血管紧张素原基因多态性与原发性高血压关系的研究
刘静波 张幼辰 俞顺章
摘 要 目的 探索血管紧张素原(AGT)的M235T多态性与上海市嘉定区望新乡原发性高血压的关系。方法 以人群为基础进行高血压病例-对照研究，应用PCR-RFLP技术，分析AGT的M235T多态性。结果 望新乡高血压病例组中AGT基因TT基因型频率显著高于对照组，分别为42.8%和33.0%。相对于MM基因型，暴露于TT基因型的OR值为3.61。病例组中T等位基因的频率也显著高于对照组，分别为73.89%和60.31%，随着等位基因T的增加，患高血压的危险性显著增加，趋势检验P<0.05。 病例组中体质指数按MM、MT、TT基因型的顺序依次增大，各组差异有显著性。结论 TT基因型可能是望新乡原发性高血压的易感基因型。
关键词：高血压；血管紧张素原基因
, 百拇医药
高血压是一种严重影响人类健康的世界性常见慢性疾病,是心、脑、肾等器官损伤的主要危险因素,具有明显的家族聚集倾向,遗传因素与高血压发病密切相关,一般认为原发性高血压(EH)是在遗传易感性的基础上与许多环境因素的共同作用下发生的[1-4]。肾素-血管紧张素系统(RAS)是调节血压和血容量的激素系统[5], 也是一个复杂的血压反馈系统，RAS由血管紧张素原(AGT),肾素(RESIN),血管紧张素Ⅰ,血管紧张素转化酶(ACE),血管紧张素Ⅱ(AⅡ),血管紧张素Ⅱ受体组成[6]。其中AⅡ是强有力的血管平滑肌收缩剂，通过对周围小动脉和前毛细管平滑肌的直接作用，引起血管收缩，是形成高血压的重要原因[7]。AGT是RAS系统中的唯一初始底物，血浆中AGT水平的高低，直接影响着RAS系统活性的强弱[8]，AGT基因被认为是高血压的候选基因之一，它位于人染色体Iq42-43处编码区，由5个外显子和4个内含子构成[9]，其中由于碱基的错义突变(T→C)导致了编码第235氨基酸由甲硫氨酸突变成为苏氨酸(M235T)[10]。本研究是以上海市嘉定区望新乡人群为基础的病例-对照研究，应用PCR-RFLP技术，分析AGT的M235T多态性，目的在于探索AGT的M235T多态性与望新乡原发性高血压的关系。
, 百拇医药
材料与方法
一、研究对象
1.病例组：于1997年对上海市嘉定区望新乡进行全人群高血压普查，共查出高血压患者758人，分布于望新乡的11个自然村庄中。我们以每个村庄作为一个抽样点，按该村高血压患者名单，随机抽样(男∶女=1∶1)。根据高血压患者的既往病史，排除继发性高血压，11个村庄中共抽样高血压患者90例。
2.对照组：按性别、年龄相匹配的原则，在同一村庄中，选择与高血压患者性别相同、年龄相差小于5岁的血压水平正常的人(收缩压<140 mmHg,舒张压<90 mmHg),作为对照组。
二、方法
1.流行病学调查：对所有研究对象，均按统一调查表，由经过专门培训的调查员，以面对面的方式直接进行问卷调查。调查的内容包括：性别、民族、婚姻状况、文化程度、职业、经济收入、卫生知识水平、高血压及脑卒中家族史、各种危险因素(吸烟、饮酒、饮食)暴露水平等。在调查的同时进行测量身高、体重、血压水平并空腹静脉抽血5 ml，离心分离血清，血清用于作血糖、血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白等生化指标，血凝块用于基因组DNA的抽提[11]。
, 百拇医药
2. AGT基因多态性分析：引物设计参照文献[7]设计，AGT基因的扩增引物，由上海Sangon公司合成，引物序列如下： Primer1: 5′-CAGGGTGCT
GTCCACACTGGACCCC-3′; Primer2: 5′-CCGT
TTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT-3′, PCR扩增反应总体积50 μl，反应终浓度MgCl2为2.5 mmol/L，dNTPs为100 μmmol/L，引物为1 μmmol/L，模板为3～100 ng ，Taq酶2 U。循环条件:94℃ 1 min，68℃ 1 min，72℃ 1 min。10个循环之后，按以下条件:90℃ 1 min，68℃ 1 min, 72℃ 1 min，再反应30个循环，72℃延伸10 min。反应产物用限制性内切酶TthⅢ进行酶切反应，12 h，于2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压20 V，时间3 h。然后在紫外光下检测，AGT的M235T基因扩增片段长度为165 bp，如果在第235位上存在T→C的突变，则扩增产物在限制性内切酶TthⅢ的作用下被切成两部分：141 bp和24 bp；如果第235位上没有发生突变，则扩增片段长度保持不变，由此产生两个等位基因T、M，分别形成三个基因型：TT(141 bp)、MT(141 bp和165 bp)、MM(165 bp)。
, 百拇医药
三、统计分析
所有资料均在EPI5软件中建立数据库，输入电脑，用SPSS软件分析。
结 果
一、研究对象的一般情况
本次研究对象共187例，男性95例，女性92例，病例组和对照组均为汉族人，其中原发性高血压患者90例(男47例，女43例)，正常对照97人(男48人，女49人)。病例组和对照组男女性别差异无显著性(χ2=0.770, P=0.410)，病例组平均年龄是(60.60±11.38)岁，对照组平均年龄是(56.77±16.26)岁，两组差异无显著性，说明病例和对照两组研究对象是具有可比性的。
二、研究对象的临床生化指标
病例组体质指数显著高于对照组，从各生化指标水平来看，病例组血清总胆固醇、甘油三酯显著高于对照组，而高密度脂蛋白则显著低于对照组，其他各项指标两组差异均无显著性(表1)。
, http://www.100md.com
表1 高血压病例组-对照组临床生化指标
生化指标
病例组(90例)
对照组(97例)
P值
性别(男/女)
47/43
48/49
>0.05
年龄(岁)
60.60±11.38
56.77±16.26
, 百拇医药
>0.05
血清总胆固醇(mmol/L)
4.44±0.76
4.22±0.75
<0.05
甘油三酯(mmol/L)
1.65±0.72
1.40±0.71
<0.05
高密度脂蛋白(mmol/L)
1.65±0.40
1.76±0.35
, 百拇医药
<0.05
低密度脂蛋白(mmol/L)
2.03±0.82
1.83±0.70
>0.05
血糖(mmol/L)
5.02±1.26
4.74±0.85
>0.05
体质指数(kg/m2)
24.29±3.38
, 百拇医药 21.86±2.79
<0.001
三、AGT基因各基因型在原发性高血压病例组和对照组中的分布
由表2可见，AGT基因MM、MT、TT各基因型在病例组、对照组中的分布分别为9.1%、48.1%和42.8%;12.4%、54.6%和33.0%。病例组中TT基因型的频率显著高于对照组，而MM基因型频率显著低于对照组，如果以基因型MM为参考则暴露于MT基因型的OR值是1.68，而暴露于TT基因型的OR值为3.61。可见随着等位基因T的增加，患高血压的危险性显著增加，趋势检验：χ2=8.453，P<0.05。
四、AGT基因各等位基因在病例组和对照组中的分布
AGT基因的M、T两等位基因频率在病例组中分别为26.11%和73.89%；在对照组中分别为39.69% 和60.31%，可见，病例组T等位基因频率显著高于对照组，OR值为1.86，95%的可信区间是1.17～2.96(P<0.05)。
, http://www.100md.com
表2 血管紧张素原(AGT)各基因型在病例组-
对照组中的分布
基因
型
病例组
对照组
OR
值
95%CI
P值
例数
频率
(%)
, 百拇医药
例数
频率
(%)
MM
5
9.1
12
12.4
1.00
MT
37
48.1
53
, 百拇医药 54.6
1.68
0.49～ 6.01
>0.05
TT
48
42.8
32
33.0
3.60
1.04～13.12
<0.05
合计
, 百拇医药
90
100.0
97
100.0
注：趋势检验：χ2=8.453，P=0.003 6；ACE各基因型频率符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律
五、高血压患者中不同AGT基因型各生化指标比较
由表3可见，以MM、MT、TT基因型的顺序，血清中甘油三酯水平逐渐增高，体质指数也逐渐增大，各组差异有显著性(P<0.05)。血清总胆固醇水平也在逐渐升高，但差异无统计学意义。
讨 论
AGT是RAS系统中的唯一初始底物[7]，血浆中AGT水平的高低，直接影响着RAS系统活性的强弱。动物实验表明，携带有鼠AGT基因的转基因鼠，如果AGT基因过度表达就会引起鼠的高血压[12]，Jeunemaitre等[1]报道AGT基因的M235T多态性与人类原发性高血压相关联。本次调查发现，AGT基因的MM、MT、TT基因型频率在高血压和正常人群中分别为9.1%、48.1%、42.8%;12.4%、54.6%、33.0%。病例组中TT基因型的频率显著高于对照组，如果以基因型MM为参考则暴露于MT基因型的OR值是1.68，而暴露于TT基因型的OR值为3.61。可见随着等位基因T的增加，患高血压的危险性显著增加，趋势检验P<0.05。提示AGT的等位基因T可能是上海市嘉定区望新乡原发性高血压的遗传易感标记，此结果与有关报道相符[9，10，13]。
, 百拇医药
表3 不同AGT基因型的高血压患者各生化指标比较
生化指标
AGT 基 因 型
MM
MT
TT
P值
血清总胆固醇(mmol/L)
3.86±0.99
4.32±0.66
4.59±0.77
>0.05
, 百拇医药
甘油三酯(mmol/L)
0.93±0.35
1.52±0.73
1.82±0.68
<0.05
高密度脂蛋白(mmol/L)
1.61±0.43
1.71±0.34
1.60±0.45
>0.05
低密度脂蛋白(mmol/L)
, http://www.100md.com 1.83±0.73
1.90±0.57
2.16±0.97
>0.05
血糖(mmol/L)
5.02±1.03
4.79±1.08
5.19±1.40
>0.05
体质指数(kg/m2)
23.18±0.01
23.20±3.01
, http://www.100md.com
25.23±3.47
<0.05
作者单位：刘静波(上海医科大学公共卫生学院预防医学研究所 200032)
张幼辰(上海医科大学公共卫生学院预防医学研究所 200032)
俞顺章(上海医科大学公共卫生学院预防医学研究所 200032)
参考文献
1，Jeunemaitre X, Soubrier F, Kotelevtsev Y, et al. Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen. Cell, 1992, 7∶ 169-180.
, http://www.100md.com
2，Hata A, Namikawa C, Sasaki M, et al. Angiotensinogen as a risk factor for essential hypertension in Japan. J Clin Invest, 1994, 93∶ 1285-1287.
3，Zee RYL, Lou Y, Griffiths LF, et al. Association of a polymorphism of the angiotensin converting enzyme (ACE) gene with essential hypertension. Biochem Biophys Res Commun, 1992, 184∶9-15.
4，Bennett Cl, Schrader Ap, Morris BJ. Cross-sectional analysis of MET235-THR variant of angiotensinogen gene in severe, familial hypertension . Biochem Biophys Res Commun, 1993, 197∶833-839.
, 百拇医药
5，毛换元，杨心田, 主编. 心脏病学. 北京：人民卫生出版社, 1995. 714-720.
6，孙宁玲，朱继红，张瑞军，等. 高胰岛素血症的高血压患者肾素-血管紧张素-醛固酮系统的变化. 中国循环杂志，1995, 10∶587-590.
7，Dene Hl. Restriction fragment length polymorphism for the resin gene in Dahl rats. J Hypertens, 1989, 7∶1221-1224.
8，Russ AP, Maerz W, Ruzicka V, et al. Rapid detection of the hypertension-associated Met235-Thr allele of the human angiotensinogen gene. Human Mol Gen, 1993, 2∶609-610.
, http://www.100md.com
9，Caulfield MP, Lavender M, Farrall P, et al. Linkage of the angiotensinogen to essential hypertension. N Engl Med, 1994, 330∶1629-1633.
10，Caulfield MP, Lavender N, Newell P, et al. Linkage of the angiotensinogen to essential hypertension in African Caribbeans. N Clin Invest, 1995, 96∶687-692.
11，刘静波，俞顺章，张幼辰，等. 利用血凝块进行ApoE基因分型的PCR-RFLP分析方法的建立. 上海医科大学学报, 1998, 4∶52-54.
12，Ohkubo H, Kawakami H, Kakehi Y, et al. Generation of transgenic mice with elevated blood pressure by introduction of the rat renin and angiotensinogen genes. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87∶5153-5157.
13，孟华, 邱长春, 朱席琳. 血管紧张素原基因调控序列多态性与原发性高血压相关性分析.中国医学科学院院报，1996, 18∶343-347., 百拇医药
摘 要 目的 探索血管紧张素原(AGT)的M235T多态性与上海市嘉定区望新乡原发性高血压的关系。方法 以人群为基础进行高血压病例-对照研究，应用PCR-RFLP技术，分析AGT的M235T多态性。结果 望新乡高血压病例组中AGT基因TT基因型频率显著高于对照组，分别为42.8%和33.0%。相对于MM基因型，暴露于TT基因型的OR值为3.61。病例组中T等位基因的频率也显著高于对照组，分别为73.89%和60.31%，随着等位基因T的增加，患高血压的危险性显著增加，趋势检验P<0.05。 病例组中体质指数按MM、MT、TT基因型的顺序依次增大，各组差异有显著性。结论 TT基因型可能是望新乡原发性高血压的易感基因型。
关键词：高血压；血管紧张素原基因
, 百拇医药
高血压是一种严重影响人类健康的世界性常见慢性疾病,是心、脑、肾等器官损伤的主要危险因素,具有明显的家族聚集倾向,遗传因素与高血压发病密切相关,一般认为原发性高血压(EH)是在遗传易感性的基础上与许多环境因素的共同作用下发生的[1-4]。肾素-血管紧张素系统(RAS)是调节血压和血容量的激素系统[5], 也是一个复杂的血压反馈系统，RAS由血管紧张素原(AGT),肾素(RESIN),血管紧张素Ⅰ,血管紧张素转化酶(ACE),血管紧张素Ⅱ(AⅡ),血管紧张素Ⅱ受体组成[6]。其中AⅡ是强有力的血管平滑肌收缩剂，通过对周围小动脉和前毛细管平滑肌的直接作用，引起血管收缩，是形成高血压的重要原因[7]。AGT是RAS系统中的唯一初始底物，血浆中AGT水平的高低，直接影响着RAS系统活性的强弱[8]，AGT基因被认为是高血压的候选基因之一，它位于人染色体Iq42-43处编码区，由5个外显子和4个内含子构成[9]，其中由于碱基的错义突变(T→C)导致了编码第235氨基酸由甲硫氨酸突变成为苏氨酸(M235T)[10]。本研究是以上海市嘉定区望新乡人群为基础的病例-对照研究，应用PCR-RFLP技术，分析AGT的M235T多态性，目的在于探索AGT的M235T多态性与望新乡原发性高血压的关系。
, 百拇医药
材料与方法
一、研究对象
1.病例组：于1997年对上海市嘉定区望新乡进行全人群高血压普查，共查出高血压患者758人，分布于望新乡的11个自然村庄中。我们以每个村庄作为一个抽样点，按该村高血压患者名单，随机抽样(男∶女=1∶1)。根据高血压患者的既往病史，排除继发性高血压，11个村庄中共抽样高血压患者90例。
2.对照组：按性别、年龄相匹配的原则，在同一村庄中，选择与高血压患者性别相同、年龄相差小于5岁的血压水平正常的人(收缩压<140 mmHg,舒张压<90 mmHg),作为对照组。
二、方法
1.流行病学调查：对所有研究对象，均按统一调查表，由经过专门培训的调查员，以面对面的方式直接进行问卷调查。调查的内容包括：性别、民族、婚姻状况、文化程度、职业、经济收入、卫生知识水平、高血压及脑卒中家族史、各种危险因素(吸烟、饮酒、饮食)暴露水平等。在调查的同时进行测量身高、体重、血压水平并空腹静脉抽血5 ml，离心分离血清，血清用于作血糖、血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白等生化指标，血凝块用于基因组DNA的抽提[11]。
, 百拇医药
2. AGT基因多态性分析：引物设计参照文献[7]设计，AGT基因的扩增引物，由上海Sangon公司合成，引物序列如下： Primer1: 5′-CAGGGTGCT
GTCCACACTGGACCCC-3′; Primer2: 5′-CCGT
TTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT-3′, PCR扩增反应总体积50 μl，反应终浓度MgCl2为2.5 mmol/L，dNTPs为100 μmmol/L，引物为1 μmmol/L，模板为3～100 ng ，Taq酶2 U。循环条件:94℃ 1 min，68℃ 1 min，72℃ 1 min。10个循环之后，按以下条件:90℃ 1 min，68℃ 1 min, 72℃ 1 min，再反应30个循环，72℃延伸10 min。反应产物用限制性内切酶TthⅢ进行酶切反应，12 h，于2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压20 V，时间3 h。然后在紫外光下检测，AGT的M235T基因扩增片段长度为165 bp，如果在第235位上存在T→C的突变，则扩增产物在限制性内切酶TthⅢ的作用下被切成两部分：141 bp和24 bp；如果第235位上没有发生突变，则扩增片段长度保持不变，由此产生两个等位基因T、M，分别形成三个基因型：TT(141 bp)、MT(141 bp和165 bp)、MM(165 bp)。
, 百拇医药
三、统计分析
所有资料均在EPI5软件中建立数据库，输入电脑，用SPSS软件分析。
结 果
一、研究对象的一般情况
本次研究对象共187例，男性95例，女性92例，病例组和对照组均为汉族人，其中原发性高血压患者90例(男47例，女43例)，正常对照97人(男48人，女49人)。病例组和对照组男女性别差异无显著性(χ2=0.770, P=0.410)，病例组平均年龄是(60.60±11.38)岁，对照组平均年龄是(56.77±16.26)岁，两组差异无显著性，说明病例和对照两组研究对象是具有可比性的。
二、研究对象的临床生化指标
病例组体质指数显著高于对照组，从各生化指标水平来看，病例组血清总胆固醇、甘油三酯显著高于对照组，而高密度脂蛋白则显著低于对照组，其他各项指标两组差异均无显著性(表1)。
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表1 高血压病例组-对照组临床生化指标
生化指标
病例组(90例)
对照组(97例)
P值
性别(男/女)
47/43
48/49
>0.05
年龄(岁)
60.60±11.38
56.77±16.26
, 百拇医药
>0.05
血清总胆固醇(mmol/L)
4.44±0.76
4.22±0.75
<0.05
甘油三酯(mmol/L)
1.65±0.72
1.40±0.71
<0.05
高密度脂蛋白(mmol/L)
1.65±0.40
1.76±0.35
, 百拇医药
<0.05
低密度脂蛋白(mmol/L)
2.03±0.82
1.83±0.70
>0.05
血糖(mmol/L)
5.02±1.26
4.74±0.85
>0.05
体质指数(kg/m2)
24.29±3.38
, 百拇医药 21.86±2.79
<0.001
三、AGT基因各基因型在原发性高血压病例组和对照组中的分布
由表2可见，AGT基因MM、MT、TT各基因型在病例组、对照组中的分布分别为9.1%、48.1%和42.8%;12.4%、54.6%和33.0%。病例组中TT基因型的频率显著高于对照组，而MM基因型频率显著低于对照组，如果以基因型MM为参考则暴露于MT基因型的OR值是1.68，而暴露于TT基因型的OR值为3.61。可见随着等位基因T的增加，患高血压的危险性显著增加，趋势检验：χ2=8.453，P<0.05。
四、AGT基因各等位基因在病例组和对照组中的分布
AGT基因的M、T两等位基因频率在病例组中分别为26.11%和73.89%；在对照组中分别为39.69% 和60.31%，可见，病例组T等位基因频率显著高于对照组，OR值为1.86，95%的可信区间是1.17～2.96(P<0.05)。
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表2 血管紧张素原(AGT)各基因型在病例组-
对照组中的分布
基因
型
病例组
对照组
OR
值
95%CI
P值
例数
频率
(%)
, 百拇医药
例数
频率
(%)
MM
5
9.1
12
12.4
1.00
MT
37
48.1
53
, 百拇医药 54.6
1.68
0.49～ 6.01
>0.05
TT
48
42.8
32
33.0
3.60
1.04～13.12
<0.05
合计
, 百拇医药
90
100.0
97
100.0
注：趋势检验：χ2=8.453，P=0.003 6；ACE各基因型频率符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律
五、高血压患者中不同AGT基因型各生化指标比较
由表3可见，以MM、MT、TT基因型的顺序，血清中甘油三酯水平逐渐增高，体质指数也逐渐增大，各组差异有显著性(P<0.05)。血清总胆固醇水平也在逐渐升高，但差异无统计学意义。
讨 论
AGT是RAS系统中的唯一初始底物[7]，血浆中AGT水平的高低，直接影响着RAS系统活性的强弱。动物实验表明，携带有鼠AGT基因的转基因鼠，如果AGT基因过度表达就会引起鼠的高血压[12]，Jeunemaitre等[1]报道AGT基因的M235T多态性与人类原发性高血压相关联。本次调查发现，AGT基因的MM、MT、TT基因型频率在高血压和正常人群中分别为9.1%、48.1%、42.8%;12.4%、54.6%、33.0%。病例组中TT基因型的频率显著高于对照组，如果以基因型MM为参考则暴露于MT基因型的OR值是1.68，而暴露于TT基因型的OR值为3.61。可见随着等位基因T的增加，患高血压的危险性显著增加，趋势检验P<0.05。提示AGT的等位基因T可能是上海市嘉定区望新乡原发性高血压的遗传易感标记，此结果与有关报道相符[9，10，13]。
, 百拇医药
表3 不同AGT基因型的高血压患者各生化指标比较
生化指标
AGT 基 因 型
MM
MT
TT
P值
血清总胆固醇(mmol/L)
3.86±0.99
4.32±0.66
4.59±0.77
>0.05
, 百拇医药
甘油三酯(mmol/L)
0.93±0.35
1.52±0.73
1.82±0.68
<0.05
高密度脂蛋白(mmol/L)
1.61±0.43
1.71±0.34
1.60±0.45
>0.05
低密度脂蛋白(mmol/L)
, http://www.100md.com 1.83±0.73
1.90±0.57
2.16±0.97
>0.05
血糖(mmol/L)
5.02±1.03
4.79±1.08
5.19±1.40
>0.05
体质指数(kg/m2)
23.18±0.01
23.20±3.01
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25.23±3.47
<0.05
作者单位：刘静波(上海医科大学公共卫生学院预防医学研究所 200032)
张幼辰(上海医科大学公共卫生学院预防医学研究所 200032)
俞顺章(上海医科大学公共卫生学院预防医学研究所 200032)
参考文献
1，Jeunemaitre X, Soubrier F, Kotelevtsev Y, et al. Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen. Cell, 1992, 7∶ 169-180.
, http://www.100md.com
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