上海地区大肠杆菌O157流行病学初步调查
上海地区大肠杆菌O157流行病学初步调查
卢林耿 俞顺章 张幼辰 卫国荣
关键词：大肠杆菌O157；流行病学 大肠杆菌O157(Escherichia coli O157,E.coli O157)是一种新型的致病性大肠杆菌，能引起人类出血性腹泻和溶血性尿毒综合症。其感染已成为世界性公共卫生问题。在美国、加拿大、英国和日本等发达国家，都发生过E.coli O157的暴发流行；我国也有E.coli O157感染病例。
流行病学调查表明牛肉、牛奶、水和羊肉等是传播E.coli O157的主要载体。在北美，牛肉中检出E.coli O157的比例是0%～3.7%[1]，西班牙为5.1%[2]。25份来自于马来西亚的牛肉中的9份分离到12株E.coli O157[3]。为了解上海地区E.coli O157流行情况，本文进行了初步调查。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.标本来源：1997年7月至1998年6月，采集103份牛肉、34份牛奶、105份猪肉、50份污水、73份羊肉、133份腹泻儿童患者粪便。
2.菌株：E.coli O157(882364，VT-)，E.coli O157(933w/o，VT+)和E.coli ATCC 35218。
3.E.coli O157的分离和鉴定：25 g或ml均质检样置于225 ml新生霉素(0.002%)mEC增菌液，于37℃振荡培养6 h。取1 ml增菌液，20 μl抗E.coli O157免疫磁珠(挪威 Dynal公司)混合，捕获靶细菌、沉淀，用PBS(pH 7.4)-Tween(0.000 5%)缓冲液洗涤。用80 μl洗涤缓冲液悬浮免疫磁珠复合物，均分为两份，涂布于CT-SMAC，37℃培养18～20 h。乳白色可疑菌落接种于Chromagar○ R O157琼脂平板，37℃培养20 h。紫红色菌落等分别接种在2支装有2 ml PBS(pH 7.4)试管中，并分别加入MUG和G试纸条，37℃振荡培养1～3 h，于365 nm紫外灯下观察荧光。G试纸条荧光阳性、MUG试纸条荧光阴性的菌落进行抗O157血清凝集试验。O157阳性菌落用Vitek自动生化检测系统进行生化检测，进一步证实。
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4.PCR检测VT(verotoxin)基因：挑O157阳性菌落于装有100～200 μl双蒸水的Eppendorf管中，煮沸提取DNA模板。PCR反应体系由200 μmol/L dTNPs、200 pmol MK1(5′-TTTACGAT
AGACTTCTCGAC-3′)和MK2(5′-CACATATAAATTATTTCGCTC-3′)、1×PCR缓冲液(50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Tris-HCl,pH8.3)和5 μl模板DNA组成。用10～20 μl石蜡油封盖PCR反应体系。94℃变性5 min后，加2.0 U的Taq酶于管底部，混匀。95℃变性30 s、47℃退火1 min、72℃延伸1.5 min，循环扩增35次。循环结束后，于72℃延伸10 min，4℃保存。用含有溴化乙锭的2% agarose凝胶，在TAE缓冲液中电泳检测扩增产物。
二、结果
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1.标本中E.coli O157的带菌率：103份牛肉中，4份检出E.coli O157，带菌率为3.9%。其他样品未分离到阳性菌。
2.E.coli O157分离株VT基因的检测：分离出的4株O157经PCR扩增检测，VT基因阳性，其条带为224 bp。
3.E.coli O157分离株的生化特征：Vitek自动生化仪检测4株E.coli O157，3株为尿素阳性，1株为尿素阴性，而其他生化指标符合O157的特征。O157分离株的MUG试纸条试验阴性，G试纸条试验阳性。
三、讨论
用本所建立的一套快速检测E.coli O157的方法从上海地区牛肉中分离到4株E.coli O157，菌株带VT基因。首次证实上海地区存在O157散发菌株，牛肉带菌率与国外近似，或稍低于同类食品的带菌率[1-3]。未在猪肉、羊肉、牛奶和污水检样中分离到E.coli O157。
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在133份儿童腹泻患者粪便中未分离到E.coli O157，这可能是由于：(1)检测粪便样本数还不够大；(2)在腹泻发病开始阶段，就服用了抗生素，粪便中残留的抗生素可能影响了E.coli O157；(3)我国居民饮食习惯为吃熟食，与国外不同。
E.coli的尿素酶一般是阴性，亦可发生变异。Hayes等[4]人报道了一株尿素酶呈阳性的E.coli O157(G501)。本次分离的4株E.coli O157，3株为尿素酶阳性，结果与其他报道一致。
作者单位：卢林耿(上海中医药大学预防医学教研室 200032)
俞顺章(上海医科大学预防医学研究所)
张幼辰(上海医科大学预防医学研究所)
卫国荣(上海医科大学预防医学研究所)
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参考文献
1，Armstrong GL,Hollingsworth J, Morris Jr JG,et al. Emerging foodborne pathogens:Escherichia coli O157∶H7 as a model of entry of a new pathogen in to the food supply of the developed world.Epidemiol Rev,1996,18∶29-51.
2，Blanco JE,Blanco M, Mora A, et al.Detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7 in minced beef using immunomagnetic separation. Microbiol,1996,12∶385-394.
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3，Radu S, Mutalib SA, Rusul G, et al. Detection of Escherichia coli O157∶H7 in the beef marketed in Malaysia. Appl Environ Microbiol,1998,64∶1153-1156.
4，Hayes PS,Blom K, Feng P,et al.Isolation and characterization of a β-D-glucuronidase-producing strain of Escherichia coli serotype O157∶H7 in the United State. J Clin Microbiol,1995,33∶3347-3348., 百拇医药
卢林耿 俞顺章 张幼辰 卫国荣
关键词：大肠杆菌O157；流行病学 大肠杆菌O157(Escherichia coli O157,E.coli O157)是一种新型的致病性大肠杆菌，能引起人类出血性腹泻和溶血性尿毒综合症。其感染已成为世界性公共卫生问题。在美国、加拿大、英国和日本等发达国家，都发生过E.coli O157的暴发流行；我国也有E.coli O157感染病例。
流行病学调查表明牛肉、牛奶、水和羊肉等是传播E.coli O157的主要载体。在北美，牛肉中检出E.coli O157的比例是0%～3.7%[1]，西班牙为5.1%[2]。25份来自于马来西亚的牛肉中的9份分离到12株E.coli O157[3]。为了解上海地区E.coli O157流行情况，本文进行了初步调查。
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一、材料与方法
1.标本来源：1997年7月至1998年6月，采集103份牛肉、34份牛奶、105份猪肉、50份污水、73份羊肉、133份腹泻儿童患者粪便。
2.菌株：E.coli O157(882364，VT-)，E.coli O157(933w/o，VT+)和E.coli ATCC 35218。
3.E.coli O157的分离和鉴定：25 g或ml均质检样置于225 ml新生霉素(0.002%)mEC增菌液，于37℃振荡培养6 h。取1 ml增菌液，20 μl抗E.coli O157免疫磁珠(挪威 Dynal公司)混合，捕获靶细菌、沉淀，用PBS(pH 7.4)-Tween(0.000 5%)缓冲液洗涤。用80 μl洗涤缓冲液悬浮免疫磁珠复合物，均分为两份，涂布于CT-SMAC，37℃培养18～20 h。乳白色可疑菌落接种于Chromagar○ R O157琼脂平板，37℃培养20 h。紫红色菌落等分别接种在2支装有2 ml PBS(pH 7.4)试管中，并分别加入MUG和G试纸条，37℃振荡培养1～3 h，于365 nm紫外灯下观察荧光。G试纸条荧光阳性、MUG试纸条荧光阴性的菌落进行抗O157血清凝集试验。O157阳性菌落用Vitek自动生化检测系统进行生化检测，进一步证实。
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4.PCR检测VT(verotoxin)基因：挑O157阳性菌落于装有100～200 μl双蒸水的Eppendorf管中，煮沸提取DNA模板。PCR反应体系由200 μmol/L dTNPs、200 pmol MK1(5′-TTTACGAT
AGACTTCTCGAC-3′)和MK2(5′-CACATATAAATTATTTCGCTC-3′)、1×PCR缓冲液(50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Tris-HCl,pH8.3)和5 μl模板DNA组成。用10～20 μl石蜡油封盖PCR反应体系。94℃变性5 min后，加2.0 U的Taq酶于管底部，混匀。95℃变性30 s、47℃退火1 min、72℃延伸1.5 min，循环扩增35次。循环结束后，于72℃延伸10 min，4℃保存。用含有溴化乙锭的2% agarose凝胶，在TAE缓冲液中电泳检测扩增产物。
二、结果
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1.标本中E.coli O157的带菌率：103份牛肉中，4份检出E.coli O157，带菌率为3.9%。其他样品未分离到阳性菌。
2.E.coli O157分离株VT基因的检测：分离出的4株O157经PCR扩增检测，VT基因阳性，其条带为224 bp。
3.E.coli O157分离株的生化特征：Vitek自动生化仪检测4株E.coli O157，3株为尿素阳性，1株为尿素阴性，而其他生化指标符合O157的特征。O157分离株的MUG试纸条试验阴性，G试纸条试验阳性。
三、讨论
用本所建立的一套快速检测E.coli O157的方法从上海地区牛肉中分离到4株E.coli O157，菌株带VT基因。首次证实上海地区存在O157散发菌株，牛肉带菌率与国外近似，或稍低于同类食品的带菌率[1-3]。未在猪肉、羊肉、牛奶和污水检样中分离到E.coli O157。
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在133份儿童腹泻患者粪便中未分离到E.coli O157，这可能是由于：(1)检测粪便样本数还不够大；(2)在腹泻发病开始阶段，就服用了抗生素，粪便中残留的抗生素可能影响了E.coli O157；(3)我国居民饮食习惯为吃熟食，与国外不同。
E.coli的尿素酶一般是阴性，亦可发生变异。Hayes等[4]人报道了一株尿素酶呈阳性的E.coli O157(G501)。本次分离的4株E.coli O157，3株为尿素酶阳性，结果与其他报道一致。
作者单位：卢林耿(上海中医药大学预防医学教研室 200032)
俞顺章(上海医科大学预防医学研究所)
张幼辰(上海医科大学预防医学研究所)
卫国荣(上海医科大学预防医学研究所)
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参考文献
1，Armstrong GL,Hollingsworth J, Morris Jr JG,et al. Emerging foodborne pathogens:Escherichia coli O157∶H7 as a model of entry of a new pathogen in to the food supply of the developed world.Epidemiol Rev,1996,18∶29-51.
2，Blanco JE,Blanco M, Mora A, et al.Detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7 in minced beef using immunomagnetic separation. Microbiol,1996,12∶385-394.
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3，Radu S, Mutalib SA, Rusul G, et al. Detection of Escherichia coli O157∶H7 in the beef marketed in Malaysia. Appl Environ Microbiol,1998,64∶1153-1156.
4，Hayes PS,Blom K, Feng P,et al.Isolation and characterization of a β-D-glucuronidase-producing strain of Escherichia coli serotype O157∶H7 in the United State. J Clin Microbiol,1995,33∶3347-3348., 百拇医药