1.5 J/cm2[6]；2.5 mW/cm2，0.15 J/cm2[7])，而Bruegel等[8]报道，氦氖激光(0.55 mW照射330 s或2.91 mW照射60 s)能抑制培养人成纤维细胞增殖。氦氖激光(40 mW/cm2，11.9～142 J/cm2)抑制其他类型细胞如鼠肾上皮细胞生长的研究亦有报道[9]，以上结果差异可能与使用的激光剂量或强度不同有关，本研究采用50 mW/cm2功率密度氦氖激光以不同剂量照射，每日1次，连续照射5次，结果发现，以3 J/cm2，30 J/cm2和90 J/cm2能量密度照射，不能抑制瘢痕成纤维细胞生长，而以180 J/cm2能量密度照射则能抑制细胞生长，提示氦氖激光对培养瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用仅发生在一定的剂量水平(与强度的关系另文报道)。
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照射次数对细胞生长影响的研究发现，氦氖激光一次照射刺激细胞生长(3 J/cm2、30 J/cm2)或对细胞生长无影响(90 J/cm2、180 J/cm2)，但无论多大剂量(3～180 J/cm2)，氦氖激光一次照射都不能抑制瘢痕细胞生长；氦氖激光多次重复照射，不仅能剌激细胞生长如3 J/cm2重复照射3次，或对细胞生长不产生影响如3 J/cm2照射5次、30 J/cm2或90 J/cm2照射3和5次，而且还能抑制细胞生长如180 J/cm2重复照射3和5次时。可见氦氖激光对培养瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用还与照射次数有关。
氦氖激光抑制细胞生长的机制，有学者报道，氦氖激光照射能改变分离线粒体和RNA的光特性[10]，本研究采用流式细胞仪对细胞周期进行分析，发现180 J/cm2氦氖激光重复照射能改变培养人瘢痕成纤维细胞的细胞周期分布，其中DNA合成前期(G0/G1)细胞百分比显著增加，S期细胞百分比显著降低，DNA合成后期(G2/M)细胞百分比无明显变化，这提示氦氖激光对细胞生长的抑制作用可能是通过引起G0/G1期细胞停滞所致。Sub-G2(亚二倍体)表示DNA降解，又称细胞凋亡峰，Sub-G2细胞在氦氖激光一次照射或3 J/cm2、30 J/cm2重复照射后都未呈现，在90 J/cm2重复照射后仅有少量产生，而180 J/cm2重复照射后明显增多，可见凋亡细胞的出现与细胞生长抑制相一致，这提示氦氖激光对细胞生长的抑制作用还与细胞凋亡有关。细胞凋亡不同于坏死，它是细胞在一定生理和病理条件下，遵循自身程序的生理性死亡，因而不会产生明显炎性反应。氦氖激光照射引起培养瘢痕成纤维细胞凋亡的产生，使激光无创治疗增生性瘢痕成为可能。
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舒彬(400042 第三军医大学大坪医院康复理疗科)
吴宗耀(400038 重庆，第三军医大学西南医院康复理疗科)
李涛(第三军医大学西南医院皮肤科)
麦跃(第三军医大学大坪医院护理部)
参考文献
1，Hrnjak M,Kuljic KN,Budisin A,et al.Stimulatory effect of low-power density He-Ne laser radiation on human fibroblasts in vitro.Vojnosanit Pregl,1995,52:539-546.
2，Lam TS,Abergel RP,Meeker CA,et al.Laser stimulation of collagen synthesis in human skin fibroblast cultures.Life Sci,1986,1:61-77.
, 百拇医药
3，许伟石，主编.现代烧伤治疗.北京：北京科学技术出版社，1995.214-215.
4，Alster TS.Laser treatment of hypertrophic scars,keloids and striac.Dermatol Clin,1997,15:419-429.
5，Boulton M,Marshall J.He-Ne stimulation of human fibroblast proliferation and attachment in vitro.Lasers Life Sci,1986,1:125-134.
6，Hallman HO,Basford JR,O'Brien JF,et al.Does low-energy helium-neon laser irradiation alter ‘in vitro’ replication of human fibroblasts.Lasers Surg Med,1988,8:125-129.
, 百拇医药
7，Colver GB.Failure of a He-Ne laser to affect components of wound healing in vitro.Br J Dermatol,1989,121:179-186.
8，Breugel HHFI,Bar PRD.Power density and exposure time of He-Ne laser irradiation are more important than total energy dose in photo biomodulation of human fibroblast in vitro.Laser Surg Med,1992,12:528-537.
9，Gross AJ,Jelkmann W.Helium-Neon laser irradiation inhibits the growth of kidney epithelial cells in culture.Lasers Surg Med,1990,10:40-44.
10，Glassberg E,Lask GP,Tan EML,et al.Cellular effects of the pulsed tunable dye laser at 577 nanometers on human endothelial cells,fibroblasts, and erythrocytes:an in vitro study.Lasers Surg Med,1988,8:567-572., 百拇医药