聚合酶链反应在病毒性视网膜炎诊断中的应用
聚合酶链反应在病毒性视网膜炎诊断中的应用
杨阳 袁援生
关键词：聚合酶链反应；单纯疱疹病毒；巨细胞病毒；视网膜炎
聚合酶链反应(PCR)是在引物介导及酶促作用下，在体外连续扩增特定基因的分子生物学技术。PCR技术是由美国Cefus公司人类遗传学部的Sairi于1985年研究成功的，并在以后短短几年内迅速发展，被广泛用于医学基础研究和临床诊断。本文就该技术的原理、特点及其在病毒性视网膜炎的诊断中的应用、存在问题作一综述。
1 PCR在病毒性视网膜炎诊断中的应用
1.1 巨细胞病毒性视网膜炎的诊断 巨细胞病毒是一种疱疹病毒，在世界各地广泛分布，人群中感染率较高，在美国80%～85%成人40a前受过该病毒感染，特别在新生儿及免疫力低下者2种特定人群中易受病毒感染，发生病毒感染性眼病，导致视力下降。在爱滋病(AIDS)患者中，有1/3患者发生巨细胞病毒性视网膜炎[1]。因此早期诊断巨细胞病毒视网膜炎有着十分重要的临床意义。常规的实验方法如病毒培养、血清学诊断有其特点：培养出巨细胞病毒比较困难，耗时费力。
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巨细胞病毒性视网膜炎的诊断通常根据临床体征：有较多的色素性角膜后沉着物(KP)、前房内浮游细胞、虹膜后粘连及玻璃体炎性混浊等。临床上一些非典型的临床症状增加诊断难度。Silverstein等[2]报告1例有上述临床症状的老年性患者，将其玻璃体抽取液进行PCR检测分析，玻璃体样本中包含巨细胞病毒DNA，而没有单疱病毒Ⅰ型、Ⅱ型DNA及水痘带状疱疹病毒DNA，因而确诊为巨细胞病毒DNA为阳性，从而支持巨细胞病毒可能是急性视网膜坏死综合征的病原体这一学说。
McCann等[1]应用PCR为基础的检测方法鉴定玻璃体样本里的巨细胞病毒DNA。在19例未接受过任何治疗的巨细胞病毒性视网膜炎患者中，从他们的玻璃体中用PCR检测巨细胞病毒DNA18例。而从40例曾进行过治疗的巨细胞病毒视网膜炎患者的玻璃体中检出巨细胞病毒DNA19例，另外69例，临床上没有诊断为巨细胞病毒性视网膜炎的患者中没有1例检出巨细胞病毒DNA。以上报道这一检测方法对巨细胞病毒性视网膜炎未治疗组的敏感性为95%；曾经进行过治疗的检测敏感性为48%.因此，可证实PCR检测技术对未经治疗的巨细胞病毒性视网膜炎是一种敏感的、特异性强的实验诊断方法，值得推广。
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1.2 单纯疱疹病毒性视网膜炎的诊断 单纯疱疹病毒分Ⅰ型(HSV-Ⅰ)、Ⅱ型(HSV-Ⅱ)。Ⅰ型在儿童和成人中通过直接接触传染。原发性感染比复发性感染更严重。而后者通常较轻并更多见。病毒潜伏在神经节内，直至身体抵抗力下降或精神创伤等诱发。HSV-Ⅰ型可被传播到新生儿导致全身性感染和脉络膜视网膜炎[3]，并可引起严重的脑炎，伴有视网膜脱离。有报道[4]证实，98%的单纯疱疹病毒性脑炎患者的眼内液中用PCR法可检测出单纯疱疹病毒DNA。Knox等[5]对38例病毒性视网膜炎行PCR检测，检出6例单纯疱疹病毒DNA，其中5例有病毒性脑炎。HSV-Ⅱ通过直接接触传染导致眼部侵害，包括结膜炎、角膜炎、眼肌麻痹和视网膜炎。患者可出现视网膜出血、棉绒斑、坏死性视网膜炎、血管炎、视网膜脱离或视神经炎等。AIDS病人免疫力受到破坏时，更易受病毒的感染[6]。
PCR检测单纯疱疹病毒是Ⅰ型还是Ⅱ型感染，可用限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切[5]，从而判断为哪一型的病毒。
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1.3 带状疱疹病毒性视网膜炎的诊断[8-10] 带状疱疹病毒可引起2种疾病，一种发生于儿童水痘，为原发感染；另一种发生于成人的带状疱疹。原发感染后又在该病毒感觉神经节中潜伏下来，在机体免疫力下降时可被激活引起带状疱疹。水痘——带状疱疹性视网膜炎，表现为进行性的急性视网膜坏死综合征，是AIDS病患者致盲最常见的第二位原因[9]，需进行及时的静脉内和玻璃体腔内抗病毒治疗。因病情发展迅速，准确、迅速的病因诊断是至关重要的[11，12]。尽管多数情况水痘、带状疱疹性视网膜炎可依靠检眼镜检查来诊断，但在一些病例早期，区别是巨细胞病毒感染还是眼弓形体病较为因难。常规的实验室检查对这些病例很难得出有价值的诊断。因水痘带状疱疹病毒难以从眼部标本中培养出来，一种测量与病毒有关的抗体滴度升高的实验室检查方法，阳性率仅20%，并且要数周后才变为阳性[13]。有几种技术是测量局部的特异性抗体[14]。房水和玻璃体的样本用于检测没有免疫抑制的病人，其敏感性减至50%[15]。另一些方法如直接培养活检、玻璃体DNA杂交等[16，17]，对身体有侵害性，并且耗时。
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以PCR替代常规的实验室方法，成为一种诊断眼部病毒感染很有价值的方法[18-21]。Short等[7]用PCR 检测14例AIDS同时伴有进行性视网膜坏死综合征的患者，从他们玻璃体中检出水痘带状疱疹病毒者11例。75例对照组具有免疫活性的玻璃体视网膜疾患的病人中仅2例检出水痘——带状疱疹病毒DNA；另一对照组85例，没有急性视网膜坏死综合征但有玻璃体视网膜感染疾患的AIDS病人，仅检出2例。水痘带状疱疹病毒DNA被检出在163个对照组样本中仅检出4例；揭示这一检测的特异性超过97%.
1.4 诊断不明病因的病毒性视网膜炎 Knox等[6]对37例(38只眼)急性视网膜炎患者的玻璃体活检标本进行PCR检测，检测结果与临床诊断是一致的。24例病人玻璃体中检出巨细胞病毒DNA10例(11只眼)，其中9例在长期临床随访中被诊断为AIDS病，可见巨细胞病毒性视网膜炎是AIDS病人常见的眼部并发症；从8例病人玻璃体中检出水痘带状疱疹病毒DNA，其中7名成年患者最终诊断为急性视网膜坏死综合征；6例病人玻璃体中检出单纯疱疹病毒DNA，5例先前或随后继发病毒性脑炎；13例没有检出病毒DNA的病人，最终诊断为弓形体病、梅毒、Bechect病、真菌性眼内炎或特异性的感染。由此可见应用玻璃体样本行PCR为基础的实验检测，对于感染性视网膜炎的鉴别诊断有着很重要的价值。
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2 PCR检测存在的局限性
PCR 用于诊断病毒性视网膜炎有一定的局限性。由于检测的高度敏感性，污染问题可能存在[2]。当血-眼屏障被破坏时，潜伏的单纯疱疹病毒可存在于眼内并被检出，有报道从相同眼的房水和玻璃体中检出不同的病毒[21]。影响检测敏感性的另一因素为抗病毒治疗[1]，经抗病毒治疗后的PCR检测，其敏感性将下降。再者，取材不方便及样本要求冰冻在很低温度保存直到检测时，而一般实验室难有此条件。目前检测本身没有标准化，检测费用昂贵(每次250～500美元)。还有是此项检查不能鉴别病毒是活动期还是潜伏期[4]。
3 小结
PCR作为一种现代分子生物学技术被用于病毒性视网膜炎的诊断，是一种较为先进、实用的实验室检查手段。因此项技术操作快速、简便、灵敏度高、特异性强，只需从患者的玻璃体腔、前后房、视网膜下间隙等处抽取少量样本即可进行PCR检测，可较准确地鉴别出是巨细胞病毒感染，还是水痘——带状疱疹病毒或单纯疱疹病毒感染引起的视网膜病变。病毒为专性细胞内寄生物，以细胞-细胞为基础进行增殖，病毒感染造成组织严重的、不可逆损害。因此早期诊断出病毒感染的类型，便于早期及时、准确的抗病毒治疗。PCR检测为临床诊断病毒性视网膜炎提供了很有价值的辅助诊断，值得临床推广应用。然而，PCR技术可能因样本或引物的污染、抗病毒药的使用等因素，影响其敏感性和特异性，并且测量本身目前还存在未标准化、费用昂贵、取材不便等局限性。因此，还须不断努力探索和不断完善此项技术，更好的为临床提供有价值的诊断方法。
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作者单位：杨阳(云南省昆明市延安医院眼科 650051)
袁援生(云南省昆明市延安医院眼科 650051)
参考文献
1，McCann JD,Margolis TP,Wong MG,et al.A sensitive and specific polymerase chain reaction-based assay for the diagnosis of cytomegalovirus retinitis [J].Am J Ophthalmol 1995;120∶219-226.
2，Silverstein BE,Conrad DK,Maargolis TP,et al.Gytomegalovirus associated acute retinal necrosis syndrome [J]. Am J Ophthalmol 1997;123∶257-258.
, 百拇医药
3，Lewis ML,Culbertson WW,Post JD,et al.Herpes simplex virus type 1∶a cause of the acute retinal necrosis syndrome [J].Ophthalmology 1989;96∶875-878.
4，Morse LS,Mizoguchi M.The diagnosis and treatment of viral retinitis[J].Seminars Ophthalmol 1995;10(1)∶28-41.
5，Knox CM,Chander D,Short GA,et al.Polymerase chain reaction-based assays of vitreous sample for the diagnosis of viral retinitis[J].Ophthalmology 1998;105∶37-45.
, http://www.100md.com
6，Engatorm RE,Holland GN,Margolis TP,et al.The progressive outer retinal necrosis syndrome∶a variant of necrotizing herpetic retinopathy in patients with AIDS[J].Ophthalmology 1994;101∶1488-1502.
7，Short GA,Maargolis TP,Kuppermann BD,et al.A polymerase chain reaction-based assay for the diagnosis of varicella-zoster virus retinitis in patients with AIDS[J].Am J Ophthalmol 1997;123∶157-164.
8，Nishi M,Hanashiro R,Mori S,et al,Rolymerase chain reaction for the detection of the varicella-zoster genome in ocular samples from patients with acute retinal necrosis [J].Am J Ophthalmol 1992;114∶603-609.
, 百拇医药
9，Margolis TP,Lowder CY，Holiand GN,et al.Varicella-zoster virus retinitis in patients with the acquired immunodeficiency syndrome [J].Am J Ophthalmol 1991;112∶119-131.
10，Pavan-Langston D,Yamamoto S,Dunkel EC.Delayed herpes zoster pseudodendrites[J].Arch Ophthalmol 1995;113∶1381-1385.
11，Kuppermann BD,Quicenl JI,Wiley C,et al.Clinical and histopathologic study of varicella zoster virus retinitis in patients with the acquired immunodeficiency syndrome[J].Am J Ophthalmol 1994;118∶589-600.
, http://www.100md.com
12，Morley MG,Duker JS,Zacks C.Successful treatment of rapidly progressive outer retinal necrosis in the acquired immunodeficiency syndrome[J].Am J Ophthalmol 1994;117∶263-265.
13，Pepose JS,Flowers B,Stewart JA,et al.Herpesvirus antibody levels in the etiologic diagnosis of the acute retinal necrosis syndrome[J].Am J Ophthalmol 1992;113∶248-256.
14，De Boer JH,Luyendijk L,Rothova A,et al.Detection of intraocu-lar antibody production to herpesviruses in acute retinal necrosis syndrome[J].Am J Ophthalmol 1994;117∶201-210.
, 百拇医药
15，De Boer JH,Verhagen C,Bruinenberg M,et al.Serologic and polymerase chain reaction analysis of intraocular fluids in the diagnosis of infectious uveitis[J].Am J Ophthalmol 1996;121∶650-658.
16，Rummelt V,Wenkel H,Rummelt C,et al.Detection of varicella zoster viris DNA and viral antigen in the late stage of bilateral acute retinal necrosis syndrome [J].Arch Ophthalmol 1992;110∶1132-1136.
17，Freeman WL,Wiley CA,Gros IG,et al.Endoretinal biopsy in immumosuppressed and healthy patients with retinitis∶indications utility and techniques [J].Ophthalmology 1989;96∶1559-1565.
, 百拇医药
18，Rrtzen AR,Ortega-Larrocea G,Dugel PU,et al.Cliniopathologic study of retinal and choroidal biopsies in intraocular inflammation[J].Am J Ophthalmol 1995;119∶597-611.
19，Kowalski RP,Gordon YJ,Ronamowski EG,et al.A comparison of enzyme immunoassay and polymerase chain reaction with the clinical examination for diagnosing ocular herpetic disease [J].Ophthalmology 1993;100∶530-533.
20，Fox GM,Crorse CA,Chuang EL,et al.Detection of herpesvirus DNA in vitreous and aqueous Specimens by the polymerase chain reaction[J].Arch Ophthalmol 1991;109∶266-271.
21，Mitchel SM,Fox JD.Aqueous and vitreous humor samples for the diagnosis of cytomegalovirus retinitis[J].Am J Ophthalmol 1995;120∶252., 百拇医药
杨阳 袁援生
关键词：聚合酶链反应；单纯疱疹病毒；巨细胞病毒；视网膜炎
聚合酶链反应(PCR)是在引物介导及酶促作用下，在体外连续扩增特定基因的分子生物学技术。PCR技术是由美国Cefus公司人类遗传学部的Sairi于1985年研究成功的，并在以后短短几年内迅速发展，被广泛用于医学基础研究和临床诊断。本文就该技术的原理、特点及其在病毒性视网膜炎的诊断中的应用、存在问题作一综述。
1 PCR在病毒性视网膜炎诊断中的应用
1.1 巨细胞病毒性视网膜炎的诊断 巨细胞病毒是一种疱疹病毒，在世界各地广泛分布，人群中感染率较高，在美国80%～85%成人40a前受过该病毒感染，特别在新生儿及免疫力低下者2种特定人群中易受病毒感染，发生病毒感染性眼病，导致视力下降。在爱滋病(AIDS)患者中，有1/3患者发生巨细胞病毒性视网膜炎[1]。因此早期诊断巨细胞病毒视网膜炎有着十分重要的临床意义。常规的实验方法如病毒培养、血清学诊断有其特点：培养出巨细胞病毒比较困难，耗时费力。
, http://www.100md.com
巨细胞病毒性视网膜炎的诊断通常根据临床体征：有较多的色素性角膜后沉着物(KP)、前房内浮游细胞、虹膜后粘连及玻璃体炎性混浊等。临床上一些非典型的临床症状增加诊断难度。Silverstein等[2]报告1例有上述临床症状的老年性患者，将其玻璃体抽取液进行PCR检测分析，玻璃体样本中包含巨细胞病毒DNA，而没有单疱病毒Ⅰ型、Ⅱ型DNA及水痘带状疱疹病毒DNA，因而确诊为巨细胞病毒DNA为阳性，从而支持巨细胞病毒可能是急性视网膜坏死综合征的病原体这一学说。
McCann等[1]应用PCR为基础的检测方法鉴定玻璃体样本里的巨细胞病毒DNA。在19例未接受过任何治疗的巨细胞病毒性视网膜炎患者中，从他们的玻璃体中用PCR检测巨细胞病毒DNA18例。而从40例曾进行过治疗的巨细胞病毒视网膜炎患者的玻璃体中检出巨细胞病毒DNA19例，另外69例，临床上没有诊断为巨细胞病毒性视网膜炎的患者中没有1例检出巨细胞病毒DNA。以上报道这一检测方法对巨细胞病毒性视网膜炎未治疗组的敏感性为95%；曾经进行过治疗的检测敏感性为48%.因此，可证实PCR检测技术对未经治疗的巨细胞病毒性视网膜炎是一种敏感的、特异性强的实验诊断方法，值得推广。
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1.2 单纯疱疹病毒性视网膜炎的诊断 单纯疱疹病毒分Ⅰ型(HSV-Ⅰ)、Ⅱ型(HSV-Ⅱ)。Ⅰ型在儿童和成人中通过直接接触传染。原发性感染比复发性感染更严重。而后者通常较轻并更多见。病毒潜伏在神经节内，直至身体抵抗力下降或精神创伤等诱发。HSV-Ⅰ型可被传播到新生儿导致全身性感染和脉络膜视网膜炎[3]，并可引起严重的脑炎，伴有视网膜脱离。有报道[4]证实，98%的单纯疱疹病毒性脑炎患者的眼内液中用PCR法可检测出单纯疱疹病毒DNA。Knox等[5]对38例病毒性视网膜炎行PCR检测，检出6例单纯疱疹病毒DNA，其中5例有病毒性脑炎。HSV-Ⅱ通过直接接触传染导致眼部侵害，包括结膜炎、角膜炎、眼肌麻痹和视网膜炎。患者可出现视网膜出血、棉绒斑、坏死性视网膜炎、血管炎、视网膜脱离或视神经炎等。AIDS病人免疫力受到破坏时，更易受病毒的感染[6]。
PCR检测单纯疱疹病毒是Ⅰ型还是Ⅱ型感染，可用限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切[5]，从而判断为哪一型的病毒。
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1.3 带状疱疹病毒性视网膜炎的诊断[8-10] 带状疱疹病毒可引起2种疾病，一种发生于儿童水痘，为原发感染；另一种发生于成人的带状疱疹。原发感染后又在该病毒感觉神经节中潜伏下来，在机体免疫力下降时可被激活引起带状疱疹。水痘——带状疱疹性视网膜炎，表现为进行性的急性视网膜坏死综合征，是AIDS病患者致盲最常见的第二位原因[9]，需进行及时的静脉内和玻璃体腔内抗病毒治疗。因病情发展迅速，准确、迅速的病因诊断是至关重要的[11，12]。尽管多数情况水痘、带状疱疹性视网膜炎可依靠检眼镜检查来诊断，但在一些病例早期，区别是巨细胞病毒感染还是眼弓形体病较为因难。常规的实验室检查对这些病例很难得出有价值的诊断。因水痘带状疱疹病毒难以从眼部标本中培养出来，一种测量与病毒有关的抗体滴度升高的实验室检查方法，阳性率仅20%，并且要数周后才变为阳性[13]。有几种技术是测量局部的特异性抗体[14]。房水和玻璃体的样本用于检测没有免疫抑制的病人，其敏感性减至50%[15]。另一些方法如直接培养活检、玻璃体DNA杂交等[16，17]，对身体有侵害性，并且耗时。
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以PCR替代常规的实验室方法，成为一种诊断眼部病毒感染很有价值的方法[18-21]。Short等[7]用PCR 检测14例AIDS同时伴有进行性视网膜坏死综合征的患者，从他们玻璃体中检出水痘带状疱疹病毒者11例。75例对照组具有免疫活性的玻璃体视网膜疾患的病人中仅2例检出水痘——带状疱疹病毒DNA；另一对照组85例，没有急性视网膜坏死综合征但有玻璃体视网膜感染疾患的AIDS病人，仅检出2例。水痘带状疱疹病毒DNA被检出在163个对照组样本中仅检出4例；揭示这一检测的特异性超过97%.
1.4 诊断不明病因的病毒性视网膜炎 Knox等[6]对37例(38只眼)急性视网膜炎患者的玻璃体活检标本进行PCR检测，检测结果与临床诊断是一致的。24例病人玻璃体中检出巨细胞病毒DNA10例(11只眼)，其中9例在长期临床随访中被诊断为AIDS病，可见巨细胞病毒性视网膜炎是AIDS病人常见的眼部并发症；从8例病人玻璃体中检出水痘带状疱疹病毒DNA，其中7名成年患者最终诊断为急性视网膜坏死综合征；6例病人玻璃体中检出单纯疱疹病毒DNA，5例先前或随后继发病毒性脑炎；13例没有检出病毒DNA的病人，最终诊断为弓形体病、梅毒、Bechect病、真菌性眼内炎或特异性的感染。由此可见应用玻璃体样本行PCR为基础的实验检测，对于感染性视网膜炎的鉴别诊断有着很重要的价值。
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3 小结
PCR作为一种现代分子生物学技术被用于病毒性视网膜炎的诊断，是一种较为先进、实用的实验室检查手段。因此项技术操作快速、简便、灵敏度高、特异性强，只需从患者的玻璃体腔、前后房、视网膜下间隙等处抽取少量样本即可进行PCR检测，可较准确地鉴别出是巨细胞病毒感染，还是水痘——带状疱疹病毒或单纯疱疹病毒感染引起的视网膜病变。病毒为专性细胞内寄生物，以细胞-细胞为基础进行增殖，病毒感染造成组织严重的、不可逆损害。因此早期诊断出病毒感染的类型，便于早期及时、准确的抗病毒治疗。PCR检测为临床诊断病毒性视网膜炎提供了很有价值的辅助诊断，值得临床推广应用。然而，PCR技术可能因样本或引物的污染、抗病毒药的使用等因素，影响其敏感性和特异性，并且测量本身目前还存在未标准化、费用昂贵、取材不便等局限性。因此，还须不断努力探索和不断完善此项技术，更好的为临床提供有价值的诊断方法。
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作者单位：杨阳(云南省昆明市延安医院眼科 650051)
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参考文献
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21，Mitchel SM,Fox JD.Aqueous and vitreous humor samples for the diagnosis of cytomegalovirus retinitis[J].Am J Ophthalmol 1995;120∶252., 百拇医药