应用多重引物PCR技术检测O157∶H7毒力基因
应用多重引物PCR技术检测O157∶H7毒力基因
郭喜玲 史智扬 顾玲 庄菱 潘浩
摘 要 目的 对江苏省6个不同地区不同宿主动物中分离的O157∶H7菌株进行毒力基因的检测分析。 方法 应用肠出血性大肠杆菌(EHEC)的多重引物聚合酶链反应(PCR)方法，以志贺样毒素(SLT2和SLT1)基因、“粘附抹平”因子eaeA基因和溶血素(hly)基因为靶基因进行检测。 结果 江苏省分离的O157∶H7菌株毒力基因携带率为56.5%，不同地区的分离株携带率有所不同，个别地区高达90%以上，有的地区则未检测到带毒力基因的菌株，这一结果与不同地区发病率的高低有平行的关系。疾病高发地区,菌株毒力基因携带率达85.7%(36/42)，低发或散发地区为52.6%(10/19)，非流行地区为8.3%(2/24)。不同的宿主动物分离株其毒力基因携带阳性率从高到低依次为羊>牛>猪>鸡。仅有的一份兔粪便标本分离株也检出毒力基因。菌株毒力基因图谱以SLT2+eaeA+hly为主，占79.2%，其次为SLT2+SLT1+eaeA+hly和SLT2+hly，分别占16.6%和4.2%；有毒力基因的菌株均有hly和SLT2，绝大多数菌株有eaeA基因，携带SLT1的菌株则较少，这与国外一些报道有所不同。 结论 O157∶H7 毒力基因图谱是一个重要的分子流行病学标志，应用多重引物PCR方法检测O157∶H7 毒力基因，简便、快速、特异、敏感，对流行病学调查分析、制定预防和控制对策有重要的参考价值。
, http://www.100md.com
关键词：肠出血性大肠杆菌；基因；聚合酶链反应
大肠杆菌O157∶H7是肠出血性大肠杆菌(EHEC)的一种主要血清型，可引起人类腹泻、出血性结肠炎(HC)，在儿童和老年患者中易并发溶血性尿毒综合症(HUS)[1]。1982年O157∶H7大肠杆菌首次在美国引起了出血性肠炎的暴发[2]。1996年在日本发生了O157∶H7大肠杆菌的暴发流行，9 000多名儿童感染，死亡12例[3]。目前世界上许多发达国家和一部分发展中国家都发生了O157∶H7大肠杆菌的暴发流行，成为全球性的公共卫生问题。出血性大肠杆菌的致病作用主要是通过细菌对肠道上皮细胞粘附和产生毒素两个过程。其主要毒力基因有志贺样毒素(SLT1和SLT2)基因、“粘附抹平”因子eaeA基因和溶血素(hly)基因[4]。本研究应用一种能同时检测这4种基因的多重引物聚合酶链反应(MPCR)方法，对分离自江苏省6个不同地区不同宿主动物的O157∶H7菌株进行了毒力基因测定，现将结果报告如下。
, 百拇医药
材料与方法
1.参考菌株：E.coli O157∶H7 882364菌株,由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所惠赠；普通大肠杆菌ATCC25922，由本站菌种室提供。
2.试验菌株：1999年度从江苏省6个监测点分离的经生化和血清学鉴定为O157∶H7的菌株85株。
3.试剂：TaqDNA聚合酶、dNTPs、Buffer、PCR Marker等购自上海复华和华美公司。
4.引物：引物序列见表1，由上海生工生物工程公司合成。
表1 引物序列及扩增片段长度
引物
引物序列
, 百拇医药
扩增片段
长度(bp)
SLT2-F[5]
5′-CCATGACAACGGACAGCAGTT
779
SLT2-R
5′-CCTGTCAACTGAGCACTTTG
SLT1-F[5]
5′-ACACTGGATGATCTCAGTGG
614
, 百拇医药
SLT1-R
5′-CTGAATCCCCCTCCATTATG
eaeA-F[5]
5′-AAGCGACTGAGGTCACT
450
eaeA-R
5′ -ACGCTGCTCACTAGATGT
hly-F[6]
5′-CACACGGAGCTTATAATATTCTGTCA
340
, 百拇医药
hly-R
5′-AATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT
5.模板制备：将分离的菌株在普通营养琼脂上37℃培养18～24 h，刮取2～3个菌落于200 μl灭菌生理盐水中混匀，煮沸10～15 min，直接用于PCR扩增。
6.多重引物PCR方法：反应总体积为50 μl ,在0.5 ml离心管中依次加入：10×Buffer 5 μl, dNTPs(每种dNTP溶液浓度为0.2 mmol/L)4 μl，引物计8条，每条1.5 μl(10 pmol/μl)，Taq酶0.5 μl (1 U)，DEPC处理的双蒸水26.5 μl, 模板2 μl，石蜡油50 μl。以参考菌株882364作阳性对照，ATCC 25922作阴性对照，DEPC处理的双蒸水作试剂空白对照。反应程序：94℃ 7 min，变性模板DNA，然后94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸5 min。
, 百拇医药
7.PCR产物检测：PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，分子量100～1 000 bp的Marker作参照，在紫外灯下观察实验结果。结 果
1.用4对引物进行多重引物PCR反应，阳性对照882364有4种毒力基因(SLT2+SLT1+eaeA+hly)，而ATCC25922和试剂空白对照均为阴性结果。
2.不同地区分离菌株毒力基因图谱及毒力基因携带率见表2。
表2 不同地区分离菌株毒力基因图谱及
毒力基因携带率
地区类型
地
区
, http://www.100md.com
检测
数
未检
出
SLT2+
hly
SLT2+
eaeA+hly
SLT2+SLT1
+eaeA+hly
携带率
(%)
, http://www.100md.com
高发区
A
21
2
12
7
90.5
B
21
4
17
81.0
低发区
C
, 百拇医药
7
2
2
3
71.4
D
12
7
4
1
41.7
非流行区
E
11
, http://www.100md.com
9
2
18.2
F
13
13
0.0
合计
85
37
2
38
8
56.5
, 百拇医药
3.不同宿主动物分离菌株毒力基因图谱及毒力基因携带率见表3。
4.检出毒力基因的48株菌株均携带SLT2、hly毒力基因, 携带eaeA基因菌株46株,占95.8%，携带SLT1基因菌株8株,占16.6%。毒力基因图谱见表4。表3 不同宿主动物分离菌株毒力基因图谱及
毒力基因携带率
动物
种类
检测
数
未检
出
SLT2+
, 百拇医药
hly
SLT2+
eaeA+hly
SLT2+SLT1
+eaeA+hly
携带率
(%)
牛
24
11
12
1
, 百拇医药
54.2
羊
23
4
1
14
4
82.6
猪
18
10
1
5
2
, 百拇医药
44.4
鸡
19
12
6
1
36.8
兔
1
1
100.0
合计
85
37
, 百拇医药
2
38
8
56.5
讨 论
综合分析检测结果，我省分离的菌株毒力基因携带率为56.5%，不同地区的分离株携带率有所不同，个别地区高达90%以上，有的地区则未检测到带毒力基因的菌株，这一结果与不同地区发病率的高低有平行的关系。疾病高发地区,菌株毒力基因携带率达85.7%(36/42)，低发或散发地区为52.6%(10/19)，疑似或非流行地区为8.3%(2/24)。
表4 携带毒力基因菌株的毒力基因图谱
毒力基因
菌株数
, 百拇医药
构成比(%)
SLT2+hly
2
4.2
SLT2+eaeA+hly
38
79.2
SLT2+SLT1+eaeA+hly
8
16.6
合 计
, 百拇医药 48
100.0
不同的宿主动物分离株其毒力基因携带阳性率从高到低依次为羊>牛>猪>鸡。仅有的一份兔粪便标本分离株也检出毒力基因。
我省分离的菌株毒力基因图谱以SLT2+eaeA+hly为主，占79.2%，其次为SLT2+SLT1+eaeA+hly和SLT2+hly，分别占16.6%和4.2%；有毒力基因的菌株均有hly和SLT2，绝大多数菌株有eaeA基因，携带SLT1的菌株则较少，这与国外一些报道有所不同。Fagan等[7]报道澳大利亚用MPCR方法检测动物粪便中EHEC毒力基因，SLT1和hly最为多见，在检出毒力基因的标本中，SLT2 阳性率不足10%，eaeA的阳性率低于30%。其毒力基因图谱呈多样性，47.8%的标本仅检出hly基因。
, 百拇医药
虽然O157∶H7的致病机理尚未完全阐明，但其产生的毒素在疾病的发展过程中起着重要的作用。有文献报道，SLT2阳性菌株能引起更加严重的症状和组织病理学改变[8]。
O157∶H7感染已成为世界性的卫生问题，随着生物技术的不断发展，对其毒力因子的研究也在不断地深入。流行病学调查结果表明，家养动物，特别是牛、羊、猪等家畜是O157∶H7的主要贮存宿主，因此，O157∶H7感染的预防和控制应从贮存宿主的管理入手。结合简便、快速、特异、敏感的分子生物学的方法对各监测点分离的菌株进行毒力基因的检测，对流行病学调查分析、制定预防和控制疾病暴发流行的对策有重要的参考价值。
作者单位：郭喜玲(江苏省卫生防疫站，南京，210009)
史智扬(江苏省卫生防疫站，南京，210009)
顾玲(江苏省卫生防疫站，南京，210009)
, 百拇医药
庄菱(江苏省卫生防疫站，南京，210009)
潘浩(江苏省卫生防疫站，南京，210009)
参考文献
1，Neill MA, Tarr PI, Clausen CR, et al. Escherichia coli O157∶H7 as the predominant pathogen associated with the hemolytic uremic syndrome∶ a prospective study in the Pacific Northwest. Pediatrics,1987, 80∶37-40.
2，Wells JG, Davis BR, Wachsmuth IK, et al. Laboratory investigation of hemorrhagic colitis outbreaks associated with a rare Escherichia coli serotype. J Clin Microbiol, 1983,18∶512-520.
, http://www.100md.com
3，Reilly. A prevention and control of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infections: memorandum from a WHO meeting. WHO consultation on prevention and control of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infections. Bull World Health Organ, 1998,76∶245-255.
4，Boerlin P, McEwen SA, Boerlin PF, et al. Associations between virulence factors of Shiga toxin-producing Escherichia coli and disease in humans. J Clin Microbiol, 1999,37∶497-503.
, 百拇医药
5，Louie M,Read S,Simor AE, et al. Application of multiplex PCR for detection of non-O157 verocytotoxin-producing Escherichia coli in bloody stools∶ identification of serogroups O26 and O111. J Clin Microbiol, 1998, 36∶3375-3377.
6，Bonnet R, Souweine B, Gauthier G, et al. Non-O157∶H7 stx2-producing Escherichia coli strains associated with sporadic cases of hemolytic-uremic syndrome in adults. J Clin Microbiol, 1998, 36∶1777-1780.
, 百拇医药 7，Fagan PK, Hornitzky MA, Bettelheim KA, et al. Detection of shiga-like toxin (stx1 and stx2), intimin (eaeA), and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) hemolysin (EHEC hlyA) genes in animal feces by multiplex PCR. Appl Environ Microbiol, 1999, 65∶868-872.
8，Karpman D, Connell H, Svensson M, et al. The role of lipopolysaccharide and Shiga-like toxin in a mouse model of Escherichia coli O157∶H7 infection. J Infect Dis, 1997,175∶611-620., 百拇医药
郭喜玲 史智扬 顾玲 庄菱 潘浩
摘 要 目的 对江苏省6个不同地区不同宿主动物中分离的O157∶H7菌株进行毒力基因的检测分析。 方法 应用肠出血性大肠杆菌(EHEC)的多重引物聚合酶链反应(PCR)方法，以志贺样毒素(SLT2和SLT1)基因、“粘附抹平”因子eaeA基因和溶血素(hly)基因为靶基因进行检测。 结果 江苏省分离的O157∶H7菌株毒力基因携带率为56.5%，不同地区的分离株携带率有所不同，个别地区高达90%以上，有的地区则未检测到带毒力基因的菌株，这一结果与不同地区发病率的高低有平行的关系。疾病高发地区,菌株毒力基因携带率达85.7%(36/42)，低发或散发地区为52.6%(10/19)，非流行地区为8.3%(2/24)。不同的宿主动物分离株其毒力基因携带阳性率从高到低依次为羊>牛>猪>鸡。仅有的一份兔粪便标本分离株也检出毒力基因。菌株毒力基因图谱以SLT2+eaeA+hly为主，占79.2%，其次为SLT2+SLT1+eaeA+hly和SLT2+hly，分别占16.6%和4.2%；有毒力基因的菌株均有hly和SLT2，绝大多数菌株有eaeA基因，携带SLT1的菌株则较少，这与国外一些报道有所不同。 结论 O157∶H7 毒力基因图谱是一个重要的分子流行病学标志，应用多重引物PCR方法检测O157∶H7 毒力基因，简便、快速、特异、敏感，对流行病学调查分析、制定预防和控制对策有重要的参考价值。
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关键词：肠出血性大肠杆菌；基因；聚合酶链反应
大肠杆菌O157∶H7是肠出血性大肠杆菌(EHEC)的一种主要血清型，可引起人类腹泻、出血性结肠炎(HC)，在儿童和老年患者中易并发溶血性尿毒综合症(HUS)[1]。1982年O157∶H7大肠杆菌首次在美国引起了出血性肠炎的暴发[2]。1996年在日本发生了O157∶H7大肠杆菌的暴发流行，9 000多名儿童感染，死亡12例[3]。目前世界上许多发达国家和一部分发展中国家都发生了O157∶H7大肠杆菌的暴发流行，成为全球性的公共卫生问题。出血性大肠杆菌的致病作用主要是通过细菌对肠道上皮细胞粘附和产生毒素两个过程。其主要毒力基因有志贺样毒素(SLT1和SLT2)基因、“粘附抹平”因子eaeA基因和溶血素(hly)基因[4]。本研究应用一种能同时检测这4种基因的多重引物聚合酶链反应(MPCR)方法，对分离自江苏省6个不同地区不同宿主动物的O157∶H7菌株进行了毒力基因测定，现将结果报告如下。
, 百拇医药
材料与方法
1.参考菌株：E.coli O157∶H7 882364菌株,由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所惠赠；普通大肠杆菌ATCC25922，由本站菌种室提供。
2.试验菌株：1999年度从江苏省6个监测点分离的经生化和血清学鉴定为O157∶H7的菌株85株。
3.试剂：TaqDNA聚合酶、dNTPs、Buffer、PCR Marker等购自上海复华和华美公司。
4.引物：引物序列见表1，由上海生工生物工程公司合成。
表1 引物序列及扩增片段长度
引物
引物序列
, 百拇医药
扩增片段
长度(bp)
SLT2-F[5]
5′-CCATGACAACGGACAGCAGTT
779
SLT2-R
5′-CCTGTCAACTGAGCACTTTG
SLT1-F[5]
5′-ACACTGGATGATCTCAGTGG
614
, 百拇医药
SLT1-R
5′-CTGAATCCCCCTCCATTATG
eaeA-F[5]
5′-AAGCGACTGAGGTCACT
450
eaeA-R
5′ -ACGCTGCTCACTAGATGT
hly-F[6]
5′-CACACGGAGCTTATAATATTCTGTCA
340
, 百拇医药
hly-R
5′-AATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT
5.模板制备：将分离的菌株在普通营养琼脂上37℃培养18～24 h，刮取2～3个菌落于200 μl灭菌生理盐水中混匀，煮沸10～15 min，直接用于PCR扩增。
6.多重引物PCR方法：反应总体积为50 μl ,在0.5 ml离心管中依次加入：10×Buffer 5 μl, dNTPs(每种dNTP溶液浓度为0.2 mmol/L)4 μl，引物计8条，每条1.5 μl(10 pmol/μl)，Taq酶0.5 μl (1 U)，DEPC处理的双蒸水26.5 μl, 模板2 μl，石蜡油50 μl。以参考菌株882364作阳性对照，ATCC 25922作阴性对照，DEPC处理的双蒸水作试剂空白对照。反应程序：94℃ 7 min，变性模板DNA，然后94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸5 min。
, 百拇医药
7.PCR产物检测：PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，分子量100～1 000 bp的Marker作参照，在紫外灯下观察实验结果。结 果
1.用4对引物进行多重引物PCR反应，阳性对照882364有4种毒力基因(SLT2+SLT1+eaeA+hly)，而ATCC25922和试剂空白对照均为阴性结果。
2.不同地区分离菌株毒力基因图谱及毒力基因携带率见表2。
表2 不同地区分离菌株毒力基因图谱及
毒力基因携带率
地区类型
地
区
, http://www.100md.com
检测
数
未检
出
SLT2+
hly
SLT2+
eaeA+hly
SLT2+SLT1
+eaeA+hly
携带率
(%)
, http://www.100md.com
高发区
A
21
2
12
7
90.5
B
21
4
17
81.0
低发区
C
, 百拇医药
7
2
2
3
71.4
D
12
7
4
1
41.7
非流行区
E
11
, http://www.100md.com
9
2
18.2
F
13
13
0.0
合计
85
37
2
38
8
56.5
, 百拇医药
3.不同宿主动物分离菌株毒力基因图谱及毒力基因携带率见表3。
4.检出毒力基因的48株菌株均携带SLT2、hly毒力基因, 携带eaeA基因菌株46株,占95.8%，携带SLT1基因菌株8株,占16.6%。毒力基因图谱见表4。表3 不同宿主动物分离菌株毒力基因图谱及
毒力基因携带率
动物
种类
检测
数
未检
出
SLT2+
, 百拇医药
hly
SLT2+
eaeA+hly
SLT2+SLT1
+eaeA+hly
携带率
(%)
牛
24
11
12
1
, 百拇医药
54.2
羊
23
4
1
14
4
82.6
猪
18
10
1
5
2
, 百拇医药
44.4
鸡
19
12
6
1
36.8
兔
1
1
100.0
合计
85
37
, 百拇医药
2
38
8
56.5
讨 论
综合分析检测结果，我省分离的菌株毒力基因携带率为56.5%，不同地区的分离株携带率有所不同，个别地区高达90%以上，有的地区则未检测到带毒力基因的菌株，这一结果与不同地区发病率的高低有平行的关系。疾病高发地区,菌株毒力基因携带率达85.7%(36/42)，低发或散发地区为52.6%(10/19)，疑似或非流行地区为8.3%(2/24)。
表4 携带毒力基因菌株的毒力基因图谱
毒力基因
菌株数
, 百拇医药
构成比(%)
SLT2+hly
2
4.2
SLT2+eaeA+hly
38
79.2
SLT2+SLT1+eaeA+hly
8
16.6
合 计
, 百拇医药 48
100.0
不同的宿主动物分离株其毒力基因携带阳性率从高到低依次为羊>牛>猪>鸡。仅有的一份兔粪便标本分离株也检出毒力基因。
我省分离的菌株毒力基因图谱以SLT2+eaeA+hly为主，占79.2%，其次为SLT2+SLT1+eaeA+hly和SLT2+hly，分别占16.6%和4.2%；有毒力基因的菌株均有hly和SLT2，绝大多数菌株有eaeA基因，携带SLT1的菌株则较少，这与国外一些报道有所不同。Fagan等[7]报道澳大利亚用MPCR方法检测动物粪便中EHEC毒力基因，SLT1和hly最为多见，在检出毒力基因的标本中，SLT2 阳性率不足10%，eaeA的阳性率低于30%。其毒力基因图谱呈多样性，47.8%的标本仅检出hly基因。
, 百拇医药
虽然O157∶H7的致病机理尚未完全阐明，但其产生的毒素在疾病的发展过程中起着重要的作用。有文献报道，SLT2阳性菌株能引起更加严重的症状和组织病理学改变[8]。
O157∶H7感染已成为世界性的卫生问题，随着生物技术的不断发展，对其毒力因子的研究也在不断地深入。流行病学调查结果表明，家养动物，特别是牛、羊、猪等家畜是O157∶H7的主要贮存宿主，因此，O157∶H7感染的预防和控制应从贮存宿主的管理入手。结合简便、快速、特异、敏感的分子生物学的方法对各监测点分离的菌株进行毒力基因的检测，对流行病学调查分析、制定预防和控制疾病暴发流行的对策有重要的参考价值。
作者单位：郭喜玲(江苏省卫生防疫站，南京，210009)
史智扬(江苏省卫生防疫站，南京，210009)
顾玲(江苏省卫生防疫站，南京，210009)
, 百拇医药
庄菱(江苏省卫生防疫站，南京，210009)
潘浩(江苏省卫生防疫站，南京，210009)
参考文献
1，Neill MA, Tarr PI, Clausen CR, et al. Escherichia coli O157∶H7 as the predominant pathogen associated with the hemolytic uremic syndrome∶ a prospective study in the Pacific Northwest. Pediatrics,1987, 80∶37-40.
2，Wells JG, Davis BR, Wachsmuth IK, et al. Laboratory investigation of hemorrhagic colitis outbreaks associated with a rare Escherichia coli serotype. J Clin Microbiol, 1983,18∶512-520.
, http://www.100md.com
3，Reilly. A prevention and control of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infections: memorandum from a WHO meeting. WHO consultation on prevention and control of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infections. Bull World Health Organ, 1998,76∶245-255.
4，Boerlin P, McEwen SA, Boerlin PF, et al. Associations between virulence factors of Shiga toxin-producing Escherichia coli and disease in humans. J Clin Microbiol, 1999,37∶497-503.
, 百拇医药
5，Louie M,Read S,Simor AE, et al. Application of multiplex PCR for detection of non-O157 verocytotoxin-producing Escherichia coli in bloody stools∶ identification of serogroups O26 and O111. J Clin Microbiol, 1998, 36∶3375-3377.
6，Bonnet R, Souweine B, Gauthier G, et al. Non-O157∶H7 stx2-producing Escherichia coli strains associated with sporadic cases of hemolytic-uremic syndrome in adults. J Clin Microbiol, 1998, 36∶1777-1780.
, 百拇医药 7，Fagan PK, Hornitzky MA, Bettelheim KA, et al. Detection of shiga-like toxin (stx1 and stx2), intimin (eaeA), and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) hemolysin (EHEC hlyA) genes in animal feces by multiplex PCR. Appl Environ Microbiol, 1999, 65∶868-872.
8，Karpman D, Connell H, Svensson M, et al. The role of lipopolysaccharide and Shiga-like toxin in a mouse model of Escherichia coli O157∶H7 infection. J Infect Dis, 1997,175∶611-620., 百拇医药