NF-κB的活化表达与体外循环未成熟肺损伤
NF-κB的活化表达与体外循环未成熟肺损伤
李庆新 易定华 宿学家
关键词：体外循环；缺血再灌注损伤；未成熟肺；免疫组化；NF-κB
婴幼儿体外循环(cardiopulmonarybypass,CPB)后，肺部并发症是心血管外科手术后常见的并发症，可严重影响婴幼儿术后的康复。CPB时，肺动脉血流阻滞，仅靠非搏动的支气管动脉少量灌注，此时因肺脏处于高温缺血状态，当循环开放，肺血流恢复时，势必造成肺的缺血再灌注损伤。我们通过建立1月龄幼犬体外循环模型，对体外循环后未成熟肺组织氧自由基和髓过氧化物酶等指标进行观察及测定，并应用免疫组化技术检测了NF-κB活性的变化，以探讨NF-κB活化与体外循环未成熟肺损伤的关系。
1材料和方法
, http://www.100md.com
1.1材料 实验选用1月龄幼犬20只，体重约1.5～2.5kg，雌雄不拘，由本校实验动物中心提供。将动物随机分为2组，对照组和手术组。每组10只；用戊巴比妥钠30mg/kg，肌肉注射麻醉，气管切开插管，接小型动物呼吸机，行胸颈部正中切口，暴露右颈总动脉逆行插入动脉灌注管，右房插入静脉引流管，建立体外循环。将主动脉阻断60min，开放循环、再灌注60min，取标本。对照组仅开胸维持120min。
1.2方法
1.2.1组织学检测 采用硫代巴比妥酸反应法和髓过氧化酶法，分别测定肺组织丙二醛含量和髓过氧化物酶活力。
1.2.2肺组织病理学检测 ①肺含水量:以电子天平称取湿肺标本的重量，置入80℃烤箱。72h后待达恒重时称取干重，计算肺湿、干重的比值。②超微结构观察：取肺组织，常规制做透射电镜标本，进行形态学观察。③NF-κB的活性测定：应用免疫组化方法检测NF-κB活性变化。检测结果做统计学处理，建立计算机数据库，采用组间对照t检验，以P∨0.05为显著差异的界限。
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2结果
CPB组MPO和MDA的水平〔分别为(7.2±0.8)kU/kg和(140.0±5.1)μmol/L〕明显高于手术对照组〔为(2.0±0.4)kU/kg和(32.4±1.2);μmol/L〕,差异很显著(P∨0.01)。CPB组肺组织湿、干重的比值明显高于手术对照组，分别为10.9±0.8和5.4±0.4，相差也显著(P∨0.01)。对肺组织形态结构变化的超微结构观察可见，CPB组后肺间质水肿，肺泡Ⅱ型细胞内板层体大部分脱落、微绒毛消失、线粒体肿胀；而对照组肺组织的形态结构基本正常(图1，2)。NF-κB的免疫组化染色可见，CPB组肺组织巨噬细胞及血管内皮细胞的胞核及胞质内有大量棕褐色颗粒(阳性)；而实验对照组细胞核及胞质内无棕褐色颗粒(阴性)(图3,4)。
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图1CPB组II型细胞的变化(80kv×10000)
肺泡II型细胞内板层体脱落，微绒毛消失。
图2实验对照组Ⅱ型细胞的变化(80kv×10000)
肺泡II型细胞内大量板层体结构存在，胞核完整清晰。
图3CPB组NF-κB活性表达APS(1∶100)×400
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细胞核内及胞质内有大量棕褐色颗粒(阳性)
图4实验对照组NF-κB活性表达APS(1∶100)×400
细胞核内及胞质内无棕色颗粒(阴性)
3讨论
CPB后肺功能不全一直是婴幼儿心内直视手术后一个严重的临床问题。CPB介导的全身炎症可涉及各个器官，是肺损伤的关键。肺在CPB中经历了缺血、再灌注过程，可导致肺的缺血再灌注损伤，加上未成熟肺的特点，这些因素可共同造成术后未成熟肺功能不全。补体激活是CPB时血液与人工材料接触诱发炎症的始动步骤，可引起炎症“瀑布”效应，释放多种炎症介质激活中性粒细胞、血小板在肺内聚集〔1-3〕。再灌注时，活化的中性粒细胞可释放弹性蛋白酶，产生大量氧自由基而破坏肺泡上皮和血管内皮〔4-6〕，导致血管通透性增高，肺间质水肿。未成熟的肺血管内皮细胞缺乏完整的连接和突触，细胞表面附着大量的阴离子集团可导致肺血管内皮通透性增高〔7〕。婴幼儿肺组织疏松，肺泡表面活性物质的合成、分泌及储备较少〔8〕。CPB后上述因素可使未成熟肺肺水肿、肺不张，而导致肺功能不全。本研究发现，从形态学上可见CPB后肺组织间质水肿、白细胞浸润严重。超微结构观察发现，内皮细胞肿胀、空泡化，部分胞浆溶解。且白细胞的浸润与肺组织的损伤程度相一致。
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MPO是白细胞浸润的敏感标志〔9〕，它的升高表明白细胞在肺内浸润程度增加，并释放氧自由基，引起MDA升高，而氧自由基又可使血管内皮细胞损伤，血管通透性升高，导致白细胞浸润进一步增加。NF-κB是一类能与多种基因启动子部位中κB位点特异性结合并促进转录的蛋白质的总称。研究表明,多种炎症介质基因的启动子和增强子中存在1个或多个κB序列，如TNF，IL-1，IL、6，IL-8，IL-2和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，内皮细胞白细胞粘附分子-1(ELAM-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)等。活化的NF-κB可单独或与其它转录因子协同，参与上述介质基因的诱导表达。现已明确，这些介质在肺急性炎症的发病中具有重要的作用。因此，早期应用抑制NF-кB活化的物质，对控制ARDS等全身急性炎症反应过程中炎症介质的失控性释放，改善病情和预后，可能有所帮助。
我们采用免疫组化的技术，研究了CPB后肺组织NF-кB活性的变化。发现CPB组肺巨噬细胞及肺组织内NF-кB的活性明显增强，表明NF-кB的活化与CPB肺损伤有关。NF-кB活化在CPB肺损伤中的作用可能为：CPB时补体激活，产生前炎因子TNF-α，激活NF-кB。活化的NF-кB可促进炎症因子的过度表达，导致最初炎症信号的进一步扩大，从而损伤肺组织。至于抑制NF-кB的活化是否有助于减轻CPB未成熟肺损伤，尚待进一步研究。
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作者简介：李庆新，男，33岁，主治医师,硕士
李庆新(兰州军区兰州总医院胸心外科，甘肃 兰州 730050)
易定华(第四军医大学西京医院心血管外科中心)
宿学家(第四军医大学西京医院心血管外科中心)
参考文献:
[1]Plunkett JJ,Reeves JD,Ngo L,et al.Inflammatory cascade-a final common pathway for perioperative injury[J].Anesthesiology,1996;85:957-960.
[2]Haeffner-Cavaillon N,Roussellier N,Ponzio O,et al.Induction of interleukin-1 production in patients urdergoing cardiopulmonary bypass[J].Thorac Cardiovase Surg,1989;98(6):1100-1106.
, http://www.100md.com
[3]Marks JD,Marks CB,Luce JM,et al.Plasma tumor necrosis factor in patients with septic shock[J].Am Rev Respir Dis,1990;141:94-97.
[4]Weiss SJ.Tissue destruction by neutrophils[J].N Eng I J Med,1989;320:365-376.
[5]Schmid RA,Yamashita M,Ando K.Lidocaine redules reperfusion injury and neutrophil migration in canine lung allografts[J].Ann Theorac Surg,1996;61:949-955.
[6]Eppinger MJ,Jones ML,Deeb GM,et al.Pattern of injury and the role of neutrophils in reperfusion injury of rat lung[J].J Surg Res,1995;58:713-718.
, 百拇医药
[7]Mills AN,Howorth SG.Greater permeability of the neonatal lung[J].J Thorac Cordiovasc Surg,1991;101:909-916.
[8]Dong SH.Preliminary clinical trial of a Chinese calf lung surfactant[J].Appl Cardiopulm Pathophysiol,1995;(Suppl.l3):28-37.
[9]Fagmonville ME,Pincemail J,Duchatean J,et al.Myelperoixidase and elastase as markers of leukocyte activation during cardiopulmonary bypass in humans[J].J Thorac Cardiovase Surg,1991;102:309-317., http://www.100md.com
李庆新 易定华 宿学家
关键词：体外循环；缺血再灌注损伤；未成熟肺；免疫组化；NF-κB
婴幼儿体外循环(cardiopulmonarybypass,CPB)后，肺部并发症是心血管外科手术后常见的并发症，可严重影响婴幼儿术后的康复。CPB时，肺动脉血流阻滞，仅靠非搏动的支气管动脉少量灌注，此时因肺脏处于高温缺血状态，当循环开放，肺血流恢复时，势必造成肺的缺血再灌注损伤。我们通过建立1月龄幼犬体外循环模型，对体外循环后未成熟肺组织氧自由基和髓过氧化物酶等指标进行观察及测定，并应用免疫组化技术检测了NF-κB活性的变化，以探讨NF-κB活化与体外循环未成熟肺损伤的关系。
1材料和方法
, http://www.100md.com
1.1材料 实验选用1月龄幼犬20只，体重约1.5～2.5kg，雌雄不拘，由本校实验动物中心提供。将动物随机分为2组，对照组和手术组。每组10只；用戊巴比妥钠30mg/kg，肌肉注射麻醉，气管切开插管，接小型动物呼吸机，行胸颈部正中切口，暴露右颈总动脉逆行插入动脉灌注管，右房插入静脉引流管，建立体外循环。将主动脉阻断60min，开放循环、再灌注60min，取标本。对照组仅开胸维持120min。
1.2方法
1.2.1组织学检测 采用硫代巴比妥酸反应法和髓过氧化酶法，分别测定肺组织丙二醛含量和髓过氧化物酶活力。
1.2.2肺组织病理学检测 ①肺含水量:以电子天平称取湿肺标本的重量，置入80℃烤箱。72h后待达恒重时称取干重，计算肺湿、干重的比值。②超微结构观察：取肺组织，常规制做透射电镜标本，进行形态学观察。③NF-κB的活性测定：应用免疫组化方法检测NF-κB活性变化。检测结果做统计学处理，建立计算机数据库，采用组间对照t检验，以P∨0.05为显著差异的界限。
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2结果
CPB组MPO和MDA的水平〔分别为(7.2±0.8)kU/kg和(140.0±5.1)μmol/L〕明显高于手术对照组〔为(2.0±0.4)kU/kg和(32.4±1.2);μmol/L〕,差异很显著(P∨0.01)。CPB组肺组织湿、干重的比值明显高于手术对照组，分别为10.9±0.8和5.4±0.4，相差也显著(P∨0.01)。对肺组织形态结构变化的超微结构观察可见，CPB组后肺间质水肿，肺泡Ⅱ型细胞内板层体大部分脱落、微绒毛消失、线粒体肿胀；而对照组肺组织的形态结构基本正常(图1，2)。NF-κB的免疫组化染色可见，CPB组肺组织巨噬细胞及血管内皮细胞的胞核及胞质内有大量棕褐色颗粒(阳性)；而实验对照组细胞核及胞质内无棕褐色颗粒(阴性)(图3,4)。
, 百拇医药
图1CPB组II型细胞的变化(80kv×10000)
肺泡II型细胞内板层体脱落，微绒毛消失。
图2实验对照组Ⅱ型细胞的变化(80kv×10000)
肺泡II型细胞内大量板层体结构存在，胞核完整清晰。
图3CPB组NF-κB活性表达APS(1∶100)×400
, 百拇医药
细胞核内及胞质内有大量棕褐色颗粒(阳性)
图4实验对照组NF-κB活性表达APS(1∶100)×400
细胞核内及胞质内无棕色颗粒(阴性)
3讨论
CPB后肺功能不全一直是婴幼儿心内直视手术后一个严重的临床问题。CPB介导的全身炎症可涉及各个器官，是肺损伤的关键。肺在CPB中经历了缺血、再灌注过程，可导致肺的缺血再灌注损伤，加上未成熟肺的特点，这些因素可共同造成术后未成熟肺功能不全。补体激活是CPB时血液与人工材料接触诱发炎症的始动步骤，可引起炎症“瀑布”效应，释放多种炎症介质激活中性粒细胞、血小板在肺内聚集〔1-3〕。再灌注时，活化的中性粒细胞可释放弹性蛋白酶，产生大量氧自由基而破坏肺泡上皮和血管内皮〔4-6〕，导致血管通透性增高，肺间质水肿。未成熟的肺血管内皮细胞缺乏完整的连接和突触，细胞表面附着大量的阴离子集团可导致肺血管内皮通透性增高〔7〕。婴幼儿肺组织疏松，肺泡表面活性物质的合成、分泌及储备较少〔8〕。CPB后上述因素可使未成熟肺肺水肿、肺不张，而导致肺功能不全。本研究发现，从形态学上可见CPB后肺组织间质水肿、白细胞浸润严重。超微结构观察发现，内皮细胞肿胀、空泡化，部分胞浆溶解。且白细胞的浸润与肺组织的损伤程度相一致。
, 百拇医药
MPO是白细胞浸润的敏感标志〔9〕，它的升高表明白细胞在肺内浸润程度增加，并释放氧自由基，引起MDA升高，而氧自由基又可使血管内皮细胞损伤，血管通透性升高，导致白细胞浸润进一步增加。NF-κB是一类能与多种基因启动子部位中κB位点特异性结合并促进转录的蛋白质的总称。研究表明,多种炎症介质基因的启动子和增强子中存在1个或多个κB序列，如TNF，IL-1，IL、6，IL-8，IL-2和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，内皮细胞白细胞粘附分子-1(ELAM-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)等。活化的NF-κB可单独或与其它转录因子协同，参与上述介质基因的诱导表达。现已明确，这些介质在肺急性炎症的发病中具有重要的作用。因此，早期应用抑制NF-кB活化的物质，对控制ARDS等全身急性炎症反应过程中炎症介质的失控性释放，改善病情和预后，可能有所帮助。
我们采用免疫组化的技术，研究了CPB后肺组织NF-кB活性的变化。发现CPB组肺巨噬细胞及肺组织内NF-кB的活性明显增强，表明NF-кB的活化与CPB肺损伤有关。NF-кB活化在CPB肺损伤中的作用可能为：CPB时补体激活，产生前炎因子TNF-α，激活NF-кB。活化的NF-кB可促进炎症因子的过度表达，导致最初炎症信号的进一步扩大，从而损伤肺组织。至于抑制NF-кB的活化是否有助于减轻CPB未成熟肺损伤，尚待进一步研究。
, 百拇医药
作者简介：李庆新，男，33岁，主治医师,硕士
李庆新(兰州军区兰州总医院胸心外科，甘肃 兰州 730050)
易定华(第四军医大学西京医院心血管外科中心)
宿学家(第四军医大学西京医院心血管外科中心)
参考文献:
[1]Plunkett JJ,Reeves JD,Ngo L,et al.Inflammatory cascade-a final common pathway for perioperative injury[J].Anesthesiology,1996;85:957-960.
[2]Haeffner-Cavaillon N,Roussellier N,Ponzio O,et al.Induction of interleukin-1 production in patients urdergoing cardiopulmonary bypass[J].Thorac Cardiovase Surg,1989;98(6):1100-1106.
, http://www.100md.com
[3]Marks JD,Marks CB,Luce JM,et al.Plasma tumor necrosis factor in patients with septic shock[J].Am Rev Respir Dis,1990;141:94-97.
[4]Weiss SJ.Tissue destruction by neutrophils[J].N Eng I J Med,1989;320:365-376.
[5]Schmid RA,Yamashita M,Ando K.Lidocaine redules reperfusion injury and neutrophil migration in canine lung allografts[J].Ann Theorac Surg,1996;61:949-955.
[6]Eppinger MJ,Jones ML,Deeb GM,et al.Pattern of injury and the role of neutrophils in reperfusion injury of rat lung[J].J Surg Res,1995;58:713-718.
, 百拇医药
[7]Mills AN,Howorth SG.Greater permeability of the neonatal lung[J].J Thorac Cordiovasc Surg,1991;101:909-916.
[8]Dong SH.Preliminary clinical trial of a Chinese calf lung surfactant[J].Appl Cardiopulm Pathophysiol,1995;(Suppl.l3):28-37.
[9]Fagmonville ME,Pincemail J,Duchatean J,et al.Myelperoixidase and elastase as markers of leukocyte activation during cardiopulmonary bypass in humans[J].J Thorac Cardiovase Surg,1991;102:309-317., http://www.100md.com