人源和猪源猪链球菌的同源性研究
人源和猪源猪链球菌的同源性研究
朱凤才 杨华富 胡晓抒 汪华 王广和 宋亚军 杨瑞馥
摘 要 目的 进一步鉴定菌种；评价人源株与猪源株猪链球菌的同源性。方法 对分离自猪无菌部位、患者血液和脑脊液的7株猪链球菌Ⅱ型和标准猪链球菌Ⅱ型，用菌体脂肪酸分析和随机引物基因扩增技术进行菌种的表现型和基因型分类。对其结果进行聚类分析和主成分分析。结果 随机引物基因扩增技术分析提示，被检的7株猪链球菌Ⅱ型与标准株一致，均为猪链球菌Ⅱ型；人源株与猪源株同源；分离自病人血液和脑脊液的菌株同源。这些结果在菌体脂肪酸分析中得到了进一步的确认。即基因型与表现型结果一致。结论 被检的7株猪链球菌Ⅱ型与标准株均同源。
关键词：猪链球菌；菌体脂肪酸；基因
, 百拇医药
1998年7月下旬至8月中旬，江苏省南通等地区发生了人和猪重症感染，导致了万余头生猪未能来得及治疗即死亡，与病、死猪密切接触者(主要是非职业性屠宰者)有25人发病，其中有14人死亡[1]。疫情发生后，从病人的血液和脑脊液，以及病、死猪的无菌部位分离到十余株链球菌。笔者用菌体脂肪酸分析和随机扩增DNA多态性分析(RAPD)技术对分离自不同地区和不同宿主的链球菌的表现型和基因型进行分析并与猪链球菌Ⅱ型标准株进行比较，以期追踪人体病原的感染来源，以及对分离菌株进一步地进行鉴定和分类，现将研究情况报告如下。
材料与方法
一、菌株来源
被测链球菌菌株有7株，编号分别为98001、98003、98005、98012、98015、98242、99001，其中98001、98005、98242、99001分离自南通海安病、死猪的内脏；98015分离自海安病人的血液，98012和98003分别分离自与海安相邻的如皋市两病人的血液和脑脊液。99001为1999年分离株，余为1998年分离株。另用猪链球菌Ⅱ型标准菌SS2(来自德国)作对照，被检7株链球菌均经API 20 Strep 生化和标准血清凝集试验，鉴定为猪链球菌血清Ⅱ型。
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二、菌体脂肪酸分析
取冷冻干燥的菌粉5 mg，加5%氢氧化钠甲醇溶液5 ml 100℃ 30 min，然后冷却至室温，加6 mol/L盐酸酸化至pH2，加14%三氟化硼甲醇溶液4 ml，用10 mol氯仿-已烷(1∶4)萃取，提取液加硫酸钠1 g，用干燥氮气吹干提取液，加正已烷100 ml，每次取2 μl提取液在美国MIDI公司SHERLOCK全自动细菌鉴定系统中进行菌体膜脂肪酸气相色谱分析。对各菌株的菌体膜脂肪酸的构成指标进行聚类分析和主成分分析。
三、随机扩增DNA多态性技术方法
1.引物：10条引物分别为OPB3, OPB8, OPB10, OPB12, OPB13, OPB14, REP1, REP2, ERIC1, ERIC2。其中OP类引物购自北京北方同正公司，ERIC和REP类引物由军事医学科学院微生物流行病研究所分子微生物实验室提供。
, 百拇医药
2.模板制备：用碘化钠裂解玻璃粉吸附法制备DNA模板。
3.扩增条件：见参考文献[2]。 引物各1 μl(50 pmol/L)，模板5 μl (约50～100 ng),PCR缓冲液3 μl，Taq DNA聚合酶2 U，dNTP(2 mmol/L)1 μl，加水至30 μl，混匀后扩增,共45次循环。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
4.结果分析:用RAPD读取数据，Phylip程序进行聚类分析，Treeview软件生成聚类图。
结 果
一、菌体脂肪酸分析
6株被测猪链球菌及标准猪链球菌Ⅱ型与菌体脂肪酸自动分析系统内置库内有关标准菌的脂肪酸成分数据的聚类和主成分分析提示：分离自海安病人血液的98015株与分离自海安病死猪的98005株为同一克隆株；98015株与同一地区分离自猪的另一株98242也非常接近；分离自如皋不同病人的血液和脑脊液的98012株与98003株为同一克隆株；1998年分离自如皋的两病人的菌株与1999年分离自海安病死猪的99001株的菌体脂肪酸构成也非常近；被测6株猪链球菌与猪链球菌Ⅱ型标准菌株一致或非常接近；而与系统库内置的牛链球菌、唾液链球菌、化脓链球菌、血链球菌、无乳链球菌、缓症链球菌和S.mutans链球菌对照相差甚远。
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二、RAPD分析
7株被检菌株与猪链球菌标准菌株SS2菌株经6条OP类引物的逐个引物扩增，以及ERIC1+ERIC2、REP1+REP2、ERIC1+REP1和ERIC1+REP2的混合扩增后，经RAPD读取数据，Phylip软件聚类分析，再由Treeview软件生成图1。由图1提示，7株被检菌株与猪链球菌Ⅱ型标准菌株的遗传距离很近，变异度小于0.1%；分离自海安病、死猪的98005株和分离自海安病人的98015株为同一克隆株，此2株与分离自海安的病死猪的98024、98001、99001三株菌的遗传距离也很近；分离自如皋病人的血液与脑脊液的98012株和98003株为同一克隆株。1999年分离自海安病死猪的99001株与1998年分离自如皋病人的2株菌的距离较近。
图1 随机扩增DNA多态性分析的聚类图
讨 论
, 百拇医药 近十余年，欧美各国相继报道重症链球菌感染病例，国内少有此类报道[3]，由猪传染给人的引起人体重症链球菌感染的主要病原是猪链球菌Ⅱ型，国外多数学者把它当作屠夫的职业病[4,5]。自1968年首次报道了猪链球菌Ⅱ型引起人体严重感染病例后， 已有数十个国家报道了此类病例，在1968～1989年间，全球有108例猪链球菌Ⅱ型所致人体感染病例[6]。但国内迄今尚未见此类人体病例报道，因此，有关猪链球菌Ⅱ型的资料较少。
由于猪链球菌Ⅱ型与其他链球菌(如血链球菌)，绝大多数的生化特征一致，使该菌的菌种鉴定相当困难，曾经一度让我们把它定为血链球菌[7] 。因此，从分子生物学角度，对该菌的表现型和基因型进行菌种的进一步确认很有必要。
我们利用菌体膜脂肪酸构成差异，进行菌体脂肪酸气相色谱分析，以期进行表现型分类。同时，设计10条引物进行随机引物PCR，以期进行基因型分类，在设计引物时，引物数远多于国外同类研究中的OPB7、OPB10、OPB17三个引物[2]。并且，在采用只有10个碱基的具有普遍性的OP类引物的同时，还设计了有22个和18个碱基的具有相对特异性的ERIC、REP类引物，这两类引物同时进行随机引物PCR，使其基因型分类更加细致，更有针对性。
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从菌体脂肪酸的聚类分析与主成分分析来看：被检的6株链球菌与猪链球菌Ⅱ型标准株一致，均为猪链球菌Ⅱ型；人源株与猪源株同源；分离自病人血液和脑脊液的菌株同源。这些结果在随机引物PCR的基因型聚类图中得到了进一步的确认，即表现型与基因型结果一致。
本文所采用的表现型与基因型分析方法，有助于对菌种进一步鉴定，有助于追踪病原体的起源、发展情况，为今后科学地防止该菌感染具有重要意义。所采用的方法对开展类似病原的研究具有借鉴价值。
作者单位：朱凤才(江苏省疾病预防控制中心，南京，210009)
杨华富(江苏省疾病预防控制中心，南京，210009)
胡晓抒(江苏省疾病预防控制中心，南京，210009)
汪华(江苏省疾病预防控制中心，南京，210009)
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王广和(海安县卫生防疫站)
宋亚军(军事医学科学院微生物流行病研究所)
杨瑞馥(军事医学科学院微生物流行病研究所)
参考文献
1，胡晓抒,朱凤才,汪华，等.人-猪链球菌感染性综合征研究.中华预防医学杂志,2000,34∶150-152.
2，Chatellier S, Gottschalk M, Higgins R，et al. Relatedness of Streptococcus suis serotype 2 isolates from different geographic origins as evaluated by molecular fingerprinting and phenotyping. J Clin Microbiol，1999， 37∶362-366.
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3，姜淑贤，尚德秋. 链球菌中毒性休克综合征和超抗原.中国公共卫生，1996，12∶92-94.
4，Robertson ID, Blackmore DK. Occupational exposure to Streptococcus suis type 2. Epidemiol Infect, 1989, 103∶157-164.
5，Leelarasamee A, Nilakul C ,Tien GS, et al. Streptococcus suis toxic-shock syndrome and meningitis. J Med Assoc Thai, 1997, 80∶63-68.
6，Dupas D, Vignon M, Streptococcus suis meningitis: A severe noncompensated occupational disease. J Occup Med, 1992, 34∶1102-1105.
7，王广和,王坚,沈艳云，等. 人、猪血液链球菌病研究报告. 中国人兽共患病杂志,1999,165∶143-145., 百拇医药
朱凤才 杨华富 胡晓抒 汪华 王广和 宋亚军 杨瑞馥
摘 要 目的 进一步鉴定菌种；评价人源株与猪源株猪链球菌的同源性。方法 对分离自猪无菌部位、患者血液和脑脊液的7株猪链球菌Ⅱ型和标准猪链球菌Ⅱ型，用菌体脂肪酸分析和随机引物基因扩增技术进行菌种的表现型和基因型分类。对其结果进行聚类分析和主成分分析。结果 随机引物基因扩增技术分析提示，被检的7株猪链球菌Ⅱ型与标准株一致，均为猪链球菌Ⅱ型；人源株与猪源株同源；分离自病人血液和脑脊液的菌株同源。这些结果在菌体脂肪酸分析中得到了进一步的确认。即基因型与表现型结果一致。结论 被检的7株猪链球菌Ⅱ型与标准株均同源。
关键词：猪链球菌；菌体脂肪酸；基因
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1998年7月下旬至8月中旬，江苏省南通等地区发生了人和猪重症感染，导致了万余头生猪未能来得及治疗即死亡，与病、死猪密切接触者(主要是非职业性屠宰者)有25人发病，其中有14人死亡[1]。疫情发生后，从病人的血液和脑脊液，以及病、死猪的无菌部位分离到十余株链球菌。笔者用菌体脂肪酸分析和随机扩增DNA多态性分析(RAPD)技术对分离自不同地区和不同宿主的链球菌的表现型和基因型进行分析并与猪链球菌Ⅱ型标准株进行比较，以期追踪人体病原的感染来源，以及对分离菌株进一步地进行鉴定和分类，现将研究情况报告如下。
材料与方法
一、菌株来源
被测链球菌菌株有7株，编号分别为98001、98003、98005、98012、98015、98242、99001，其中98001、98005、98242、99001分离自南通海安病、死猪的内脏；98015分离自海安病人的血液，98012和98003分别分离自与海安相邻的如皋市两病人的血液和脑脊液。99001为1999年分离株，余为1998年分离株。另用猪链球菌Ⅱ型标准菌SS2(来自德国)作对照，被检7株链球菌均经API 20 Strep 生化和标准血清凝集试验，鉴定为猪链球菌血清Ⅱ型。
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二、菌体脂肪酸分析
取冷冻干燥的菌粉5 mg，加5%氢氧化钠甲醇溶液5 ml 100℃ 30 min，然后冷却至室温，加6 mol/L盐酸酸化至pH2，加14%三氟化硼甲醇溶液4 ml，用10 mol氯仿-已烷(1∶4)萃取，提取液加硫酸钠1 g，用干燥氮气吹干提取液，加正已烷100 ml，每次取2 μl提取液在美国MIDI公司SHERLOCK全自动细菌鉴定系统中进行菌体膜脂肪酸气相色谱分析。对各菌株的菌体膜脂肪酸的构成指标进行聚类分析和主成分分析。
三、随机扩增DNA多态性技术方法
1.引物：10条引物分别为OPB3, OPB8, OPB10, OPB12, OPB13, OPB14, REP1, REP2, ERIC1, ERIC2。其中OP类引物购自北京北方同正公司，ERIC和REP类引物由军事医学科学院微生物流行病研究所分子微生物实验室提供。
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2.模板制备：用碘化钠裂解玻璃粉吸附法制备DNA模板。
3.扩增条件：见参考文献[2]。 引物各1 μl(50 pmol/L)，模板5 μl (约50～100 ng),PCR缓冲液3 μl，Taq DNA聚合酶2 U，dNTP(2 mmol/L)1 μl，加水至30 μl，混匀后扩增,共45次循环。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
4.结果分析:用RAPD读取数据，Phylip程序进行聚类分析，Treeview软件生成聚类图。
结 果
一、菌体脂肪酸分析
6株被测猪链球菌及标准猪链球菌Ⅱ型与菌体脂肪酸自动分析系统内置库内有关标准菌的脂肪酸成分数据的聚类和主成分分析提示：分离自海安病人血液的98015株与分离自海安病死猪的98005株为同一克隆株；98015株与同一地区分离自猪的另一株98242也非常接近；分离自如皋不同病人的血液和脑脊液的98012株与98003株为同一克隆株；1998年分离自如皋的两病人的菌株与1999年分离自海安病死猪的99001株的菌体脂肪酸构成也非常近；被测6株猪链球菌与猪链球菌Ⅱ型标准菌株一致或非常接近；而与系统库内置的牛链球菌、唾液链球菌、化脓链球菌、血链球菌、无乳链球菌、缓症链球菌和S.mutans链球菌对照相差甚远。
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二、RAPD分析
7株被检菌株与猪链球菌标准菌株SS2菌株经6条OP类引物的逐个引物扩增，以及ERIC1+ERIC2、REP1+REP2、ERIC1+REP1和ERIC1+REP2的混合扩增后，经RAPD读取数据，Phylip软件聚类分析，再由Treeview软件生成图1。由图1提示，7株被检菌株与猪链球菌Ⅱ型标准菌株的遗传距离很近，变异度小于0.1%；分离自海安病、死猪的98005株和分离自海安病人的98015株为同一克隆株，此2株与分离自海安的病死猪的98024、98001、99001三株菌的遗传距离也很近；分离自如皋病人的血液与脑脊液的98012株和98003株为同一克隆株。1999年分离自海安病死猪的99001株与1998年分离自如皋病人的2株菌的距离较近。
图1 随机扩增DNA多态性分析的聚类图
讨 论
, 百拇医药 近十余年，欧美各国相继报道重症链球菌感染病例，国内少有此类报道[3]，由猪传染给人的引起人体重症链球菌感染的主要病原是猪链球菌Ⅱ型，国外多数学者把它当作屠夫的职业病[4,5]。自1968年首次报道了猪链球菌Ⅱ型引起人体严重感染病例后， 已有数十个国家报道了此类病例，在1968～1989年间，全球有108例猪链球菌Ⅱ型所致人体感染病例[6]。但国内迄今尚未见此类人体病例报道，因此，有关猪链球菌Ⅱ型的资料较少。
由于猪链球菌Ⅱ型与其他链球菌(如血链球菌)，绝大多数的生化特征一致，使该菌的菌种鉴定相当困难，曾经一度让我们把它定为血链球菌[7] 。因此，从分子生物学角度，对该菌的表现型和基因型进行菌种的进一步确认很有必要。
我们利用菌体膜脂肪酸构成差异，进行菌体脂肪酸气相色谱分析，以期进行表现型分类。同时，设计10条引物进行随机引物PCR，以期进行基因型分类，在设计引物时，引物数远多于国外同类研究中的OPB7、OPB10、OPB17三个引物[2]。并且，在采用只有10个碱基的具有普遍性的OP类引物的同时，还设计了有22个和18个碱基的具有相对特异性的ERIC、REP类引物，这两类引物同时进行随机引物PCR，使其基因型分类更加细致，更有针对性。
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从菌体脂肪酸的聚类分析与主成分分析来看：被检的6株链球菌与猪链球菌Ⅱ型标准株一致，均为猪链球菌Ⅱ型；人源株与猪源株同源；分离自病人血液和脑脊液的菌株同源。这些结果在随机引物PCR的基因型聚类图中得到了进一步的确认，即表现型与基因型结果一致。
本文所采用的表现型与基因型分析方法，有助于对菌种进一步鉴定，有助于追踪病原体的起源、发展情况，为今后科学地防止该菌感染具有重要意义。所采用的方法对开展类似病原的研究具有借鉴价值。
作者单位：朱凤才(江苏省疾病预防控制中心，南京，210009)
杨华富(江苏省疾病预防控制中心，南京，210009)
胡晓抒(江苏省疾病预防控制中心，南京，210009)
汪华(江苏省疾病预防控制中心，南京，210009)
, http://www.100md.com
王广和(海安县卫生防疫站)
宋亚军(军事医学科学院微生物流行病研究所)
杨瑞馥(军事医学科学院微生物流行病研究所)
参考文献
1，胡晓抒,朱凤才,汪华，等.人-猪链球菌感染性综合征研究.中华预防医学杂志,2000,34∶150-152.
2，Chatellier S, Gottschalk M, Higgins R，et al. Relatedness of Streptococcus suis serotype 2 isolates from different geographic origins as evaluated by molecular fingerprinting and phenotyping. J Clin Microbiol，1999， 37∶362-366.
, http://www.100md.com
3，姜淑贤，尚德秋. 链球菌中毒性休克综合征和超抗原.中国公共卫生，1996，12∶92-94.
4，Robertson ID, Blackmore DK. Occupational exposure to Streptococcus suis type 2. Epidemiol Infect, 1989, 103∶157-164.
5，Leelarasamee A, Nilakul C ,Tien GS, et al. Streptococcus suis toxic-shock syndrome and meningitis. J Med Assoc Thai, 1997, 80∶63-68.
6，Dupas D, Vignon M, Streptococcus suis meningitis: A severe noncompensated occupational disease. J Occup Med, 1992, 34∶1102-1105.
7，王广和,王坚,沈艳云，等. 人、猪血液链球菌病研究报告. 中国人兽共患病杂志,1999,165∶143-145., 百拇医药