结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建
结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建
范雄林 徐志凯 白光春 李元 李别虎 薛莹
摘 要：目的 构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因，用限制性内切酶消化后,插入克隆载体pUC19中。经酶切鉴定与序列测定证实后，以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3的相应酶切位点。结果 结核分枝杆菌H37Ra株Ag85B成熟蛋白的编码基因经序列测定证实，与Erdman株完全一致；用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3。结论 以Ag85B成熟蛋白的编码基因为基础的真核表达载体的构建成功，为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。
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关键词:结核分枝杆菌；Ag85B；真核表达载体
结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一。目前,全世界仍约有1/3的人感染，每年约800万的新发病例和300万的患者死亡，加之多重耐药株的出现和HIV双重感染的威胁，1993年,WHO宣布：全球处于结核病威胁的紧急状态。卡介苗接种是预防结核病的重要措施，但其预防效果不稳定，接种BCG对人群的保护率介于0%～80%之间〔1〕。为此，我们克隆了编码结核杆菌分泌蛋白Ag85B的基因，并构建了该基因的真核表达载体，以期用于结核病的防治研究。
1材料和方法
1.1材料 TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4DNA连接酶、HindⅢ和EcoRⅠ购自Promega公司。7H9液体培养基购自Difco公司。λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ购自华美公司。玻璃奶回收试剂盒购自原平皓公司。其余试剂均为国产分析纯。E.coliJM109，质粒pUC19及真核表达质粒pcDNA3，均为本室保存。结核杆菌H37Ra株为陕西省结核病防治研究所惠赠,保存于7H9液体培养基中。
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1.2方法
1.2.1结核杆菌基因组DNA的提取 取少量结核菌液接种于7H9液体培养基中，37℃培养2wk。取5mL液体培养物以10000r/min离心10min。将沉淀重悬于50μL裂解液(10×PCR缓冲液5μL，45g/L吐温-205μL，45g/LNP-405μL，20g/L蛋白酶K0.5μL及水34.5μL)中，于55℃水浴1h，沸水浴10min灭活蛋白酶K，再以8000r/min离心1min。取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50μLTE中，贮存于-20℃备用。
1.2.2Ag85B基因的扩增、克隆及测序 ①PCR反应：根据结核杆菌Erdman株Ag85B基因的全序列〔2〕设计引物,P1：5′-GCAAGCTTATGACCGCGGG-CGCGTTCTCC-3′，含HindIII酶切位点和起始码ATG；P2：5′-GGAATTCTCAGCCGGCGCCTAACG-3′，含EcoRI酶切位点和终止码，由西安美联公司合成。PCR反应体系为：10×buffer5μL，dNTPs2μL(2.5mmol/L)，DNA5μL,P1和P2引物各1μL(25μmol/L)及Taq酶0.2μL(1U)，加水至50μL。反应条件为：95℃变性5min，94℃30s,60℃30s,72℃50s,共30个循环，再72℃延伸5min。扩增产物用10g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。质粒的提取、酶切及克隆参见文献〔3〕的方法。即用碱裂解法提取质粒pUC19后，将其与PCR产物分别用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，经1%g/L琼脂糖凝胶电泳，切下目标条带，参照玻璃奶试剂盒中的说明书回收，各溶于20μLH2O中。取双酶切的PCR产物和质粒pUC19，按3∶1的分子比混合，用T4连接酶连接，转化用低温CaCl2制备的E.coliJM109感受态细胞。然后,涂布于LB平板(含氨苄青霉素100mg/L)，以蓝白法筛选阳性克隆。②重组质粒的酶切鉴定和插入片段序列的分析:随机挑选6个白色菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，以碱裂解法提取质粒DNA。将提取的质粒DNA用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，进行1%琼脂糖凝胶电泳，以λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ为分子量参照，观察有无约880bp大小的片段。将筛选出的阳性克隆采用Sanger双脱氧链终止法,在ABIPRISMTM测序仪上进行双向测序。
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1.2.3Ag85B基因真核表达载体的构建 将碱裂解法提取的阳性克隆重组质粒DNA，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶回收约880bp大小的酶切产物，并与用相同酶切回收的pcDNA3质粒载体DNA连接，转化E.coliJM109感受态细胞。所获阳性克隆用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定。
2结果
2.1Ag85B基因的扩增、克隆及序列分析 以结核杆菌基因组DNA为模板，采用P1和P2引物进行PCR，经30个循环后，扩增出约880bp大小的特异性条带(图1)。将扩增产物酶切后，与质粒pUC19连接并转化感受态JM109。随机挑选6个白色菌落提取质粒，经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，有5个克隆切出约880bp大小的片段，即阳性克隆(图2)。将2号阳性克隆命名为pUC19-TB30，经正、反向自动测序，所得序列结果与文献〔2〕报道的一致(图3)。同时证实，结核杆菌H37Ra株和Erdman株的Ag85B成熟蛋白编码序列相同。该段基因的序列已被收录入GenBank(AF198032)。
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图1PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig1 Agarose gel electrophoresis of PCR product
M:Marker λ DNA/Hind Ⅲ+EcoRⅠ;1:PCR product.
图2重组质粒pUC19-TB30的酶切分析
Fig2 Restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid pUC19-TB30
M:Marker λ DNA/Hind Ⅲ+EcoRⅠ;1～6:Plasmid pUC19 cut with EcoRI and Hind III;7:Uncut plasmid pUC19.
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2.2结核杆菌真核表达载体的构建 将2号阳性克隆扩大培养，以碱裂解法提取质粒DNA，用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，玻璃奶回收约880bp大小的酶切产物，与用同样酶切的pcDNA3质粒载体连接，并转化JM109感受态细菌。转化后，在选择平板上随机挑选5个克隆，提取质粒，用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，全部切出约880bp大小的片段。
图3插入片段的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the in-
serted fragment
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3讨论
机体抗御结核菌的感染主要依靠细胞免疫。能诱发保护性细胞免疫应答结核杆菌蛋白存在于该菌对数生长早期的培养物中。Ag85B为结核杆菌主要分泌蛋白Ag85复合体(包括Ag85A，B和C,相对分子质量(Mr)介于30000～32000)中的组分之一〔4〕。目前，已知该复合体属于分枝菌酸转移酶，在结核杆菌细胞壁合成的晚期起关键作用〔5〕。在结核杆菌众多的分泌蛋白中，Ag85B(Mr为30000蛋白)可诱导实验动物产生Th1型细胞免疫应答，其抵抗结核杆菌再感染的能力优于BCG〔6,7〕。Ag85B还可诱导PPD阳性健康人群外周血单个核细胞分泌高水平的IFN-γ，而活动期肺结核患者的外周血单个核细胞分泌IFN-γ的水平极低，也进一步表明Ag85B是机体的保护性靶抗原〔8〕。从已有的研究表明，Ag85B可能是最有希望取代BCG的亚单位疫苗。基因疫苗是疫苗研制的第3次革命，其制备简单，可诱导持久的体液和细胞免疫应答，特别是可诱导产生CD8+CTL，而亚单位疫苗则不易达到〔9〕。我们通过克隆结核杆菌分泌蛋白Ag85B的编码基因，并构建了其真核表达载体，从而为进一步研究该表达载体作为核酸疫苗在结核病防治中的作用奠定了基础。
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作者简介：范雄林，男，27岁，博士生
范雄林(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
徐志凯(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
白光春(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
李元(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
李别虎(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
薛莹(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
参考文献:
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[1]Fine PEM.Variation in protection by BCG:implications of and for heterologous immunity[J].Lancet,1995;346:1339-1345.
[2]Harth G,Lee BY,Horwitz MA.High level heterologous expression and secretion in rapidly growing nonpathogenic mycobacteria of four major Mycobacterium tuberculosis extracellular proteins considered to be leading vaccine candidates and drug targets[J].Infect Immun,1997;65(6):2321-2328.
[3]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual[M].2nd ed,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:133-148.
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[4]Wiker HG,Harboe M.The antigen 85 complex:a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis[J].Microbiol Rev,1992;56(4):648-661.
[5]Belisle JT,Vissa VD,Sievert T,et al.Role of the major antigen of Mycobacterium tuberculosis in cell wall biogenesis[J].Science,1997;276:1420-1422.
[6]Horwitz MZ,Lee BW,Dillon BJ,et al.Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995; 92:1530-1534.
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[7]Sinha RK,Verma I,Khuller GK,et al.Immunobiological properties of a 30 kDa secretory protein of Mycobacterium tuberculosis H37Ra[J].Vaccine,1997;15(6/7):689-699.
[8]Torres M,Herrera T,Villareal H,et al.Cytokine profiles for peripheral blood lymphocytes from patients with active pulmonary tuberculosis and healthy household contacts in response to the 30-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis[J].Infect Immun,1998;66(1):176-180.
[9]Tang DC,Devit M,Johnston SA,et al.Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response[J].Nature,1992;356:152-154., 百拇医药
范雄林 徐志凯 白光春 李元 李别虎 薛莹
摘 要：目的 构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因，用限制性内切酶消化后,插入克隆载体pUC19中。经酶切鉴定与序列测定证实后，以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3的相应酶切位点。结果 结核分枝杆菌H37Ra株Ag85B成熟蛋白的编码基因经序列测定证实，与Erdman株完全一致；用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3。结论 以Ag85B成熟蛋白的编码基因为基础的真核表达载体的构建成功，为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。
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关键词:结核分枝杆菌；Ag85B；真核表达载体
结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一。目前,全世界仍约有1/3的人感染，每年约800万的新发病例和300万的患者死亡，加之多重耐药株的出现和HIV双重感染的威胁，1993年,WHO宣布：全球处于结核病威胁的紧急状态。卡介苗接种是预防结核病的重要措施，但其预防效果不稳定，接种BCG对人群的保护率介于0%～80%之间〔1〕。为此，我们克隆了编码结核杆菌分泌蛋白Ag85B的基因，并构建了该基因的真核表达载体，以期用于结核病的防治研究。
1材料和方法
1.1材料 TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4DNA连接酶、HindⅢ和EcoRⅠ购自Promega公司。7H9液体培养基购自Difco公司。λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ购自华美公司。玻璃奶回收试剂盒购自原平皓公司。其余试剂均为国产分析纯。E.coliJM109，质粒pUC19及真核表达质粒pcDNA3，均为本室保存。结核杆菌H37Ra株为陕西省结核病防治研究所惠赠,保存于7H9液体培养基中。
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1.2方法
1.2.1结核杆菌基因组DNA的提取 取少量结核菌液接种于7H9液体培养基中，37℃培养2wk。取5mL液体培养物以10000r/min离心10min。将沉淀重悬于50μL裂解液(10×PCR缓冲液5μL，45g/L吐温-205μL，45g/LNP-405μL，20g/L蛋白酶K0.5μL及水34.5μL)中，于55℃水浴1h，沸水浴10min灭活蛋白酶K，再以8000r/min离心1min。取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50μLTE中，贮存于-20℃备用。
1.2.2Ag85B基因的扩增、克隆及测序 ①PCR反应：根据结核杆菌Erdman株Ag85B基因的全序列〔2〕设计引物,P1：5′-GCAAGCTTATGACCGCGGG-CGCGTTCTCC-3′，含HindIII酶切位点和起始码ATG；P2：5′-GGAATTCTCAGCCGGCGCCTAACG-3′，含EcoRI酶切位点和终止码，由西安美联公司合成。PCR反应体系为：10×buffer5μL，dNTPs2μL(2.5mmol/L)，DNA5μL,P1和P2引物各1μL(25μmol/L)及Taq酶0.2μL(1U)，加水至50μL。反应条件为：95℃变性5min，94℃30s,60℃30s,72℃50s,共30个循环，再72℃延伸5min。扩增产物用10g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。质粒的提取、酶切及克隆参见文献〔3〕的方法。即用碱裂解法提取质粒pUC19后，将其与PCR产物分别用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，经1%g/L琼脂糖凝胶电泳，切下目标条带，参照玻璃奶试剂盒中的说明书回收，各溶于20μLH2O中。取双酶切的PCR产物和质粒pUC19，按3∶1的分子比混合，用T4连接酶连接，转化用低温CaCl2制备的E.coliJM109感受态细胞。然后,涂布于LB平板(含氨苄青霉素100mg/L)，以蓝白法筛选阳性克隆。②重组质粒的酶切鉴定和插入片段序列的分析:随机挑选6个白色菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，以碱裂解法提取质粒DNA。将提取的质粒DNA用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，进行1%琼脂糖凝胶电泳，以λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ为分子量参照，观察有无约880bp大小的片段。将筛选出的阳性克隆采用Sanger双脱氧链终止法,在ABIPRISMTM测序仪上进行双向测序。
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1.2.3Ag85B基因真核表达载体的构建 将碱裂解法提取的阳性克隆重组质粒DNA，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶回收约880bp大小的酶切产物，并与用相同酶切回收的pcDNA3质粒载体DNA连接，转化E.coliJM109感受态细胞。所获阳性克隆用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定。
2结果
2.1Ag85B基因的扩增、克隆及序列分析 以结核杆菌基因组DNA为模板，采用P1和P2引物进行PCR，经30个循环后，扩增出约880bp大小的特异性条带(图1)。将扩增产物酶切后，与质粒pUC19连接并转化感受态JM109。随机挑选6个白色菌落提取质粒，经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，有5个克隆切出约880bp大小的片段，即阳性克隆(图2)。将2号阳性克隆命名为pUC19-TB30，经正、反向自动测序，所得序列结果与文献〔2〕报道的一致(图3)。同时证实，结核杆菌H37Ra株和Erdman株的Ag85B成熟蛋白编码序列相同。该段基因的序列已被收录入GenBank(AF198032)。
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图1PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig1 Agarose gel electrophoresis of PCR product
M:Marker λ DNA/Hind Ⅲ+EcoRⅠ;1:PCR product.
图2重组质粒pUC19-TB30的酶切分析
Fig2 Restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid pUC19-TB30
M:Marker λ DNA/Hind Ⅲ+EcoRⅠ;1～6:Plasmid pUC19 cut with EcoRI and Hind III;7:Uncut plasmid pUC19.
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2.2结核杆菌真核表达载体的构建 将2号阳性克隆扩大培养，以碱裂解法提取质粒DNA，用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，玻璃奶回收约880bp大小的酶切产物，与用同样酶切的pcDNA3质粒载体连接，并转化JM109感受态细菌。转化后，在选择平板上随机挑选5个克隆，提取质粒，用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，全部切出约880bp大小的片段。
图3插入片段的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the in-
serted fragment
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3讨论
机体抗御结核菌的感染主要依靠细胞免疫。能诱发保护性细胞免疫应答结核杆菌蛋白存在于该菌对数生长早期的培养物中。Ag85B为结核杆菌主要分泌蛋白Ag85复合体(包括Ag85A，B和C,相对分子质量(Mr)介于30000～32000)中的组分之一〔4〕。目前，已知该复合体属于分枝菌酸转移酶，在结核杆菌细胞壁合成的晚期起关键作用〔5〕。在结核杆菌众多的分泌蛋白中，Ag85B(Mr为30000蛋白)可诱导实验动物产生Th1型细胞免疫应答，其抵抗结核杆菌再感染的能力优于BCG〔6,7〕。Ag85B还可诱导PPD阳性健康人群外周血单个核细胞分泌高水平的IFN-γ，而活动期肺结核患者的外周血单个核细胞分泌IFN-γ的水平极低，也进一步表明Ag85B是机体的保护性靶抗原〔8〕。从已有的研究表明，Ag85B可能是最有希望取代BCG的亚单位疫苗。基因疫苗是疫苗研制的第3次革命，其制备简单，可诱导持久的体液和细胞免疫应答，特别是可诱导产生CD8+CTL，而亚单位疫苗则不易达到〔9〕。我们通过克隆结核杆菌分泌蛋白Ag85B的编码基因，并构建了其真核表达载体，从而为进一步研究该表达载体作为核酸疫苗在结核病防治中的作用奠定了基础。
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作者简介：范雄林，男，27岁，博士生
范雄林(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
徐志凯(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
白光春(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
李元(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
李别虎(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
薛莹(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
参考文献:
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[1]Fine PEM.Variation in protection by BCG:implications of and for heterologous immunity[J].Lancet,1995;346:1339-1345.
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[3]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual[M].2nd ed,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:133-148.
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[4]Wiker HG,Harboe M.The antigen 85 complex:a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis[J].Microbiol Rev,1992;56(4):648-661.
[5]Belisle JT,Vissa VD,Sievert T,et al.Role of the major antigen of Mycobacterium tuberculosis in cell wall biogenesis[J].Science,1997;276:1420-1422.
[6]Horwitz MZ,Lee BW,Dillon BJ,et al.Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995; 92:1530-1534.
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[7]Sinha RK,Verma I,Khuller GK,et al.Immunobiological properties of a 30 kDa secretory protein of Mycobacterium tuberculosis H37Ra[J].Vaccine,1997;15(6/7):689-699.
[8]Torres M,Herrera T,Villareal H,et al.Cytokine profiles for peripheral blood lymphocytes from patients with active pulmonary tuberculosis and healthy household contacts in response to the 30-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis[J].Infect Immun,1998;66(1):176-180.
[9]Tang DC,Devit M,Johnston SA,et al.Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response[J].Nature,1992;356:152-154., 百拇医药